Summary
Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRM), genetik varyant tespiti için hassas ve hızlı bir çözümdür. Erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexes ile sonuçlanan sıra farklılıklarına bağlıdır. HRM ve agarose jel elektroforezi taranarak, indels gibi farklı genetik varyantlar tanımlanabilir.
Abstract
Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRM), genotipleme ve genetik varyasyon taraması için güçlü bir yöntemdir. Çoğu HRM uygulaması, dizi farklılıklarını algılayan DNA boyalarını ve erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexleri doyurma işlemine bağlıdır. Bir varyantı veya genotipi tanımlayan küçük erime eğrisi farklılıklarını tanımlamak için mükemmel cihaz çözünürlüğü ve özel veri analizi yazılımı gereklidir. Philadelphia kromozomu-negatif miyeloproliferatif neoplazmları olan hastalarda, kanser başta olmak üzere belirli bir hastalığı olan hastalara özgü gende ve CALR geninde farklı frekanslara sahip farklı genetik varyantlar gözlenebilir. İlgi geninde tek nükleotid değişiklikleri, eklemeler ve/veya silmeler (indels) HRM analizi ile tespit edilebilir. Farklı genetik varyant türlerinin tanımlanması çoğunlukla qPCR HRM testinde kullanılan kontrollere dayanmaktadır. Bununla birlikte, ürün uzunluğu arttıkça, vahşi tip ve heterozygot eğrileri arasındaki fark küçülür ve genetik varyant türünü belirlemek daha zordur. Bu nedenle, indellerin ilgi geninde beklenen yaygın genetik varyant olduğu durumlarda, HRM sonucunun netleşmesi için agarose jel elektroforezi gibi ek bir yöntem kullanılabilir. Bazı durumlarda, sonuçsuz bir sonuç standart Sanger dizilimi tarafından yeniden denetlenmeli/yeniden teşhis edilmelidir. Bu retrospektif çalışmada yöntemi MPN'li JAK2 V617F negatif hastalara uyguladık.
Introduction
Kalretikülin geninde(CALR)somatik genetik varyantlar 2013 yılında esansiyel trombositemi ve primer miyelofibrozis1,2gibi miyeloproliferatif neoplazmları (MPN) olan hastalarda tanınmıştır. O zamandan beri, CALR geninde 50'den fazla genetik varyant keşfedildi ve bu da +1 (−1+2) çerçeve3'üindükledi. En sık görülen iki CALR genetik varyantı 52 bp silmedir (NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), tip 1 mutasyonu ve 5 bp ekleme (NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), tip 2 mutasyonu olarak da adlandırılır. Bu iki genetik varyant tüm CALR genetik varyantlarının %80'ini temsil eder. Diğerleri, vahşi tip CALR4'eyakın bir α sarmalının korunmasına dayanan algoritmalar kullanılarak tip 1 gibi veya tip 2 gibi sınıflandırılmıştır. Burada, CALR genetik varyant tespiti için son derece hassas ve hızlı yöntemlerden biri olan yüksek çözünürlüklü erime analiz yöntemini (HRM) sunuyoruz. Bu yöntem, CALR mutasyonlarının çoğunluğunu temsil eden tip 1 ve tip 2 genetik varyantların hızlı bir şekilde algılanmasını sağlar5. HRM, 1997 yılında V Leiden6faktöründeki mutasyonu tespit etmek için bir araç olarak gerçek zamanlı »polimeraz zincir reaksiyonu« (qPCR) ile birlikte tanıtıldı. Altın standart tekniği temsil eden Sanger dizilimine kıyasla, HRM daha hassas ve daha az spesifik bir yöntemdir5. HRM yöntemi, çok sayıda numunenin hızlı bir şekilde analizini sağlayan iyi birtarama yöntemidir. Floresan boya varlığında gerçekleştirilen basit bir PCR yöntemidir ve belirli beceriler gerektirmez. Başka bir fayda, prosedürün kendisinin, numuneyi HRM prosedüründen sonra elektroforezi veya Sanger dizilemesi için yeniden kullanmamızı sağlayan analiz edilen örneğe zarar vermemesi veya yoketmemesidir 7. Tek dezavantajı, bazen sonuçları yorumlamanın zor olmasıdır. Ek olarak, HRM tip 1 veya tip 2 mutasyonu olmayan hastalarda tam mutasyonu tespit etmez8. Bu hastalarda Sanger dizilimi yapılmalıdır(Şekil 1).
