Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genetisk variantdetektering i CALR-genet ved hjælp af smeltningsanalyse med høj opløsning

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Hematology, University Medical Centre Ljubljana, 2Clinical Institute for Genomic Medicine, University Medical Centre Ljubljana, 3Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

Høj opløsning smelteanalyse (HRM) er en følsom og hurtig løsning til genetisk variant afsløring. Det afhænger af sekvensforskelle, der resulterer i, at heterodplexer ændrer smeltekurvens form. Ved kæmning HRM og agarose gel elektroforese, forskellige typer af genetiske varianter såsom indels kan identificeres.

Abstract

Høj opløsning smelteanalyse (HRM) er en kraftfuld metode til genotyping og genetisk variation scanning. De fleste HRM-applikationer er afhængige af mættende DNA-farvestoffer, der registrerer sekvensforskelle, og heterodoplekter, der ændrer formen på smeltekurven. Fremragende instrumentopløsning og speciel dataanalysesoftware er nødvendig for at identificere de små smeltekurveforskelle, der identificerer en variant eller genotype. Forskellige typer af genetiske varianter med forskellige frekvenser kan observeres i genet, der er specifikke for patienter med en bestemt sygdom, især kræft og i CALR-genet hos patienter med Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasmer. Enkelte nukleotidændringer, indsættelser og/eller sletninger (indels) i interessegen kan detekteres ved HRM-analysen. Identifikationen af forskellige typer genetiske varianter er for det meste baseret på de kontroller, der anvendes i qPCR HRM-analysen. Men efterhånden som produktlængden øges, bliver forskellen mellem vilde og heterozygote kurver mindre, og typen af genetisk variant er vanskeligere at bestemme. Derfor, hvor indels er den fremherskende genetiske variant forventes i genet af interesse, en ekstra metode såsom agarose gel elektroforese kan anvendes til afklaring af HRM resultat. I nogle tilfælde skal et usikkert resultat re-kontrolleres / re-diagnosticeret af standard Sanger sekventering. I denne retrospektive undersøgelse anvendte vi metoden på JAK2 V617F-negative patienter med MPN.

Introduction

Somatiske genetiske varianter i calreticulingen (CALR) blev anerkendt i 2013 hos patienter med myeloproliferative neoplasmer (MPN) såsom essentiel trombocythemia og primær myelofibrosis1,2. Siden da er mere end 50 genetiske varianter i CALR-genet blevet opdaget, hvilket fremkalder et +1 (−1+2) frameshift3. De to hyppigste CALR genetiske varianter er en 52 bp sletning (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs *46)), også kaldet type 1 mutation, og en 5 bp indsættelse (NM_004343,3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, s.(Lys385Asnfs *47)), også kaldet type 2 mutation. Disse to genetiske varianter repræsenterer 80% af alle CALR genetiske varianter. De andre er blevet klassificeret som type 1-lignende eller type 2-lignende ved hjælp af algoritmer baseret på bevarelsen af en α helix tæt på vilde type CALR4. Her præsenterer vi en af de meget følsomme og hurtige metoder til CALR genetisk variantdetektering, smelteanalysemetoden med høj opløsning (HRM). Denne metode muliggør hurtig påvisning af genetiske varianter af type 1 og type 2, som repræsenterer størstedelen af CALR-mutationer 5. HRM blev indført i kombination med realtid »polymerase kædereaktion« (qPCR) i 1997 som et redskab til at opdage mutationen i faktor V Leiden6. I forhold til Sanger sekventering, der repræsenterer den gyldne standard teknik, HRM er en mere følsom og mindre specifik metode5. HRM-metoden er en god screeningsmetode, der muliggør en hurtig analyse af et stort antal prøver med en stor cost-benefit5. Det er en simpel PCR-metode udført i nærværelse af et fluorescerende farvestof og kræver ikke specifikke færdigheder. En anden fordel er, at selve proceduren ikke beskadiger eller ødelægger den analyserede prøve, der giver os mulighed for at genbruge prøven til elektroforese eller Sanger sekventering efter HRM-proceduren7. Den eneste ulempe er, at det nogle gange er vanskeligt at fortolke resultaterne. Derudover registrerer HRM ikke den nøjagtige mutation hos patienter med ikke-type 1- eller type 2-mutationer8. Hos disse patienter skal Sanger sekventering udføres (Figur 1).