HRM, çift iplikli DNA'ya (dsDNA) dahil edilen doygun DNA floresan boyası varlığında spesifik DNA bölgesinin amplifikasyonuna dayanmaktadır. Floresan boya, dsDNA'ya dahil edildiğinde ışık yayar. Sıcaklıkta ilerleyici bir artış sonrasında dsDNA, erime eğrisinde floresan yoğunluğunda ani bir azalma olarak tespit edilebilen tek iplikli DNA'ya ayrılır. Erime eğrisinin şekli mutasyonu tespit etmek için kullanılan DNA dizisine bağlıdır. Örneklerin erime eğrileri, bilinen mutasyonların veya vahşi tip CALR'nin erime eğrileriyle karşılaştırılır. Farklı erime eğrileri tip 1 veya tip 2 9 olmayan farklı bir mutasyonu temsileder.
10'danönce yayınlanan retrospektif çalışmada HRM, agarose jel elektroforezi vedizileme yöntemi ile CALR geninde somatik genetik varyant tespiti algoritması kullanılmıştır ve doğrulanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma Slovenya Cumhuriyeti Tıp Etiği Komitesi tarafından onaylandı. Tüm prosedürler Helsinki bildirgesine uygundu.
1. HRM tarafından floresan bazlı nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve qPCR sonrası analiz
- Malzeme Tablosunda listelenen astarları steril, RNaz ve DNaz içermeyen H 2 O ile 100 μM'ye yeniden sunun(bkz. Malzeme Tablosu). 10 μM çalışma konsantrasyon astarı yapın. Protokolde kullanılan primerler2'denönce yayınlanmıştır.
- Quantitat granülositler DNA'yı üreticinin talimatı11'i takiben floresan boyama yöntemiyle (bkz. Malzeme Tablosu). 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 kullanarak 20 ng/μL DNA çözeltisi hazırlayın(bkz. Malzeme Tablosu).
- DNA örneklerine ek olarak, en az üç DNA kontrolü hazırlayın: NM_004343.3 (CALR) ile iki pozitif kontrol : c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp silme veya tip 1 mutasyon) ve NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (5 bp ekleme veya tip 2 mutasyon) genetik varyantı, ayrıca şablon olmayan (NTC) kontrol olarak vahşi tip DNA ve negatif kontrol.
NOT: HRM kurulumunu gerçekleştirmeden önce, qPCR aygıtının HRM denemeleri için kalibre edilmiş olduğunu onaylayın.
- DNA örneklerine ek olarak, en az üç DNA kontrolü hazırlayın: NM_004343.3 (CALR) ile iki pozitif kontrol : c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp silme veya tip 1 mutasyon) ve NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (5 bp ekleme veya tip 2 mutasyon) genetik varyantı, ayrıca şablon olmayan (NTC) kontrol olarak vahşi tip DNA ve negatif kontrol.
- Üretici protokolüne göre qPCR HRM Master Mix'i hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu)aşağıdaki gibi: 10 μL 2x qPCR Ana Boya ile Karışımı, 0.2 μL 10 μM İleri Astar, 0.2 μL 10 μM Ters Astar, 8.6 μL steril, RNase ve DNase içermeyen H2O. Malzeme Masasındanastarları kullanın. Her DNA örneği ve kontrolü için üç kopya çalıştırın.
- İşlenmekteki numune sayısına göre qPCR HRM Master Mix'i hazırlayın. Reaktif aktarımları sırasında oluşan kayıp için fazla hacim sağlamak üzere hesaplamalara en az %10'luk fazla hacim ekleyin.
- Tüpe hafifçe dokunup ters çevirerek reaksiyon içeriğini karıştırın ve 2-3 sn boyunca girdaplayın. Tüpün duvarından dibe kadar tüm dağınık damlacıkları kısa bir dönüşle toplayın.
- Cihaz ve HRM deneyi için uygun bir reaksiyon plakası hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). qPCR HRM Master Mix'in 19 μL'lik kısmını 96 kuyulu optik reaksiyon plakasının uygun kuyularına aktarın.
- Negatif kontrollerin, pozitif kontrollerin ve numunelerin pipet 1 μL'si optik reaksiyon plakasının uygun kuyularına. NTC için, DNA yerine qPCR HRM Master Mix'i hazırlamak için kullanılan1 μLsteril, RNase ve DNase içermeyen H 2 O aktarın.
- Reaksiyon plakasını optik yapışkan filmle kapatın. Çalıştırma sırasında buharlaşmayı önlemek için sıkıca yapın. Doğru floresan algılamasını sağlamak için optik yapışkan filmin reaksiyon plakasındaki tüm kuyularda düzlem olup olmadığını kontrol edin.
- Reaksiyon plakasını oda sıcaklığında (RT) 780 x g'da 1 dakika döndürün. Sıvının reaksiyon plakasındaki kuyuların dibinde olup olmadığını kontrol edin. Tahlilleri çalıştırmaya devam edin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Plakayı 4 °C'de en fazla 24 saat saklayın. 4 °C'de depolanan plakanın RT'ye ısınmasını izin verin ve çalıştırmadan önce plakayı kısa bir süre döndürün. - Üreticinin talimatına göre, DNA'yı yükseltmek ve eritmek ve qPCR cihazında HRM floresan verileri oluşturmak için koşuyu hazırlayın ve başlatın. Cihaz sistemi yazılımında, kontrolleri ve örnekleri uygun kuyulara atayın.