HRM er baseret på forstærkning af den specifikke DNA-region i nærværelse af mættende DNA fluorescerende farvestof, som er indarbejdet i dobbeltstrenget DNA (dsDNA). Det fluorescerende farvestof udsender lys, når det er indarbejdet i dsDNA. Efter en gradvis temperaturstigning nedbrydes dsDNA i enkeltstrenget DNA, som kan påvises på smeltekurven som et pludseligt fald i fluorescensintensiteten. Formen af smeltekurven afhænger af den DNA-sekvens, der bruges til at opdage mutationen. Smeltekurver af prøver sammenlignes med smeltekurver af kendte mutationer eller vilde type CALR. Forskellige smeltekurver repræsenterer en anden mutation, der ikke er type 1 eller type 29.

Algoritmen til den somatiske genetiske variantdetektering i CALR-genet ved HRM, agarosegelelektroforese og sekventeringsmetode (Figur 1) blev anvendt og valideret i den retrospektive undersøgelse, der blev offentliggjort før10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt af Republikken Sloveniens Komité for Medicinsk Etik. Alle procedurer var i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.

1. Fluorescensbaseret kvantitativ pcr i realtid (qPCR) og post-qPCR-analyse foretaget af HRM

  1. Genanvendelige primere, der er anført i materialetabellen, til 100 μM med steril, RNase og DNasefri H2O (se materialetabel). Lav en 10 μM arbejdskoncentrationsgrunder. Primere, der anvendes i protokollen blev offentliggjort før2.
  2. Kvantificere granulocytter DNA ved fluorescens farvning metode efter fabrikantens instruktion11 (se Tabel over materialer). Der fremstilles en 20 ng/μL DNA-opløsning ved hjælp af 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9.0 (se Materialetabel).
    1. Ud over DNA-prøver skal der udarbejdes mindst tre DNA-kontroller: to positive kontroller med NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp deletion eller type 1 mutation) og NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, s.(Lys385Asnfs*47) (5 bp insertion eller type 2 mutation) genetisk variant samt vildt DNA og negativ kontrol som en ikke-skabelon (NTC) kontrol.
      BEMÆRK: Før du udfører HRM-opsætningen, skal du bekræfte, at qPCR-instrumentet er kalibreret til HRM-eksperimenter.
  3. Klargør qPCR HRM Master Mix i henhold til fabrikantens protokol (se Materialetabel) som følger: 10 μL på 2x qPCR Master Mix med farvestof, 0,2 μL på 10 μM Forward Primer, 0,2 μL på 10 μM Reverse Primer, 8,6 μL steril, RNase og DNase fri H2O. Brug primerne fra materialetabellen. Kør tre kopier for hver DNA-prøve og kontrol.
    1. Forbered qPCR HRM Master Mix i henhold til antallet af prøver, der behandles. Medtag overskydende volumen på mindst 10 % i beregningerne for at give overskydende volumen for det tab, der opstår under overførsel af reagens.
  4. Bland reaktionsindholdet ved forsigtigt at trykke og invertere røret og hvirvle i 2-3 s. Saml alle de spredte dråber fra rørets væg til bunden med et kort spin.
  5. Forbered en reaktionsplade, der passer til instrumentet og HRM-eksperimentet (se Materialetabel). Overfør 19 μL af qPCR HRM Master Mix til de relevante brønde på den 96-brønd optiske reaktionsplade.
  6. Pipet 1 μL af de negative kontroller, positive kontroller og prøver i de relevante brønde af den optiske reaktionsplade. Til NTC overføres 1 μL steril, RNase og DNase fri H2O, der bruges til fremstilling af qPCR HRM Master Mix i stedet for DNA.
  7. Forsegl reaktionspladen med den optiske klæbefilm. Gør det fast for at forhindre fordampning under kørslen. Kontroller, at den optiske klæbefilm er plan på tværs af alle brønde i reaktionspladen for at sikre korrekt fluorescensdetektering.
  8. Drej reaktionspladen ved 780 x g ved stuetemperatur (RT) i 1 minut. Kontroller, at væsken er i bunden af brøndene i reaktionspladen. Fortsæt med at køre analysen.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Pladen opbevares ved 4 °C i højst 24 timer. Lad pladen opbevares ved 4 °C at varme til RT, og drej derefter pladen kort, før den kører den.
  9. Ifølge producentens instruktion forberede og starte køre for at forstærke og smelte DNA og til at generere HRM fluorescens data i qPCR instrument. I instrumentsystemet software, tildele kontrol og prøver til de relevante brønde.
  10. For calr genetisk variant detektion, ændre standard instrumentforstærkning protokol og forstærke DNA ved hjælp af følgende termiske cykling protokol: 95 °C i 10 minutter, efterfulgt af 50 cyklusser af 95 °C for 10 s og 62,5 °C for 60 s.
  11. Udfør smeltekurve/dissociation (HRM) umiddelbart efter qPCR i henhold til fabrikantens anvisninger12 som følger: 95 °C i 10 s, 60 °C i 1 min og derefter en rampehastighed på 0,025 °C/s indtil 95 °C. Hold temperaturen ved 95 °C i 15 s og ved 60 °C i 15 s.
  12. Kørslen afsluttes automatisk. Først skal forstærkningsplottet gennemgås og kontrolleres (figur 2).
  13. Vælg indstillingen for forstærkning af plottet i eksperimentmenuen i instrumentsystemsoftwaren. Hvis der ikke vises data, skal du klikke på den grønne knap Analysér.
    1. Vælg det plot, der viser forstærkningsdataene, i rullemenuen plottypen under fanen forstærkning af afbildninger som de rå fluorescensaflæsninger, der normaliseres til fluorescensen fra den passive reference (ΔRn) som en funktion af cyklusnummer (ΔRn vs. cyklus). Vælg Eksempeli rullemenuen Plotfarve .