- CALR genetik varyant tespiti için, varsayılan cihaz amplifikasyon protokolünü değiştirin ve aşağıdaki termal bisiklet protokolünü kullanarak DNA'yı güçlendirin: 10 dakika boyunca 95 °C, ardından 10 s için 95 °C ve 60 s için 62,5 °C'lik 50 döngü.
- Üreticinin talimatlarına göre qPCR'den hemen sonra eriyik eğrisi/ayrışma (HRM) aşamasını gerçekleştirin12 aşağıdaki gibi: 10 s için 95 °C, 1 dakika için 60 °C ve ardından 95 °C'ye kadar 0,025 °C/s rampa hızı. Sıcaklığı 15 s için 95 °C'de ve 15 sn için 60 °C'de tutun.
- Çalıştırma otomatik olarak sona erer. İlk olarak, büyütme grafiğini gözden geçirin ve doğrulayın (Şekil 2).
- Cihaz sistemi yazılımının deneme menüsünde, amplifikasyon çizim seçeneğini seçin. Veri görüntülenmiyorsa, Çözümleyeşil düğmesini tıklatın.
- Amplifikasyon çizimi sekmesinde, çizim türü açılan menüsünden, döngü numarasının (ΔRn vs Döngü) bir işlevi olarak pasif referanstan (ΔRn) floresan'a normalleştirilen ham floresan okumaları olarak amplifikasyon verilerini görüntüleyen çizimi seçin. Çizim rengi açılan menüsünde Örnek 'iseçin.
- Grafik türü açılır menüsünden doğrusal amplifikasyon grafik türünü seçin. Taban çizgisi başlangıç seçeneğini belirleyerek doğrusal amplifikasyon grafiğinde taban çizgisi başlangıç ve bitiş döngüsünü gösterin. Taban çizgisinin doğru ayarlı olduğunu doğrulayın. Uç döngü, önemli floresan sinyalin algılandığı döngü numarasından önce birkaç döngü ayarlanmalıdır. Taban çizgisi genellikle 3 ila 15 döngü arasında ayarlanır (Şekil 2).
- Grafik türü açılan menüsünden log10 amplifikasyon grafik türünü seçin. Eşik seçeneğini belirleyerek grafikteki eşik çizgisini gösterin. Doğru ayarlanmazsa eşiği buna göre ayarlayın. Doğru ayarlanmış eşik, eşik çizgisinin qPCR eğrilerinin üstel aşamasını geçtiği anlamına gelir (Şekil 2).
- Normal amplifikasyon eğrilerinin tüm numune ve pozitif kontrol kuyularında olduğunu doğrulayın. Döngü 40'dan önce NTC kuyularında amplifikasyon olmadığını doğrulayın. Normal bir amplifikasyon grafiği, floresanda 15 ve 35 döngüleri arasındaki eşiği aşan üstel bir artış gösterir (Şekil 2). Kuyu pozisyonunda amplifikasyon yoksa numune kuyularını analizden hariç tutun.
NOT: Amplifikasyon grafiği anormal görünüyorsa veya NTC amplifikasyonu iyi gösteriyorsa, üreticinin sorun giderme kılavuzuna göre sorunu tanımlayın ve çözün. - Enstrüman sistemi yazılımında 2'den fazla çoğaltmadan farklı olan nicelik döngüsü (Cq) değeri ile aykırı değeri hariç tutun12. Aykırılıklar hatalı HRM sonuçları üretebilir.
- Türev erime eğrilerinde, erime öncesi ve sonrası bölgeleri/sıcaklık çizgilerini gözden geçirin. Erime öncesi ve sonrası bölgeler floresan seviyelerinde büyük piklerin veya eğimlerin olmadığı düz bir alan içinde olmalıdır(Şekil 3). Gerekirse ona göre ayarlayın. Erime öncesi ve sonrası sıcaklık çizgilerinin başlangıç ve durağını birbirinden yaklaşık 0,5 °C aralıkla ayarlayın (Şekil 3). Parametreler Analiz Et düğmesine tıklayarak ayarlanırsa analizi yeniden başlatın.
- Fark çizimi sekmesinde, çizim ayarları sekmesinde, referans DNA'sı olarak çoğaltılan vahşi tür denetiminden (homozygote) birini seçin ve Analiz Et düğmesine tıklayarak analizi yeniden başlatın.