  14. Vælg den lineære forstærkningsgraftype i rullemenuen med graftypen. Vis start- og slutcyklussen for grundlinjen på den lineære forstærkningsgraf ved at vælge indstillingen oprindelig startdato. Kontroller, at den oprindelige plan er angivet korrekt. Slutcyklussen skal indstilles et par cyklusser før cyklusnummeret, hvor der registreres signifikant fluorescerende signal. Basislinjen er normalt indstillet fra 3 til 15 cyklusser (Figur 2).
  15. Vælg log10-forstærkningsdiagramtypen i rullemenuen diagramtype for diagramtypen. Vis tærskellinjen på grafen ved at vælge tærskelindstillingen. Juster tærsklen i overensstemmelse hermed, hvis den ikke er indstillet korrekt. Den korrekt indstillede tærskel betyder, at tærskellinjen krydser den eksponentielle fase af qPCR-kurverne (Figur 2).
  16. Kontroller, at normale forstærkningskurver er i alle prøve- og positive kontroltj brønde. Kontroller, at der ikke er nogen forstærkning i NTC-brøndene før cyklus 40. Et normalt forstærkningsplot viser en eksponentiel stigning i fluorescens, der overstiger tærsklen mellem cyklusserne 15 og 35 (figur 2). Ekskluder prøvetjerne fra analysen, hvis der ikke er nogen forstærkning i brøndpositionen.
    BEMÆRK: Hvis forstærkningsplottet ser unormalt ud, eller NTC-brønden angiver forstærkningen, skal du identificere og løse problemet i henhold til producentens fejlfindingsvejledning.
  17. Udeluk afvigelsen med den kvantificeringscyklusværdi (Cq), der adskiller sig fra replikeringer med mere end 2 i instrumentsystemsoftwaren12. Outliers kan producere fejlagtige HRM-resultater.
  18. I de afledte smeltekurver gennemgås præ- og post-smelteregionerne / temperaturlinjerne. Præ- og postsmeltningsregionerne bør ligge inden for et fladt område, hvor der ikke er store toppe eller skråninger i fluorescerende niveauer (figur 3). Hvis det er nødvendigt justere det i overensstemmelse hermed. Start og stop af temperaturlinjerne før og eftersmeltningen er ca. 0,5 °C fra hinanden (figur 3). Genstart analysen, hvis parametrene justeres, ved at klikke på knappen Analyser.
  19. Under fanen forskelsplot under fanen plotindstillinger skal du vælge en af de vilde kontrolelementer (homozygote) replikerer som reference-DNA og genstarte analysen ved at klikke på knappen Analyser.
  20. Under fanen justerede smeltekurver skal du bekræfte, at alle positive kontrolelementer har den korrekte genotype, og NTC kunne ikke forstærkes (Figur 4). Fra brøndtabellen skal du vælge de brønde, der indeholder en positiv kontrol, for at fremhæve den tilsvarende smeltekurve i analyseplottet. Bekræft, at farven på linjen svarer til den korrekte genotype. Gentag trin for brønde, der indeholder de andre positive kontroller og NTC.
  21. Under fanen justerede smeltekurver skal du omhyggeligt gennemse plotvisningerne for de ukendte prøver og sammenligne dem med plotvisningerne for kontrolelementer (Figur 4). Fra brøndtabellen skal du vælge de brønde, der indeholder de ukendte prøve replikerer, kontrollere farven på smeltekurven og justere dem med kontrollerne i en ordnet rækkefølge ved at vælge brøndene, der indeholder positive kontroller en efter en. Gentag processen for alle de ukendte prøver.
    BEMÆRK: Den ukendte prøve indeholder varianten af en af kontrolelementerne, hvis smeltekurven er tæt justeret efter den. Der kan vises forskellige variantgrupper (forskellige farver), der angiver, at den ukendte prøve består af en ukendt variant, der ikke svarer til kontrolelementerne (Figur 8). Et lavt niveau af den somatiske genetiske variant kan være til stede i patientens prøve. Dette kan påvirke fortolkningen af HRM-resultatet, navnlig ved påvisningsgrænsen for analysen (figur 9). I disse tilfælde kan farven eller endda formen på linjen ligne den vilde genotypes.
    1. Når resultatet er usikkert, kombinere HRM resultater med resultaterne af agarose gel elektroforese og sekventering metoder. Test eksemplet eller anmodningen igen, og test et nyt eksempel igen, hvis det er nødvendigt.
    2. Gennemgå omhyggeligt datasættet for replikeringskurver, og kontroller, at justeringen af hver replikation i gruppen er stram. Udeluk replikationen, hvis den ikke flugter tæt med de andre prøver i gruppen (outlier). Test prøven igen, hvis der er flere afvigelser til stede, og resultaterne ikke er entydige. Vær opmærksom på, at mængden og kvaliteten af DNA-prøven påvirker HRM-resultaterne.
  22. Analyser resultatet for den ukendte prøve under fanen Forskelsplot. Gentag den procedure, der er beskrevet i trin 1.21, og kontroller, at de resultater, der er opnået for den ukendte prøve, er de samme.
  23. Kør derefter qPCR HRM-produkterne på agarosegelen.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Pladen opbevares ved 4 °C i højst 24 timer eller ved -20 °C i længere tid, men højst 7 dage. Lad pladen opbevares ved 4 °C at varme til RT, og drej derefter pladen kort, før den kører den. Lad pladen opbevares ved - 20 °C at tø op og varme til RT, og drej derefter pladen kort, før den kører den.

2. Agarose gel elektroforese

  1. Kør qPCR HRM-produkter på en 4 % agaroseforstøbt gel, der indeholder en fluorescerende nukleinsyreplet ved hjælp af det relevante gelelektroforesesystem (se Materialetabellen, Figur 5). Kør kun én positiv, negativ, NTC og eksempel qPCR HRM replika.
    BEMÆRK: Handsker skal altid bæres ved håndtering af geler. Enhver anden gel elektroforese system kan opfylde dette formål, hvis den tilsvarende agarose procent, fluorescerende nukleinsyre plet og godt format er valgt.
  2. Kør gelelektroforesesystemet i henhold til producentens protokol (se Materialetabel). Fjern den præstøbte gel i kassetten fra pakken, fjern kammen og sæt den i apparatet i overensstemmelse med producentens anvisninger (se Materialetabel).
    BEMÆRK: Læg gelen inden for 15 minutter efter åbning af pakken.
  3. Fortynd en 10 μL-prøve til 20 μL med steril, RNase og DNase fri H2O. Læg hver brønd med 20 μL fortyndet prøve.
  4. Fortynd 3 μL DNA-størrelse standardopløsning til 20 μL med steril, RNase og DNase fri H2O (se Materialetabel). Læg M-brønden med 20 μL fortyndet DNA-størrelse standardopløsning (Figur 6).
  5. Fyld eventuelle tomme brønde med 20 μL sterile, RNase og DNase fri H2O.
  6. Vælg straks programmet i henhold til procentdelen af gelen, der køres, og indstil køretiden på apparatet til 10 minutter.
  7. Start elektroforesen inden for 1 minut efter belastningsprøven ved at trykke på GO-knappen. Elektroforesetiden kan forlænges, hvis der opnås utilstrækkelig opløsning.
    BEMÆRK: Overskrider ikke den maksimale anbefalede agarose elektroforese køretid i henhold til producentens anvisninger.
  8. Når elektroforesen er afsluttet, visualisere DNA i gelen ved hjælp af et blåt lys eller UV transillumination. Visualisering, analyse og lagring af elektroforesebillederne udføres for det meste af en gelbilled med fotodokumentationssystem (Figur 5).
  9. Analysere og fortolke det visualiserede qPCR HRM-produktgelmønster ved at sammenligne resultaterne af den ukendte prøve med positive kontroller (Figur 7 og Figur 8).
  10. Hvis den ukendte prøve HRM- og gelelektroforeseresultater indikerer, at der findes en ukendt genetisk variant, skal qPCR HRM-produktet sekvenses ved hjælp af primere, der er beskrevet i Materialetabel i henhold til den beskrevne protokol13.
    FORSIGTIG: De agarosegeler, der indeholder en fluorescerende nukleinsyreplet, skal bortskaffes korrekt i henhold til institutionsforordningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den vellykkede DNA-region af interesse med en eksponentiel stigning i fluorescens, der overstiger tærsklen mellem cyklusser 15 og 35 og meget snævre værdier af kvantificeringscyklussen (Cq) i alle replikerede prøver og kontroller (figur 2), er en forudsætning for pålidelig identifikation af genetiske varianter ved HRM-analyse. Dette opnås ved at anvende en præcis bestemmelse af DNA med fluorescensfarvning og en lige stor mængde DNA i qPCR HRM-eksperimentet (se trin 1.2). Figur 2 viser en vellykket forstærkning af dna-området af interesse, hvor Cq-værdierne for alle prøver og kontroller er i et meget snævert interval. Der er ingen forstærkning i NTC brønde.