- Hizalanmış eriyik eğrileri sekmesinde, tüm pozitif denetimlerin doğru genotipe sahip olduğunu ve NTC'nin yükseltilemediğini onaylayın (Şekil 4). Kuyu tablosundan, analiz çizimlerinde karşılık gelen erime eğrisini vurgulamak için pozitif bir kontrol içeren kuyuları seçin. Çizginin renginin doğru genotipe karşılık geldiğini onaylayın. Diğer pozitif kontrolleri ve NTC'yi içeren kuyular için adımları yineleyin.
- Hizalanmış eriyik eğrileri sekmesinde, bilinmeyen örneklerin çizim ekranlarını dikkatlice gözden geçirin ve kontroller için çizim ekranlarıyla karşılaştırın (Şekil 4). Kuyu tablosundan, bilinmeyen örnek çoğaltmalarını içeren kuyuları seçin, eriyik eğrisinin rengini kontrol edin ve pozitif kontroller içeren kuyuları tek tek seçerek sıralı bir sırayla kontrollerle hizalayın. Bilinmeyen tüm örnekler için işlemi yineleyin.
NOT: Bilinmeyen örnek, erime eğrisi ona sıkıca hizalanmışsa kontrollerden birinin varyantını içerir. Bilinmeyen örneğin kontrollere karşılık gelen bilinmeyen bir varyantdan oluştuğunu gösteren farklı varyant grupları (farklı renkler) görüntülenebilir (Şekil 8). Hastanın örneğinde düşük düzeyde somatik genetik varyant bulunabilir. Bu, özellikle tahlil tespit sınırında İkM sonucunun yorumlanmasını etkileyebilir (Şekil 9). Bu durumlarda, çizginin rengi ve hatta şekli vahşi tip genotipine çok benzeyebilir.- Sonuç sonuçsuz kaldığında, HRM sonuçlarını agarose jel elektroforezi ve dizileme yöntemlerinin sonuçlarıyla birleştirin. Örneği veya isteği yeniden test edin ve gerekirse yeni bir örneği yeniden test edin.
- Eğrileri çoğaltmak için veri kümesini dikkatlice gözden geçirin ve grup içindeki her çoğaltmanın hizalamasının sıkı olup olmadığını kontrol edin. Gruptaki diğer örneklerle (aykırı) sıkıca hizalanmamışsa, yinelemeyi hariç tutun. Daha fazla aykırılık varsa ve sonuçlar sonuçsuzsa örneği yeniden test edin. DNA örneğinin miktarının ve kalitesinin İkM sonuçlarını etkilediğini unutmayın.
- Fark çizimi sekmesinde bilinmeyen örnek için sonucu çözümle. 1.21 adımında açıklanan yordamı yineleyin ve bilinmeyen örnek için elde edilen sonuçların aynı olduğunu doğrulayın.
- Ardından, qPCR HRM ürünlerini agarose jel üzerinde çalıştırın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Plakayı 4 °C'de en fazla 24 saat veya -20 °C'de daha uzun bir süre, ancak 7 günden fazla saklamayın. 4 °C'de depolanan plakanın RT'ye ısınmasını izin verin ve çalıştırmadan önce plakayı kısa bir süre döndürün. - 20 °C'de depolanan plakanın çözülmesine ve RT'ye ısınmasına izin verin ve çalıştırmadan önce plakayı kısa bir süre döndürün.
2. Agarose jel elektroforezi
- QPCR HRM ürünlerini uygun jel elektroforez sistemini kullanarak floresan nükleik asit lekesi içeren% 4 agarose ön döküm jel üzerinde çalıştırın(bkz. Malzeme Tablosu , Şekil 5). Yalnızca bir pozitif, negatif, NTC ve örnek qPCR HRM çoğaltması çalıştırın.
NOT: Jelleri kullanırken eldivenler her zaman giyilmelidir. Eşdeğer agarose yüzdesi, floresan nükleik asit lekesi ve kuyu formatı seçilirse, başka herhangi bir jel elektroforezi sistemi bu amacı yerine getirebilir. - Jel elektroforezi sistemini üreticinin protokolüne göre çalıştırın(bkz. Malzeme Tablosu). Kasetteki ön döküm jeli paketten çıkarın, tarağı çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre cihaza yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Paketi açtıktan sonraki 15 dakika içinde jeli yükleyin. - 10 μL'lik bir numuneyi steril, RNaz ve DNaz içermeyen H 2 O ile20μL'ye seyreltin.
- Steril, RNase ve DNase içermeyen H 2 O ile 3 μL DNA boyutu standart çözeltisini20μL'ye seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu). M'yi 20 μL seyreltilmiş DNA boyutu standart çözeltisi ile iyi yükleyin (Şekil 6).
- Boş kuyuları 20 μL steril, RNase ve DNase içermeyen H2O ile doldurun.