HRM-fasen udføres umiddelbart efter qPCR ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i trin 1.11. De aktive smelteområder (Figur 3, etiketter (c)) for prøverne, kontrolelementerne og NTC bruges til at oprette deres justerede smeltekurveplotter (Figur 4). Derfor er de korrekt indstillede præ- og post-smelteområder / temperaturlinjer (Figur 3A) vigtige for korrekt visualisering og identifikation af genetiske varianter i prøverne. Figur 4A og figur 4B viser henholdsvis de justerede smeltekurver og forskelsplotter, hvor identifikation af genetiske varianter er mulig. De ukendte prøver er tæt på en af de positive kontroller. Figur 3B viser forkert indstillede før- og eftersmeltningsområder/temperaturlinjer. Dette resulterer i en justeret smeltekurve og forskelsplotter, hvor korrekt identifikation af de genetiske varianter er vanskeligere (Figur 4C og Figur 4D).

For at bekræfte HRM-resultaterne og for at opdage, om der kræves standard eller næste generations sekventeringsmetode for at identificere den genetiske variant, der er til stede i prøven, anvendes agarosegelelektroforese. Figur 7 viser agarosegelelektroforesen af de samme prøver og kontroller, der vises i figur 4. Den genetiske variant i prøven kan identificeres ved at sammenligne prøvens båndmønster med kontrollerne og ved at kombinere HRM og agarose gel elektroforese. Den korrekte genetiske variantidentifikation kan dog kun foretages for de prøver, der indeholder den samme genetiske variant som en af de kontroller, der anvendes i HRM-analysen (Figur 7). Prøver, der indeholder sjældne CALR genetiske varianter, adskiller sig i HRM-resultatet og elektroforesebåndsmønsteret (Figur 8). I dette tilfælde bruges Sanger sekventering eller endda næste generations sekventeringsmetode til at identificere den nøjagtige genetiske variant.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af algoritmen for den somatiske genetiske variantdetektering i CALR-genet ved HRM, agarosegelelektroforese og sekventeringsmetoder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Forstærkning plot af qPCR HRM assay til påvisning af de genetiske varianter i CALR genet. Forstærkningsplottet vises som den rå fluorescens normaliseret til fluorescensen fra den passive reference (ΔRn) og som en funktion af et cyklusnummer. Baseline er indstillet fra 3 til 15 cyklusser, når DNA-regionen af interesse blev effektivt forstærket ved hjælp af 20 ng af høj kvalitet DNA i qPCR reaktion. De normale forstærkning plots af DNA-regionen af interesse for alle prøverne er vist som grønne linjer. Plots viser en eksponentiel stigning i fluorescens, der overstiger tærsklen mellem cyklusser 15 og 35 i eksperimentet ved hjælp af 20 ng af høj kvalitet DNA i qPCR reaktion. Grafen viser ingen forstærkning i de ikke-skabelon prøve brønde (NTC). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Afledte smeltekurver i qPCR HRM-analysen til påvisning af de genetiske varianter i CALR-genet.  A) Et eksempel på korrekt indstillede præ- og post-smelteområder/temperaturlinjer. Temperaturlinjen før smeltestop skal være ved siden af starten af smelteovergangsområdet. Starttemperaturlinjen efter smelten skal være ved siden af slutningen af smelteovergangsområdet. Etiketten a) angiver et par linjer til venstre for de toppe, hvor forsmeltningen starter, og stoptemperaturerne er indstillet. Hver amplicon er dobbeltstrenget. Etiketten (b) angiver datatoppene i det aktive smelteområde, der bruges til at oprette plottet justerede smeltekurver. (c) etiketten angiver et par linjer til højre for de toppe, hvor start- og stoptemperaturerne efter smelten er indstillet. Hver amplicon er enkeltstrenget. B) Et eksempel på forkert indstillede før- og post-smelteområder/temperaturlinjer. Start- og stop for temperaturlinjerne før og eftersmeltningen støder ikke op til smelteovergangsområderne og er mere end 0,5 °C fra hinanden. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: De justerede smeltekurver og forskelsplotter i qPCR HRM-analysen til påvisning af de genetiske varianter i CALR-genet.  A) og B) viser de justerede smeltekurver og forskelsarealer, efter at før- og postsmeltningsområderne/temperaturlinjerne er indstillet korrekt. A) De justerede smeltekurver for de positive kontroller med sletning af 52 bp (type 1-mutation), 5 bp-indsættelse (type 2-mutation) og en vildtype vises som henholdsvis orange, lilla og rød farve. B) Forskellen plot af de samme prøver som beskrevet i panel A. C) og D) viser de justerede smeltekurver og forskelsplotter efter de forkert indstillede for- og eftersmeltningsområder/temperaturlinjer for det samme sæt prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Gelelektroforesesystemet. A) De grundlæggende enheder i gelelektroforesesystemet (se Materialetabel). B) Gelbilled med fotodokumentationssystem bestående af et CCD-kamera, et kammer med passende trans-/lyslys og et fotografisk filter vises (se Materialetabel). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Ved at lægge gelen med fortyndede prøver og DNA-størrelse standardopløsning eller RNase og DNase fri H2O til tomme brønde. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Analyser af qPCR HRM-produkterne på gelelektroforese. Gelen blev udsat for UV-transilluminator. Billedet er taget af fotodokumentationssystemet (Figur 5B). Brønde fra 1 til 3 viser kontrol: 52 bp sletning (type 1 mutation), 5 bp indsættelse (type 2 mutation) og wild-type variant, henholdsvis. Båndet mønster af de ukendte prøver i brønde 4-10 angiver dem som den vilde-type genetiske variant. M brønden repræsenterer fortyndet DNA-størrelse standardopløsning (100 til 2.000 bp). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: HRM- og gelelektroforeseanalyser af de genetiske varianter i CALR-genet.  A) HRM-analyser. De justerede smeltekurver for de positive kontroller med sletning af 52 bp (type 1-mutation), 5 bp-indsættelse (type 2-mutation) og en vildtype vises som henholdsvis orange, lilla og rød farve. Den ukendte prøve med den forskellige genetiske variant er angivet som mørkeblå farve. B) Gel elektroforese analyser. Brønde fra 1 til 3 viser kontrol: 52 bp sletning (type 1 mutation), 5 bp indsættelse (type 2 mutation) og wild-type variant, henholdsvis. Båndmønsteret for den ukendte prøve i vognbane 9 angiver den forskellige genetiske variant som kontrol. Andre ukendte prøver er den vilde type variant. M brønden repræsenterer den fortyndede DNA-størrelse standardopløsning (100 til 2.000 bp). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Grænsen for påvisning af HRM-analyse. En seriel fortynding af en prøve af en 52 bp sletning (type 1 mutation) og 5 bp indsættelse (type 2 mutation) præsenteres viser en genetisk variant allel byrde på ca 50% i henhold til Sanger sekventering analyse og qPCR HRM assay i henhold til protokollen beskrevet i denne artikel. A) og B) viser de justerede smeltekurver og forskelsplotter for vilde og serielle fortyndinger af en sletning på 52 bp (type 1-mutation). C) og D) viser de justerede smeltekurver og forskelsplotter for vilde og serielle fortyndinger af en 5 bp-indsættelse (type 2-mutation). I begge tilfælde kan calr genetisk variant påvises i op til 1,56% fortynding. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Høj opløsning smeltning af DNA er en simpel løsning til genotyping og genetisk variant scanning14. Det afhænger af sekvensforskelle, der resulterer i heterodplexer, der ændrer formen på smeltekurven. Forskellige typer af genetiske varianter med forskellige frekvenser kan observeres i genet, der er specifikke for en bestemt gruppe patienter med kræft1,2,15,16,10. Sletninger eller indsættelser i genet af interesse kan detekteres ved HRM-analysen, som vi har vist i figur 4A. Ved implementeringen af qPCR HRM-analysen i den rutinemæssige test har vi udført en indledende evalueringsundersøgelse, herunder 21 JAK2 V617F-negative ET-patienter med en medianalder på 63 år (spænder fra 24 til 90 år). En genetisk variant i CALR-genet blev påvist hos 12 ud af 21 JAK2 V617F-negative ET-patienter (andel 0,57). En 52 bp sletning (type 1 mutation) blev påvist i 9 ud af 21 (andel 0,43), en 5 bp indsættelse (type 2 mutation) blev opdaget i 3 ud af 21 (andel 0,143) JAK2 V617F-negative ET patienter. Resultaterne er i overensstemmelse med data fra litteraturen1,2,17.