- Çalıştırılan jelin yüzdesine göre programı hemen seçin ve cihazdaki çalışma süresini 10 dakika olarak ayarlayın.
- GO düğmesine basarak elektroforezi yükleme örneğinden 1 dakika sonra başlatın. Yetersiz çözünürlük elde edilirse elektroforezi süresi uzatılabilir.
NOT: Üreticinin talimatlarına göre önerilen maksimum agarose elektroforez çalışma süresini aşmayın. - Elektroforez tamamlandığında, mavi ışık veya UV transillumination kullanarak jeldeki DNA'yı görselleştirin. Elektroforez görüntülerinin görselleştirilmesi, analizlenmesi ve saklanması çoğunlukla foto-dokümantasyon sistemine sahip bir jel görüntüleyiç tarafından yapılır (Şekil 5).
- Bilinmeyen numunenin sonuçlarını pozitif kontrollerle karşılaştırarak görselleştirilmiş qPCR HRM ürünleri jel desenini analiz edin ve yorumlayın (Şekil 7 ve Şekil 8).
- Bilinmeyen örnek HRM ve jel elektroforez sonuçları bilinmeyen bir genetik varyantın mevcut olduğunu gösteriyorsa, açıklanan protokole göre Malzeme Tablosunda açıklanan astarları kullanarak qPCR HRM ürününü sıralayın13.
DİkKAT: Floresan nükleik asit lekesi içeren agarose jelleri kurum yönetmeliklerine uygun şekilde atılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm çoğaltılmış örnek ve kontrollerde 15 ve 35 döngüleri arasındaki eşiği ve nicelik döngüsünün çok dar değerlerini aşan üstel bir floresan artışı ile ilgi çekici DNA bölgesi başarıyla güçlendirilmişTIR (Şekil 2), genetik varyantların HRM analizi ile güvenilir bir şekilde tanımlanması için bir ön koşuldur. Bu, qPCR HRM deneyinde floresan boyama ile DNA'nın kesin bir şekilde belirlenmesi ve eşit miktarda DNA kullanılarak elde edilir (bkz. adım 1.2). Şekil 2, tüm numune ve kontrollerin Cq değerlerinin çok dar bir aralıkta olduğu ilgi çekici DNA bölgesinin başarılı bir şekilde yükseltilmesini göstermektedir. NTC kuyularında amplifikasyon yoktur.
HRM aşaması, qPCR'den hemen sonra 1.11 adımında açıklanan protokol kullanılarak gerçekleştirilir. Örneklerin, denetimlerin ve NTC'nin etkin erime bölgeleri (Şekil 3, etiket (c)) hizalanmış eriyik eğri çizimlerini oluşturmak için kullanılır (Şekil 4). Bu nedenle, doğru ayarlanmış erime öncesi ve sonrası bölgeler/sıcaklık çizgileri (Şekil 3A) örneklerdeki genetik varyantların düzgün bir şekilde görselleştirilmesi ve tanımlanması için önemlidir. Şekil 4A ve Şekil 4B, genetik varyantların tanımlanmasının mümkün olduğu sırasıyla hizalanmış eriyik eğrilerini ve fark çizilerini göstermektedir. Bilinmeyen örnekler pozitif kontrollerden biriyle sıkıca hizalanır. Şekil 3B, erime öncesi ve sonrası bölgeleri/sıcaklık çizgilerini yanlış ayarlanmış olarak gösterir. Bu, genetik varyantların doğru tanımlanmasının daha zor olduğu hizalanmış bir erime eğrisi ve fark çizilerek sonuçlanır (Şekil 4C ve Şekil 4D).
HRM sonuçlarını doğrulamak ve örnekte bulunan genetik varyantı tanımlamak için standart veya yeni nesil dizileme yönteminin gerekli olup olmadığını tespit etmek için agarose jel elektroforezi kullanılır. Şekil 7, Şekil 4'tegörüntülenen aynı numune ve kontrollerin agarose jel elektroforezini göstermektedir. Örnekteki genetik varyant, numunenin bant deseni kontrollerle karşılaştırılarak ve HRM ve agarose jel elektroforez birleştirilerek tanımlanabilir. Bununla birlikte, doğru genetik varyant tanımlaması sadece İkM testinde kullanılan kontrollerden biriyle aynı genetik varyantı içeren örnekler için yapılabilir (Şekil 7). Nadir CALR genetik varyantları içeren örnekler HRM sonucu ve elektroforez bant deseninde farklılık gösterir (Şekil 8). Bu durumda, Sanger dizileme ve hatta yeni nesil sıralama yöntemi tam genetik varyantı tanımlamak için kullanılır.
Şekil 1: CALR geninde somatik genetik varyant tespiti için algoritmanın HRM, agarose jel elektroforez ve dizileme yöntemleri ile şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CALR geninde genetik varyantların tespiti için qPCR HRM testinin amplifikasyon arsası. Amplifikasyon grafiği, pasif referanstan (ΔRn) floresan için normalleştirilen ham floresan ve bir döngü numarasının işlevi olarak görüntülenir. Temel, ilgi çekici DNA bölgesi qPCR reaksiyonunda 20 ng yüksek kaliteli DNA kullanılarak verimli bir şekilde yükseltildiğinde 3 ila 15 döngü arasında ayarlanır. Tüm örneklerin ilgi çekici DNA bölgesinin normal amplifikasyon alanları yeşil çizgiler olarak gösterilmiştir. Çizimler, qPCR reaksiyonunda 20 ng yüksek kaliteli DNA kullanarak deneyde 15 ve 35 döngüleri arasındaki eşiği aşan floresanda üstel bir artış göstermektedir. Grafikte şablon olmayan numune kuyularında (NTC) amplifikasyon yoktur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CALR geninde genetik varyantların tespiti için qPCR HRM testinde türev eriyik eğrileri. A)Erime öncesi ve sonrası bölgelerin/sıcaklık çizgilerinin doğru ayarlanan bir örneği. Erime öncesi durdurma sıcaklık çizgisi, erime geçiş bölgesinin başlangıcına bitişik olmalıdır. Erime sonrası başlangıç sıcaklığı çizgisi, erime geçiş bölgesinin sonuna bitişik olmalıdır. (a) etiketi, ön erimenin başladığı ve durma sıcaklıklarının ayarlandığı tepelerin solundaki çizgi çiftini gösterir. Her amplicon çift telli. (b) etiketi, hizalanmış eriyik eğrileri çizimini oluşturmak için kullanılan etkin erime bölgesinin veri tepelerini gösterir. (c) etiketi, erime sonrası başlangıç ve durdurma sıcaklıklarının ayarlandığı tepelerin sağındaki çizgi çiftini gösterir. Her amplicon tek iplikli. B) Erime öncesi ve sonrası bölgelerin/sıcaklık çizgilerinin yanlış ayarlanan bir örneği. Erime öncesi ve sonrası sıcaklık çizgilerinin başlangıcı ve durağı erime geçiş bölgelerine bitişik değildir ve birbirinden 0,5 °C'den fazladır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: CALR geninde genetik varyantların tespiti için qPCR HRM testinde hizalanmış eriyik eğrileri ve fark çizer. A) ve B) önceden ve erime sonrası bölgeler/sıcaklık çizgileri doğru ayarlandıktan sonra hizalanmış erime eğrilerini ve fark çizimlerini gösterir. A)Pozitif kontrollerin sırasıyla 52 bp silme (tip 1 mutasyon), 5 bp ekleme (tip 2 mutasyon) ve vahşi tip ile hizalanmış erime eğrileri turuncu, mor ve kırmızı renk olarak gösterilir. B) Apanelinde açıklanan örneklerin farkı çizimi. C) ve D) aynı numune kümesi için yanlış ayarlanmış erime öncesi ve sonrası bölgeler/sıcaklık çizgilerinden sonra hizalanmış erime eğrilerini ve fark çizimlerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Jel elektroforez sistemi. A) Jel elektroforez sisteminin temel birimleri (bkz. Malzeme Tablosu). B)CCD kameradan oluşan fotoğraf dokümantasyon sistemine sahip jel görüntüleyici, uygun trans/aydınlatıcı ışıklara sahip bir oda ve fotoğrafik filtre gösterilir (bkz. Malzeme Tablosu). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Jelin seyreltilmiş numuneler ve DNA boyutu standart çözeltisi veya boş kuyular için RNase ve DNase ücretsiz H2O ile yüklenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: qPCR HRM ürünlerinin jel elektroforezi üzerine analizleri. Jel UV transilluminator'a maruz kaldı. Resim fotoğraf dokümantasyon sistemi (Şekil 5B) tarafından çekilmiştir. 1'den 3'e kadar olan kuyular kontrolleri gösterir: sırasıyla 52 bp silme (tip 1 mutasyon), 5 bp ekleme (tip 2 mutasyon) ve vahşi tip varyant. Kuyulardaki bilinmeyen örneklerin bant deseni 4-10 onları vahşi tip genetik varyant olarak gösterir. M kuyusu seyreltilmiş DNA boyutu standart çözeltisini (100 ila 2.000 bp) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: CALR geninde bulunan genetik varyantların HRM ve jel elektroforezi analizleri. A) İkM analizleri. Pozitif kontrollerin sırasıyla 52 bp silme (tip 1 mutasyon), 5 bp ekleme (tip 2 mutasyon) ve bir vahşi tip ile hizalanmış erime eğrileri turuncu, mor ve kırmızı renk olarak gösterilir. Farklı genetik varyanta sahip bilinmeyen örnek koyu mavi renk olarak belirtilmiştir. B)Jel elektroforez analizleri. 1'den 3'e kadar olan kuyular kontrolleri gösterir: sırasıyla 52 bp silme (tip 1 mutasyon), 5 bp ekleme (tip 2 mutasyon) ve vahşi tip varyant. Şerit 9'daki bilinmeyen numunenin bant deseni, kontrol olarak farklı genetik varyantı gösterir. Bilinmeyen diğer örnekler vahşi tip varyanttır. M kuyusu seyreltilmiş DNA boyutu standart çözeltisini (100 ila 2.000 bp) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: İkM testinin tespit sınırı. Sanger dizileme analizine ve bu makalede açıklanan protokole göre qPCR HRM testine göre yaklaşık% 50'lik bir genetik varyant alel yükü gösteren 52 bp silme (tip 1 mutasyonu) ve 5 bp ekleme (tip 2 mutasyon) örneğinin seri seyreltilmesi sunulmuştur. A) ve B) 52 bp silmenin (tip 1 mutasyonu) vahşi tip ve seri seyreltmeleri için hizalanmış erime eğrilerini ve fark çizimlerini gösterir. C) ve D) 5 bp'lik bir eklemenin (tip 2 mutasyonu) vahşi tip ve seri seyreltmeleri için hizalanmış eriyik eğrilerini ve fark çizimlerini gösterir. Her iki durumda da, CALR genetik varyantı% 1.56'ya kadar seyreltmede tespit edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA'nın yüksek çözünürlüklü erimesi genotipleme ve genetik varyant taraması için basit bir çözümdür14. Erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexes ile sonuçlanan sıra farklılıklarına bağlıdır. Kanserli belirli bir grup hastaya özgü gende çeşitli frekanslara sahip farklı genetik varyantlar gözlenebilir 1,2,15,16,10. İlgi geninde silmeler veya eklemeler, Şekil 4A'dagösterdiğimiz gibi hrm analizi ile tespit edilebilir. qPCR HRM testinin rutin teste uygulanmasında, ortanca yaşı 63 olan (24 ila 90 yaş arasında) 21 JAK2 V617F negatif ET hastasını içeren bir ilk değerlendirme çalışması gerçekleştirdik. 21 JAK2 V617F negatif ET hastasının 12'sinde CALR geninde genetik bir varyant saptandı (oran 0.57). 21 hastanın 9'unda (oran 0.43) 52 bp silme (tip 1 mutasyonu), 21 (oran 0.143) JAK2 V617F negatif ET hastasının 3'ında 5 bp ekleme (tip 2 mutasyon) saptandı. Sonuçlar literatür 1,2,17'den elde edilen verilerle tutarlıdır.
Genetik varyantların HRM analizi ile güvenilir bir şekilde tanımlanması, deneyin İkM için optimize edilmesini sağlayan uygun tahlil geliştirmesi ile elde edilebilir. Dizi dışındaki faktörler, astar tasarımı, amplicon uzunluğu, boya seçimi, qPCR HRM reaktif seçimi ve qPCR HRM adımlarının sıcaklık ve zaman profilleri gibi HRM eğrilerinde küçük farklılıklar kaynağı olabilir. Bu, qPCR HRM testinin çok erken geliştirilmesi ve optimizasyonu kısmıdır ve zaten başka bir yerde tartışılmıştır12,14,18. Bununla birlikte, CALR geninde, tahlillerin karşılaştırılabilir hassasiyetine sahip genetik varyantların güvenilir bir şekilde tanımlanması, aynı astar dizileri kullanılarak farklı HRM platformlarında elde edilebilir19. qPCR HRM testinin optimizasyon sürecindeki en kritik nokta, qPCR HRM testinin qPCR adımındaki erime ve uzama sıcaklığının optimizasyonuydu. HRM adım12için herhangi bir değişiklik gerekmedi. Rutin testlerde, İkM sonuçlarını etkileyen diğer faktörlerin takip etmesi daha önemli hale gelir.
TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA veya daha düşük konsantrasyon) gibi düşük tuzlu bir tamponda yeniden canlanan yüksek kaliteli DNA ve qPCR HRM testindeki aynı miktarda DNA, qPCR amplifikasyon aşamasında yüksek sinyal platosu ile ilgi alanlarının başarılı bir şekilde yükseltilmesi için önemli faktörlerdir (Şekil 2). Bu, genetik varyantların HRM analizi ile güvenilir bir şekilde tanımlanmasına yol açar (Şekil 4A,4B)12,14. Ekstraksiyon protokolünde DNA'nın elüasyonu için kullanılan yüksek tuzlu bir tampon, DNA erime geçişinin termodinamiği incelikle değiştirebilir. Düşük tuzlu tampon TE'de yağış ve resüspensyon veya numunenin seyreltilmesi DNA örneğindeki safsızlık sorununu çözebilir. Düşük kaliteli DNA spesifik olmayan PCR ürünleri veya başarısız amplifikasyon üretebilir. Tüm bunlar, HRM varyant algılamasında daha düşük tekrarlanabilirlik ve daha yüksek hata oranına neden olabilir. En uygun HRM sonucunu elde etmek için parafin gömülü örneklerden çıkarılan DNA gibi zorlu örnekler için ek optimizasyon gerekebilir15.
qPCR HRM testinde kullanılan DNA miktarındaki büyük farklılıklar, ortaya çıkan erime sıcaklığını (Tm) etkileyebilir ve sonuçsuz sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, DNA konsantrasyonunun kesin belirlenmesi ve tüm DNA örneklerinin seyreltilmesi zorunludur20. Ultraviyole (UV) emilimi ve floresan boyama yöntemleri, yüksek saflıkta DNA çözeltilerinin konsantrasyonlarını doğru bir şekilde belirler21. UV absorbans yöntemi, A260/A280 ve A260/230'da oran absorbansı ölçümleri yapılarak DNA çözeltilerinin saflığını değerlendirmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, floresan boyama yöntemi UV emilim yönteminden daha dna bozulmasına karşı daha hassastır ve DNA konsantrasyonunu daha doğru belirleyebilir21. Bu nedenle, HRM analizinde tüm DNA örneklerinin nicelik ve seyreltilmesinin standartlaştırılması için daha uygundur20,21.
İndeller, MPN hastalarında gözlenen CALR geninde ana genetikvaryantlardır 1. Ürün uzunluğu değiştikçe ve arttıkça, vahşi tip ve heterozygot eğrileri arasındaki fark küçülür ve varyant algılaması zorlaşır7. Bu nedenle, bu tür genetik varyantın açıklığa kavuşması için ek bir yöntem kullanılmalıdır.
Agarose jel elektroforezi iyi bir örnektir. Bu, farklı boyutlardaki DNA parçalarını ayırmak için basit ve etkili bir yöntemdir22,23. DNA molekülleri agarose jel içindeki boyuta göre ayrılır, böylece kat edilen mesafe moleküler ağırlığının logaritması ile ters orantılıdır24. Şekil 4A, Şekil 4B ve Şekil 7, en yaygın iki CALR genetik varyantı olan 52 bp silme ve 5 bp eklemenin qPCR HRM ve agarose jel elektroforezi sonuçlarının birleştirilmesiyle tanımlandığı örnekleri göstermektedir. Bununla birlikte, HRM sonucu ve agarose jel elektroforez bant deseni kontrollerde olduğu gibi farklı bir genetik varyantı (tek nükleotid değişimi dahil) gösterdiğinde (Şekil 8), Sanger dizilemesi hala tam genetik varyantı tanımlamak için gereklidir10.
Hastanın örneğinde, özellikle tahlil tespit limitinde qPCR HRM, agarose jel elektroforez ve Sanger dizileme sonuçlarının daha zorlu bir yorumunu yapan düşük düzeyde somatik genetik varyant bulunabilir (Şekil 9). Vahşi tip 1'den farklı herhangi bir erime eğrisi şekil çizgisi, örnekte mevcut olacak genetik varyantı gösterir. qPCR HRM testinin hassasiyeti% 5'ten daha düşüktür (Şekil 9 ve referans19) ve hassasiyeti% 15-20 19 olduğu bildirilenSanger dizileme yönteminden daha hassastır. Bu durumlarda, daha büyük indelleri algılayan yeni nesil derin sıralama yöntemi uygulanabilir ve HRM sonucunu doğrulayabilir. Sonuç olarak, HRM analizi CALR geninde somatik genetik varyantların genotipleme ve genetik varyasyon taraması için güçlü bir yöntemdir. Farklı genetik varyant türlerinin tanımlanması çoğunlukla qPCR HRM testinde kullanılan kontrollere dayanmaktadır. HRM sonuçları agarose jel elektroforezi sonuçları ile birleştirilerek daha güvenilir sonuçlar elde edilir. Sonuçsuz sonuçlar durumunda, genetik varyantı düzgün bir şekilde tanımlamak için standart Sanger dizileme veya daha da hassas yeni nesil dizileme yöntemi kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Ljubljana Üniversitesi Tıp Merkezi, İhtisas Hematoloji Laboratuvarı, Hematoloji Bölümü, İç Hastalıkları Anabilim Dalı'ndaki tüm akademik uzmanlara ve çalışanlara teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al.
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (last accessed 16 August 2020) (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (last accessed 16 August 2020) (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/cms_070934.pdf (last accessed16 August 2020) (2010) (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D.
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