Pålidelig identifikation af genetiske varianter ved HRM-analyse kan opnås gennem den rette analyseudvikling, der sikrer, at eksperimentet er optimeret til HRM. Andre faktorer end sekvens kan være en kilde til små forskelle i HRM-kurverne som primerdesign, ampliconlængde, farvevalg, valg af qPCR HRM-reagens og temperatur- og tidsprofiler af qPCR HRM-trinene. Dette er den del af den meget tidlige udvikling og optimering af qPCR HRM assay og er allerede blevet drøftet andetsteds12,14,18. Der kan dog opnås pålidelig identifikation af genetiske varianter i CALR-genet med analysens sammenlignelige følsomhed på forskellige HRM-platforme ved hjælp af de samme primersekvenser19. Det mest kritiske punkt i optimeringsprocessen af qPCR HRM-analysen var optimering af smelte- og forlængelsestemperaturen i qPCR-trinet i qPCR HRM-analysen. Der var ikke behov for ændringer i HRM-trin12. I den rutinemæssige test bliver andre faktorer, der påvirker HRM-resultaterne, vigtigere at følge.

Dna af høj kvalitet, der er suspenderet igen i en lavsaltbuffer som TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA eller lavere koncentration) og den samme mængde DNA i qPCR HRM-analysen, er vigtige faktorer for en vellykket forstærket DNA-interesseregion med et højt signalplateau i qPCR-forstærkningsfasen (figur 2). Dette fører til pålidelig identifikation af genetiske varianter ved HRM-analyse (Figur 4A,4B)12,14. En saltbuffer med højt saltindhold, der anvendes til udløsning af DNA i ekstraktionsprotokollen, kan subtilt ændre termodynamikken i DNA-smelteovergangen. Nedbør og resuspension i lavsaltbuffer TE eller fortynding af prøven kan løse problemet med urenhederne i DNA-prøven. Lav kvalitet DNA kan producere uspecifikke PCR-produkter eller mislykkedes forstærkning. Alt dette kan resultere i en lavere reproducerbarhed og højere fejlprocent i HRM-variantregistrering. Yderligere optimering for de udfordrende prøver såsom DNA udvundet fra paraffin-indlejrede prøver kunne være nødvendig for at opnå et optimalt HRM resultat15.

Store forskelle i den DNA-mængde, der anvendes i qPCR HRM-analysen, kan påvirke den resulterende smeltetemperatur (Tm) og dermed føre til ufyldestgørende resultater. Derfor er den præcise bestemmelse af DNA-koncentration og fortynding af alle DNA-prøver obligatorisk20. Ultraviolet (UV) absorptions- og fluorescensfarvningsmetoder bestemmer nøjagtigt koncentrationerne af DNA-opløsninger af høj renhed21. UV-absorbansmetoden kan anvendes til at vurdere renheden af DNA-løsningerne ved at udføre ratioabsorberingsmålinger ved A260/A280 og A260/230. Den fluorescerende farvningsmetode er imidlertid mere følsom over for nedbrydning af DNA end UV-absorptionsmetoden og kan mere præcist bestemme DNA-koncentrationen21. Det er derfor mere hensigtsmæssigt at standardisere kvantificeringen og fortyndingen af alle DNA-prøver i HRM-analysen20,21.

Indels er de vigtigste genetiske varianter i CALR-genet observeret hos MPN-patienter1. Efterhånden som produktlængden ændres og øges, bliver forskellen mellem kurver af vildtype og heterozygot mindre, og variantdetektering bliver sværere7. Derfor bør der anvendes en yderligere metode til afklaring af en sådan genetisk variant.

Et godt eksempel er agarose gel elektroforese. Dette er en enkel og effektiv metode til at adskille DNA-fragmenter i forskellige størrelser22,23. DNA-molekyler er adskilt efter størrelse i agarose gel, således at den tilbagelagte afstand er omvendt proportional med logaritmen af sin molekylvægt24. Figur 4A, Figur 4B og Figur 7 viser eksempler, hvor de to mest almindelige typer calr genetisk variant, 52 bp sletning og 5 bp indsættelse, er identificeret ved at kombinere qPCR HRM og agarose gel elektroforese resultater. Men når HRM resultat og agarose gel elektroforese band mønster indikerer en anden genetisk variant (herunder enkelt nukleotid ændring) som i kontrollerne (Figur 8), Sanger sekventering er stadig nødvendig for at identificere den nøjagtige genetiske variant10.

Et lavt niveau af somatisk genetisk variant i CALR-genet kan være til stede i patientens prøve, hvilket gør en fortolkning af qPCR HRM, agarose gel elektroforese og Sanger sekventering resultater mere krævende, især ved påvisningsgrænsen for analysen (Figur 9). Enhver smeltekurve form linje forskellig fra den vilde type en angiver den genetiske variant at være til stede i prøven. Følsomheden af qPCR HRM-analysen er lavere end 5 % (figur 9 og reference19) og er mere følsom end Sanger-sekventeringsmetoden, hvis følsomhed blev rapporteret til at være 15-20 %19. I disse tilfælde kan den næste generation af dyb sekventeringsmetode, der registrerer større indels, anvendes og bekræfte HRM-resultatet. Afslutningsvis er HRM-analysen en kraftfuld metode til genotyping og genetisk variationsscanning af somatiske genetiske varianter i CALR-genet. Identifikationen af forskellige typer genetisk variant er for det meste baseret på de kontroller, der anvendes i qPCR HRM-analysen. Mere pålidelige resultater opnås ved at kombinere HRM-resultaterne med resultater fra agarosegelelektroforese. I tilfælde af ufyldestgørende resultater, standard Sanger sekventering eller endnu mere følsomme næste generation sekventering metode kan bruges til korrekt at identificere den genetiske variant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke alle de akademiske eksperter og medarbejdere på Specialized Hematology Laboratory, Institut for Hæmatologi, Division of Internal Medicine, University Medical Centre Ljubljana.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-Gel EX 4% Agarose Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific 4415440 Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4346907
MicroAmp Optical adhesive film Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4311971
NuGenius Syngene NG-1045 Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51306 DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32856
QUBIT dsDNA HS assay Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder Invitrogen, Thermo Fischer Scientific 10488058 Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4453534
Water nuclease free VWR, Life Science 436912C RNase, DNase and Protease free water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
  2. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
  3. Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
  4. Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
  5. Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
  6. Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
  7. Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
  8. Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
  9. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
  10. Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
  11. Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (last accessed 16 August 2020) (2015).
  12. Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (last accessed 16 August 2020) (2011).
  13. Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/cms_070934.pdf (last accessed16 August 2020) (2010) (2010).
  14. Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
  15. Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
  16. Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
  17. Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
  18. Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
  19. Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
  20. Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
  21. Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
  22. Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
  23. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
  24. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).

Tags

Genetik Høj opløsning smelteanalyse fluorescens-baseret kvantitativ real-time polymerase kædereaktion genetisk variant præ-cast agarose gel elektroforese indel somatisk mutation heteroduplex scanning CALR
Genetisk variantdetektering i <em>CALR-genet</em> ved hjælp af smeltningsanalyse med høj opløsning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pajič, T., Belčič… More

Pajič, T., Belčič Mikič, T., Podgornik, H., Klun, J., Šućurović, S., Zver, S., Sever, M. Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis. J. Vis. Exp. (162), e61642, doi:10.3791/61642 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter