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Genetics

Genetischer Variantennachweis im CALR-Gen mittels hochauflösender Schmelzanalyse

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Hematology, University Medical Centre Ljubljana, 2Clinical Institute for Genomic Medicine, University Medical Centre Ljubljana, 3Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

Die hochauflösende Schmelzanalyse (HRM) ist eine empfindliche und schnelle Lösung für den genetischen Variantennachweis. Es hängt von Sequenzunterschieden ab, die dazu führen, dass Heteroduplexe die Form der Schmelzkurve verändern. Durch Kämmen von HRM und Agarosegelelektrophorese können verschiedene Arten von genetischen Varianten wie Indels identifiziert werden.

Abstract

Die hochauflösende Schmelzanalyse (HRM) ist eine leistungsstarke Methode für die Genotypisierung und das Scannen genetischer Variationen. Die meisten HRM-Anwendungen hängen von sättigenden DNA-Farbstoffen ab, die Sequenzunterschiede erkennen, und Heteroduplexen, die die Form der Schmelzkurve verändern. Eine ausgezeichnete Instrumentenauflösung und eine spezielle Datenanalysesoftware sind erforderlich, um die kleinen Schmelzkurvenunterschiede zu identifizieren, die eine Variante oder einen Genotyp identifizieren. Verschiedene Arten von genetischen Varianten mit unterschiedlichen Häufigkeiten können im Gen speziell für Patienten mit einer bestimmten Krankheit, insbesondere Krebs, und im CALR-Gen bei Patienten mit Philadelphia-Chromosom-negativen myeloproliferativen Neoplasmen beobachtet werden. Einzelne Nukleotidveränderungen, Insertionen und/oder Deletionen (Indels) im interessierenden Gen können durch die HRM-Analyse nachgewiesen werden. Die Identifizierung verschiedener Arten von genetischen Varianten basiert hauptsächlich auf den Kontrollen, die im qPCR-HRM-Assay verwendet werden. Mit zunehmender Produktlänge wird der Unterschied zwischen Wildtyp- und Heterozygotenkurven jedoch kleiner und die Art der genetischen Variante ist schwieriger zu bestimmen. Wenn Indels die vorherrschende genetische Variante sind, die im interessierenden Gen erwartet wird, kann daher eine zusätzliche Methode wie die Agarosegelelektrophorese zur Klärung des HRM-Ergebnisses verwendet werden. In einigen Fällen muss ein nicht schlüssiges Ergebnis durch Standard-Sanger-Sequenzierung erneut überprüft / erneut diagnostiziert werden. In dieser retrospektiven Studie wandten wir die Methode auf JAK2 V617F-negative Patienten mit MPN an.

Introduction

Somatische genetische Varianten im Calreticulin-Gen (CALR) wurden 2013 bei Patienten mit myeloproliferativen Neoplasmen (MPN) wie essentieller Thrombozythämie und primärer Myelofibrose erkannt1,2. Seitdem wurden mehr als 50 genetische Varianten im CALR-Gen entdeckt, die eine +1 (−1+2) Frameshift3induzieren. Die beiden häufigsten CALR-Genvarianten sind eine 52 bp Deletion (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), auch Typ-1-Mutation genannt, und eine 5 bp Insertion (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), auch Typ-2-Mutation genannt. Diese beiden genetischen Varianten machen 80% aller CALR-Genvarianten aus. Die anderen wurden als Typ 1-ähnlich oder Typ 2-ähnlich klassifiziert, wobei Algorithmen verwendet wurden, die auf der Erhaltung einer α Helix in der Nähe des Wildtyps CALR4basieren. Hier stellen wir eine der hochempfindlichen und schnellen Methoden zum CALR-Genvariantennachweis vor, die Hochauflösende Schmelzanalysemethode (HRM). Diese Methode ermöglicht den schnellen Nachweis genetischer Varianten vom Typ 1 und Typ 2, die die Mehrheit der CALR-Mutationen ausmachen5. HRM wurde 1997 in Kombination mit der Echtzeit-»Polymerase-Kettenreaktion« (qPCR) als Werkzeug zum Nachweis der Mutation im Faktor V Leiden6eingeführt. Im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung, die die goldene Standardtechnik darstellt, ist HRM eine empfindlichere und weniger spezifische Methode5. Die HRM-Methode ist eine gute Screening-Methode, die eine schnelle Analyse einer großen Anzahl von Proben mit einem großen Kosten-Nutzen-Verhältnis ermöglicht5. Es ist eine einfache PCR-Methode, die in Gegenwart eines Fluoreszenzfarbstoffs durchgeführt wird und keine spezifischen Fähigkeiten erfordert. Ein weiterer Vorteil ist, dass das Verfahren selbst die analysierte Probe nicht beschädigt oder zerstört, so dass wir die Probe für die Elektrophorese oder Sanger-Sequenzierung nach dem HRM-Verfahren wiederverwendenkönnen 7. Der einzige Nachteil ist, dass es manchmal schwierig ist, die Ergebnisse zu interpretieren. Darüber hinaus erkennt HRM die genaue Mutation bei Patienten mit Nicht-Typ-1- oder Typ-2-Mutationen nicht8. Bei diesen Patienten sollte eine Sanger-Sequenzierung durchgeführt werden (Abbildung 1).

HRM basiert auf der Amplifikation der spezifischen DNA-Region in Gegenwart von sättigendem DNA-Fluoreszenzfarbstoff, der in doppelsträngige DNA (dsDNA) eingebaut wird. Der Fluoreszenzfarbstoff emittiert Licht, wenn er in die dsDNA eingebaut wird. Nach einem fortschreitenden Temperaturanstieg zerfällt dsDNA in einzelsträngige DNA, die auf der Schmelzkurve als plötzliche Abnahme der Fluoreszenzintensität nachgewiesen werden kann. Die Form der Schmelzkurve hängt von der DNA-Sequenz ab, die zum Nachweis der Mutation verwendet wird. Schmelzkurven von Proben werden mit Schmelzkurven bekannter Mutationen oder Wildtyp-CALR verglichen. Unterschiedliche Schmelzkurven stellen eine andere Mutation dar, die nicht Typ 1 oder Typ 2ist 9.

Der Algorithmus für den somatischen genetischen Variantennachweis im CALR-Gen durch HRM, Agarosegelelektrophorese und Sequenzierungsmethode ( Abbildung 1 ) wurde in der vor10veröffentlichten retrospektiven Studie verwendet und validiert.

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Protocol

Die Studie wurde vom Komitee für medizinische Ethik der Republik Slowenien genehmigt. Alle Verfahren standen im Einklang mit der Erklärung von Helsinki.

1. Fluoreszenzbasierte quantitative real-time PCR (qPCR) und Post-qPCR-Analyse mittels HRM

  1. Resuspend Primer, die in der Materialtabelle aufgeführt sind, auf 100 μM mit sterilem, RNase- und DNase-freiemH2O(siehe Materialtabelle). Machen Sie einen 10 μM Arbeitskonzentrationsprimer. Die im Protokoll verwendeten Primer wurden vor2veröffentlicht.
  2. Quantifizieren Sie Granulozyten-DNA durch die Fluoreszenzfärbungsmethode gemäß der Herstelleranweisung11 (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie eine 20 ng /μL DNA-Lösung mit 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 vor (siehe Materialtabelle).
    1. Bereiten Sie zusätzlich zu dna-Proben mindestens drei DNA-Kontrollen vor: zwei Positivkontrollen mit dem NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp Deletion oder Typ-1-Mutation) und NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, P.(Lys385Asnfs*47) (5 bp Insertion oder Typ-2-Mutation) genetische Variante, sowie Wildtyp-DNA und Negativkontrolle als Non-Template (NTC) Kontrolle.
      HINWEIS: Vergewissern Sie sich vor der HRM-Einrichtung, dass das qPCR-Gerät für HRM-Experimente kalibriert ist.
  3. Bereiten Sie qPCR HRM Master Mix gemäß Herstellerprotokoll (siehe Materialtabelle)wie folgt vor: 10 μL 2x qPCR Master Mix mit Farbstoff, 0,2 μL 10 μM Forward Primer, 0,2 μL 10 μM Reverse Primer, 8,6 μL steriles, RNase- und DNasefreies H2O. Verwenden Sie die Primer aus der Materialtabelle. Führen Sie drei Replikate für jede DNA-Probe und -Kontrolle durch.
    1. Bereiten Sie den qPCR HRM Master Mix entsprechend der Anzahl der zu verarbeitenden Proben vor. Beziehen Sie ein Überschussvolumen von mindestens 10% in die Berechnungen ein, um ein Überschussvolumen für den Verlust bereitzustellen, der bei Reagenzientransfers auftritt.
  4. Mischen Sie den Reaktionsinhalt durch vorsichtiges Klopfen und Invertieren des Röhrchens und Wirbeln für 2-3 s. Sammeln Sie alle verstreuten Tröpfchen von der Wand der Röhre bis zum Boden durch eine kurze Drehung.
  5. Bereiten Sie eine Reaktionsplatte vor, die für das Instrument und das HRM-Experiment geeignet ist (siehe Tabelle der Materialien). Übertragen Sie 19 μL des qPCR HRM Master Mix in die entsprechenden Vertiefungen der optischen Reaktionsplatte mit 96 Wellen.
  6. Pipettieren Sie 1 μL der Negativkontrollen, Positivkontrollen und Proben in die entsprechenden Vertiefungen der optischen Reaktionsplatte. Für die NTC werden 1 μL steriles, RNase- und DNase-freiesH2O, das zur Herstellung des qPCR HRM Master Mix verwendet wird, anstelle von DNA übertragen.
  7. Verschließen Sie die Reaktionsplatte mit der optischen Klebefolie. Tun Sie es fest, um eine Verdunstung während des Laufs zu verhindern. Überprüfen Sie, ob der optische Klebefilm über alle Vertiefungen in der Reaktionsplatte ebener ist, um eine korrekte Fluoreszenzdetektion sicherzustellen.
  8. Drehen Sie die Reaktionsplatte bei 780 x g bei Raumtemperatur (RT) für 1 Minute. Überprüfen Sie, ob sich die Flüssigkeit am Boden der Vertiefungen in der Reaktionsplatte befindet. Fahren Sie mit dem Ausführen des Assays fort.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Lagern Sie die Platte bei 4 °C für nicht mehr als 24 h. Lassen Sie die bei 4 °C gelagerte Platte auf RT erwärmen und drehen Sie die Platte dann kurz, bevor Sie sie laufen lassen.
  9. Bereiten Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers den Lauf vor und starten Sie ihn, um die DNA zu amplifizieren und zu schmelzen und HRM-Fluoreszenzdaten im qPCR-Instrument zu generieren. Ordnen Sie in der Gerätesystemsoftware die Steuerungen und Proben den entsprechenden Vertiefungen zu.
  10. Ändern Sie für den Nachweis der genetischen CALR-Variante das Standard-Instrumentenamplifikationsprotokoll und amplifizieren Sie die DNA mithilfe des folgenden thermischen Zyklusprotokolls: 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 50 Zyklen von 95 °C für 10 s und 62,5 °C für 60 s.
  11. Führen Sie die Schmelzekurve/Dissoziationsstufe (HRM) unmittelbar nach der qPCR gemäßherstellerseitiger Anleitung 12 wie folgt durch: 95 °C für 10 s, 60 °C für 1 min und dann eine Rampenrate von 0,025 °C/s bis 95 °C. Halten Sie die Temperatur bei 95 °C für 15 s und bei 60 °C für 15 s.
  12. Der Lauf endet automatisch. Überprüfen und verifizieren Sie zunächst das Verstärkungsdiagramm (Abbildung 2).
  13. Wählen Sie im Experimentmenü der Gerätesystemsoftware die Option Verstärkungsdiagramm aus. Wenn keine Daten angezeigt werden, klicken Sie auf die grüne Schaltfläche Analysieren.
    1. Wählen Sie auf der Registerkarte Verstärkungsdiagramm im Dropdown-Menü Diagrammtyp das Diagramm aus, in dem die Verstärkungsdaten als rohe Fluoreszenzmesswerte angezeigt werden, die von der passiven Referenz (ΔRn) als Funktion der Zyklusnummer (ΔRn vs. Zyklus) auf die Fluoreszenz normiert wurden. Wählen Sie im Dropdown-Menü Plotfarbe die Option Beispielaus.
  14. Wählen Sie im Dropdown-Menü Diagrammtyp den Diagrammtyp für die lineare Verstärkung aus. Zeigen Sie den Start- und Endzyklus der Baseline im diagramm zur linearen Verstärkung an, indem Sie die Option Baseline-Start auswählen. Stellen Sie sicher, dass die Baseline korrekt festgelegt ist. Der Endzyklus sollte einige Zyklen vor der Zyklusnummer eingestellt werden, in der ein signifikantes Fluoreszenzsignal erkannt wird. Die Baseline wird in der Regel von 3 bis 15 Zyklen festgelegt (Abbildung 2).
  15. Wählen Sie im Dropdown-Menü Diagrammtyp den Verstärkungsdiagrammtyp log10 aus. Zeigen Sie die Schwellenwertlinie im Diagramm an, indem Sie die Option Schwellenwert auswählen. Passen Sie den Schwellenwert entsprechend an, wenn er nicht richtig eingestellt ist. Der korrekt eingestellte Schwellenwert bedeutet, dass die Schwellenwertlinie die exponentielle Phase der qPCR-Kurven kreuzt (Abbildung 2).
  16. Stellen Sie sicher, dass normale Amplifikationskurven in allen Proben- und Positivkontrollbohrungen vorhanden sind. Stellen Sie sicher, dass vor Zyklus 40 keine Verstärkung in den NTC-Vertiefungen vorhanden ist. Ein normales Amplifikationsdiagramm zeigt einen exponentiellen Anstieg der Fluoreszenz, der den Schwellenwert zwischen den Zyklen 15 und 35 überschreitet (Abbildung 2). Schließen Sie die Probenbohrungen von der Analyse aus, wenn in der Bohrlochposition keine Amplifikation vorliegt.
    HINWEIS: Wenn das Amplifikationsdiagramm abnormal aussieht oder das NTC-Well die Verstärkung anzeigt, identifizieren und beheben Sie das Problem gemäß der Fehlerbehebungsanleitung des Herstellers.
  17. Schließen Sie den Ausreißer mit dem Cq-Wert (Quantification Cycle) aus, der sich von Replikaten um mehr als 2 in der Gerätesystemsoftware12unterscheidet. Die Ausreißer können zu fehlerhaften HRM-Ergebnissen führen.
  18. Überprüfen Sie in den abgeleiteten Schmelzekurven die Bereiche/Temperaturlinien vor und nach der Schmelze. Die Regionen vor und nach der Schmelze sollten sich in einem flachen Bereich befinden, in dem es keine großen Spitzen oder Steigungen in den Fluoreszenzwerten gibt (Abbildung 3). Bei Bedarf passen Sie es entsprechend an. Setzen Sie den Start und Stopp der Temperaturlinien vor und nach der Schmelze etwa 0,5 °C voneinander entfernt auf (Abbildung 3). Starten Sie die Analyse neu, wenn die Parameter durch Klicken auf die Schaltfläche Analysieren angepasst werden.
  19. Wählen Sie auf der Registerkarte Differenzdiagramm auf der Registerkarte Diagrammeinstellungen eines der Wildtyp-Steuerelemente (homozygot) als Referenz-DNA aus, und starten Sie die Analyse neu, indem Sie auf die Schaltfläche Analysieren klicken.
  20. Bestätigen Sie auf der Registerkarte ausgerichtete Schmelzkurven, dass alle Positivkontrollen den richtigen Genotyp aufweisen und NTC nicht verstärkt werden konnte (Abbildung 4). Wählen Sie aus der Bohrlochtabelle die Vertiefungen aus, die eine Positivkontrolle enthalten, um die entsprechende Schmelzkurve in den Analysediagrammen hervorzuheben. Vergewissern Sie sich, dass die Farbe der Linie dem richtigen Genotyp entspricht. Wiederholen Sie die Schritte für die Vertiefungen, die die anderen Positivkontrollen und NTC enthalten.
  21. Überprüfen Sie auf der Registerkarte ausgerichtete Schmelzkurven sorgfältig die Diagrammanzeigen für die unbekannten Proben, und vergleichen Sie sie mit den Diagrammanzeigen für Steuerelemente (Abbildung 4). Wählen Sie aus der Bohrlochtabelle die Vertiefungen aus, die die unbekannten Probenreplikate enthalten, überprüfen Sie die Farbe der Schmelzekurve und richten Sie sie in einer geordneten Reihenfolge an den Kontrollen aus, indem Sie die Vertiefungen mit positiven Kontrollen nacheinander auswählen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle unbekannten Beispiele.
    HINWEIS: Die unbekannte Probe enthält die Variante einer der Kontrollen, wenn ihre Schmelzkurve eng darauf ausgerichtet ist. Verschiedene Variantengruppen (verschiedene Farben) könnten angezeigt werden, was darauf hinweist, dass die unbekannte Stichprobe aus einer unbekannten Variante besteht, die nicht den Steuerelementen entspricht (Abbildung 8). Ein geringes Niveau der somatischen genetischen Variante kann in der Probe des Patienten vorhanden sein. Dies könnte die Interpretation des HRM-Ergebnisses beeinflussen, insbesondere an der Nachweisgrenze des Assays (Abbildung 9). In diesen Fällen könnte die Farbe oder sogar die Form der Linie der des Wildtyp-Genotyps sehr ähnlich sein.
    1. Wenn das Ergebnis nicht schlüssig ist, kombinieren Sie die HRM-Ergebnisse mit den Ergebnissen der Agarosegelelektrophorese und Sequenzierungsmethoden. Testen Sie das Beispiel erneut oder fordern Sie es an, und testen Sie bei Bedarf ein neues Beispiel erneut.
    2. Überprüfen Sie den Datensatz sorgfältig auf Replikationskurven, und stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung jedes Replikats innerhalb der Gruppe eng ist. Schließen Sie das Replikat aus, wenn es nicht eng mit den anderen Stichproben in der Gruppe ausgerichtet ist (Ausreißer). Testen Sie die Stichprobe erneut, wenn weitere Ausreißer vorhanden sind und die Ergebnisse nicht schlüssig sind. Beachten Sie, dass die Quantität und Qualität der DNA-Probe die HRM-Ergebnisse beeinflussen.
  22. Analysieren Sie das Ergebnis für die unbekannte Probe auf der Registerkarte Differenzdiagramm. Wiederholen Sie das in Schritt 1.21 beschriebene Verfahren, und überprüfen Sie, ob die für die unbekannte Probe erhaltenen Ergebnisse identisch sind.
  23. Führen Sie dann die qPCR HRM-Produkte auf dem Agarosegel aus.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Lagern Sie die Platte bei 4 °C nicht länger als 24 Stunden oder bei -20 °C für einen längeren Zeitraum, jedoch nicht länger als 7 Tage. Lassen Sie die bei 4 °C gelagerte Platte auf RT erwärmen und drehen Sie die Platte dann kurz, bevor Sie sie laufen lassen. Lassen Sie die bei - 20 °C gelagerte Platte auftauen und auf RT erwärmen, und drehen Sie die Platte dann kurz, bevor Sie sie laufen lassen.

2. Agarose-Gel-Elektrophorese

  1. Führen Sie qPCR HRM-Produkte auf einem 4% igen Agarose-Vorgussgel, das eine fluoreszierende Nukleinsäurefärbung enthält, unter Verwendung des geeigneten Gelelektrophoresesystems (siehe Materialtabelle, Abbildung 5). Führen Sie nur eine positive, negative, NTC- und Stichproben-qPCR-HRM-Replikation aus.
    HINWEIS: Handschuhe sollten immer beim Umgang mit Gelen getragen werden. Jedes andere Gelelektrophoresesystem kann diesen Zweck erfüllen, wenn der äquivalente Agaroseanteil, die fluoreszierende Nukleinsäurefärbung und das Well-Format gewählt werden.
  2. Führen Sie das Gelelektrophoresesystem gemäß dem Protokoll des Herstellers aus (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie das vorgegossene Gel in der Kassette aus der Verpackung, entfernen Sie den Kamm und legen Sie es gemäß den Anweisungen des Herstellers in das Gerät ein (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Laden Sie das Gel innerhalb von 15 Minuten nach dem Öffnen der Packung ein.
  3. Verdünnen Sie eine 10 μL-Probe auf 20 μL mit sterilem, RNase- und DNase-freiemH2O. Laden Sie jede Vertiefung mit 20 μL verdünnter Probe auf.
  4. Verdünnen Sie 3 μL DNA-Größenstandardlösung auf 20 μL mit sterilem, RNase- und DNase-freiemH2O(siehe Materialtabelle). Laden Sie die M-Vertiefung mit 20 μL verdünnter DNA-Standardlösung (Abbildung 6).
  5. Füllen Sie alle leeren Vertiefungen mit 20 μL sterilem, RNase- und DNase-freiemH2O.
  6. Wählen Sie sofort das Programm entsprechend dem Prozentsatz des gels aus, das ausgeführt wird, und stellen Sie die Laufzeit am Gerät auf 10 Minuten ein.
  7. Starten Sie die Elektrophorese innerhalb von 1 Minute nach dem Laden der Probe, indem Sie die GO-Taste drücken. Die Elektrophoresezeit kann verlängert werden, wenn eine unzureichende Auflösung erreicht wird.
    HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die maximal empfohlene Agaroseelektrophorese-Laufzeit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  8. Wenn die Elektrophorese abgeschlossen ist, visualisieren Sie dna im Gel mit einer Blaulicht- oder UV-Transillumination. Die Visualisierung, Analyse und Speicherung der Elektrophoresebilder erfolgt meist durch einen Gel-Imager mit Fotodokumentationssystem (Abbildung 5).
  9. Analysieren und interpretieren Sie das visualisierte qPCR HRM-Produktgelmuster, indem Sie die Ergebnisse der unbekannten Probe mit Positivkontrollen vergleichen (Abbildung 7 und Abbildung 8).
  10. Wenn die Ergebnisse der unbekannten Probe-HRM und der Gelelektrophorese darauf hindeuten, dass eine unbekannte genetische Variante vorhanden ist, sequenzieren Sie das qPCR-HRM-Produkt unter Verwendung von Primern, die in der Materialtabelle gemäß dem in13beschriebenen Protokoll beschrieben sind.
    ACHTUNG: Die Agarosegele, die einen fluoreszierenden Nukleinsäurefleck enthalten, müssen gemäß den Vorschriften der Institution ordnungsgemäß entsorgt werden.

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Representative Results

Die erfolgreich amplifizierte DNA-Region von Interesse mit einem exponentiellen Anstieg der Fluoreszenz, der die Schwelle zwischen den Zyklen 15 und 35 überschreitet, und sehr engen Werten des Quantifizierungszyklus (Cq) in allen replizierten Proben und Kontrollen (Abbildung 2) ist eine Voraussetzung für die zuverlässige Identifizierung genetischer Varianten durch HRM-Analyse. Dies wird durch eine präzise Bestimmung der DNA mit Fluoreszenzfärbung und einer gleichen Menge an DNA im qPCR HRM-Experiment erreicht (siehe Schritt 1.2). Abbildung 2 zeigt die erfolgreiche Amplifikation der interessierenden DNA-Region, bei der sich die Cq-Werte aller Proben und Kontrollen in einem sehr engen Intervall befinden. Es gibt keine Verstärkung in den NTC-Wells.

Die HRM-Phase wird unmittelbar nach der qPCR unter Verwendung des in Schritt 1.11 beschriebenen Protokolls durchgeführt. Die aktiven Schmelzebereiche (Abbildung 3, Beschriftung (c)) der Proben, der Kontrollen und des NTC werden verwendet, um ihre ausgerichteten Schmelzkurvendiagramme zu erstellen (Abbildung 4). Daher sind die korrekt eingestellten Vor- und Nachschmelzregionen/Temperaturlinien (Abbildung 3A) wichtig, um genetische Varianten in den Proben richtig zu visualisieren und zu identifizieren. Abbildung 4A und Abbildung 4B zeigen die ausgerichteten Schmelzkurven bzw. Differenzdiagramme, in denen die Identifizierung genetischer Varianten möglich ist. Die unbekannten Proben sind eng mit einer der Positivkontrollen ausgerichtet. Abbildung 3B zeigt falsch eingestellte Vor- und Nachschmelzbereiche/Temperaturlinien. Dies führt zu einer ausgerichteten Schmelzkurve und Differenzdiagrammen, in denen die korrekte Identifizierung der genetischen Varianten schwieriger ist (Abbildung 4C und Abbildung 4D).

Um die HRM-Ergebnisse zu bestätigen und festzustellen, ob eine Standard- oder Next-Generation-Sequenzierungsmethode erforderlich ist, um die in der Probe vorhandene genetische Variante zu identifizieren, wird die Agarosegelelektrophorese verwendet. Abbildung 7 zeigt die Agarosegelelektrophorese der gleichen Proben und Kontrollen, die in Abbildung 4dargestellt sind. Die genetische Variante in der Probe kann identifiziert werden, indem das Bandenmuster der Probe mit den Kontrollen verglichen und die HRM- und Agarosegelelektrophorese kombiniert werden. Die korrekte genetische Variantenidentifizierung kann jedoch nur für die Proben erfolgen, die die gleiche genetische Variante wie eine der im HRM-Assay verwendeten Kontrollen enthalten (Abbildung 7). Proben, die seltene CALR-Genvarianten enthalten, unterscheiden sich im HRM-Ergebnis und im Elektrophorese-Bandenmuster ( Abbildung8). In diesem Fall werden die Sanger-Sequenzierung oder sogar die Next-Generation-Sequenzierungsmethode verwendet, um die genaue genetische Variante zu identifizieren.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Algorithmus zur somatischen genetischen Variantendetektion im CALR-Gen durch HRM, Agarosegelelektrophorese und Sequenzierungsmethoden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Amplifikationsdiagramm des qPCR HRM Assays zum Nachweis der genetischen Varianten im CALR-Gen. Das Verstärkungsdiagramm wird als rohe Fluoreszenz normalisiert auf die Fluoreszenz aus der passiven Referenz (ΔRn) und als Funktion einer Zyklusnummer angezeigt. Die Baseline wird von 3 bis 15 Zyklen festgelegt, wenn die DNA-Region von Interesse effizient mit 20 ng hochwertiger DNA in der qPCR-Reaktion amplifiziert wurde. Die normalen Amplifikationsdiagramme der DNA-Region aller Proben werden als grüne Linien dargestellt. Die Diagramme zeigen einen exponentiellen Anstieg der Fluoreszenz, der die Schwelle zwischen den Zyklen 15 und 35 im Experiment überschreitet, wobei 20 ng hochwertiger DNA in der qPCR-Reaktion verwendet werden. Das Diagramm zeigt keine Verstärkung in den Nicht-Template-Sample-Wells (NTC). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Derivative Schmelzkurven im qPCR HRM Assay zum Nachweis der genetischen Varianten im CALR-Gen.  A) Ein Beispiel für korrekt eingestellte Vor- und Nachschmelzbereiche/Temperaturlinien. Die Temperaturlinie vor dem Schmelzestopp muss neben dem Beginn des Schmelzeübergangsbereichs liegen. Die Starttemperaturlinie nach der Schmelze muss neben dem Ende des Schmelzeübergangsbereichs liegen. Die Beschriftung (a) gibt das Linienpaar links von den Peaks an, in dem die Vorschmelze beginnt und die Stopptemperaturen eingestellt sind. Jedes Amplikon ist doppelsträngig. Die Beschriftung (b) gibt die Datenspitzen des aktiven Schmelzebereichs an, der zum Erstellen des Diagramms der ausgerichteten Schmelzekurven verwendet wurde. Die Beschriftung (c) gibt das Linienpaar rechts neben den Peaks an, in dem die Start- und Stopptemperaturen nach der Schmelze eingestellt sind. Jedes Amplikon ist einzelsträngig. B) Ein Beispiel für falsch eingestellte Vor- und Nachschmelzbereiche/Temperaturlinien. Start und Stopp der Temperaturlinien vor und nach der Schmelze grenzen nicht an die Schmelzübergangsbereiche an und sind mehr als 0,5 °C voneinander entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Die ausgerichteten Schmelzkurven und Differenzdiagramme im qPCR HRM Assay zum Nachweis der genetischen Varianten im CALR-Gen.  A) und B) zeigen die ausgerichteten Schmelzekurven und Differenzdiagramme, nachdem die Bereiche/Temperaturlinien vor und nach der Schmelze korrekt eingestellt wurden. A) Die ausgerichteten Schmelzkurven der Positivkontrollen mit 52 bp Deletion (Typ 1 Mutation), 5 bp Insertion (Typ 2 Mutation) und einem Wildtyp werden als orange, violette bzw. rote Farbe dargestellt. B) Das Differenzdiagramm der gleichen Stichproben wie in Tafel Abeschrieben. C) und D) zeigen die ausgerichteten Schmelzekurven und Differenzdiagramme nach den falsch eingestellten Vor- und Nachschmelzbereichen/Temperaturlinien für denselben Probensatz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Das Gelelektrophoresesystem. A) Die Grundeinheiten des Gelelektrophoresesystems (siehe Materialtabelle). B) Gel-Imager mit Fotodokumentationssystem, bestehend aus einer CCD-Kamera, einer Kammer mit geeigneten Trans-/Beleuchtungslichtern und einem fotografischen Filter (siehe Materialtabelle). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Beladen des Gels mit verdünnten Proben und DNA-Größenstandardlösung oder RNase- und DNase-freiemH2Ofür leere Vertiefungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Analysen der qPCR HRM-Produkte zur Gelelektrophorese. Das Gel wurde einem UV-Transilluminator ausgesetzt. Das Bild wurde vom Fotodokumentationssystem aufgenommen (Abbildung 5B). Wellen von 1 bis 3 zeigen Kontrollen: 52 bp Deletion (Typ 1 Mutation), 5 bp Insertion (Typ 2 Mutation) und Wildtyp-Variante. Das Bandenmuster der unbekannten Proben in den Vertiefungen 4-10 weist auf sie als die genetische Variante des Wildtyps hin. Die M-Vertiefung stellt eine Standardlösung in verdünnter DNA-Größe (100 bis 2.000 bp) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: HRM- und Gelelektrophorese-Analysen der genetischen Varianten im CALR-Gen.  A) HRM-Analysen. Die ausgerichteten Schmelzkurven der Positivkontrollen mit 52 bp Deletion (Typ 1 Mutation), 5 bp Insertion (Typ 2 Mutation) und einem Wildtyp werden als orange, lila bzw. rot dargestellt. Die unbekannte Probe mit der unterschiedlichen genetischen Variante wird als dunkelblaue Farbe angezeigt. B) Gelelektrophorese-Analysen. Wellen von 1 bis 3 zeigen Kontrollen: 52 bp Deletion (Typ 1 Mutation), 5 bp Insertion (Typ 2 Mutation) und Wildtyp-Variante. Das Bandenmuster der unbekannten Probe in der Bahn 9 weist auf die unterschiedliche genetische Variante als Kontrollen hin. Andere unbekannte Proben sind die Wildtyp-Variante. Die M-Vertiefung stellt die Verdünnte-DNA-Größenstandardlösung (100 bis 2.000 bp) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Die Nachweisgrenze des HRM-Assays. Eine serielle Verdünnung einer Probe einer 52-bp-Deletion (Typ-1-Mutation) und einer 5-bp-Insertion (Typ-2-Mutation) wird vorgestellt, die eine genetische Varianten-Allellast von etwa 50% gemäß der Sanger-Sequenzierungsanalyse und dem qPCR-HRM-Assay gemäß dem in diesem Artikel beschriebenen Protokoll aufweist. A) und B) zeigen die ausgerichteten Schmelzkurven und Differenzdiagramme für Wildtyp- und Serielle Verdünnungen einer 52 bp-Deletion (Typ-1-Mutation). C) und D) zeigen die ausgerichteten Schmelzkurven und Differenzdiagramme für Wildtyp- und Serielle Verdünnungen einer 5 bp Insertion (Typ-2-Mutation). In beiden Fällen konnte die GENETISCHE VARIANTE CALR in einer Verdünnung von bis zu 1,56% nachgewiesen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das hochauflösende Schmelzen von DNA ist eine einfache Lösung für die Genotypisierung und das Scannen genetischer Varianten14. Es hängt von Sequenzunterschieden ab, die zu Heteroduplexen führen, die die Form der Schmelzkurve verändern. Verschiedene Arten von genetischen Varianten mit unterschiedlichen Häufigkeiten können in dem Gen beobachtet werden, das für eine bestimmte Gruppe von Patienten mit Krebsspezifisch ist 1,2,15,16,10. Deletionen oder Insertionen in das interessierende Gen können durch die HRM-Analyse nachgewiesen werden, wie wir in Abbildung 4Agezeigt haben. Bei der Implementierung des qPCR-HRM-Assays in die Routineuntersuchung haben wir eine erste Evaluierungsstudie mit 21 JAK2 V617F-negativen ET-Patienten mit einem medianen Alter von 63 Jahren (Bereich von 24 bis 90 Jahren) durchgeführt. Eine genetische Variante im CALR-Gen wurde bei 12 von 21 JAK2 V617F-negativen ET-Patienten nachgewiesen (Anteil 0,57). Eine 52 bp Deletion (Typ 1 Mutation) wurde bei 9 von 21 (Anteil 0,43) nachgewiesen, eine 5 bp Insertion (Typ 2 Mutation) wurde bei 3 von 21 (Anteil 0,143) JAK2 V617F-negativen ET Patienten nachgewiesen. Die Ergebnisse stimmen mit den Daten aus der Literatur1,2,17überein.

Eine zuverlässige Identifizierung genetischer Varianten durch HRM-Analyse kann durch die richtige Assay-Entwicklung erreicht werden, die sicherstellt, dass das Experiment für HRM optimiert ist. Andere Faktoren als die Sequenz können eine Quelle für kleine Unterschiede in den HRM-Kurven sein, wie Primerdesign, Amplikonlänge, Farbstoffauswahl, Wahl des qPCR-HRM-Reagenzes sowie Temperatur- und Zeitprofile der qPCR-HRM-Schritte. Dies ist der Teil der sehr frühen Entwicklung und Optimierung des qPCR HRM Assays und wurde bereits an anderer Stellediskutiert 12,14,18. Eine zuverlässige Identifizierung genetischer Varianten im CALR-Gen mit vergleichbarer Sensitivität der Assays konnte jedoch auf verschiedenen HRM-Plattformen unter Verwendung derselben Primersequenzen erreicht werden19. Der kritischste Punkt im Optimierungsprozess des qPCR HRM Assays war die Optimierung der Schmelz- und Dehnungstemperatur im qPCR-Schritt des qPCR HRM Assays. Für den HRM-Schritt12war keine Modifikation erforderlich. In der Routineprüfung werden andere Faktoren, die die HRM-Ergebnisse beeinflussen, wichtiger zu befolgen.

Hochwertige DNA, resuspendiert in einem salzarmen Puffer wie TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA oder niedrigere Konzentration) und die gleiche Menge an DNA im qPCR HRM Assay sind wichtige Faktoren für eine erfolgreich amplierte DNA-Region von Interesse mit einem hohen Signalplateau in der qPCR-Amplifikationsphase (Abbildung 2). Dies führt zu einer zuverlässigen Identifizierung genetischer Varianten durch HRM-Analyse (Abbildung 4A,4B)12,14. Ein salzreicher Puffer, der für die Elution von DNA im Extraktionsprotokoll verwendet wird, kann die Thermodynamik des DNA-Schmelzübergangs subtil verändern. Fällung und Resuspension in salzarmem Puffer TE oder Verdünnung der Probe können das Problem der Verunreinigungen in der DNA-Probe lösen. Minderwertige DNA kann unspezifische PCR-Produkte oder fehlgeschlagene Amplifikation erzeugen. All dies kann zu einer geringeren Reproduzierbarkeit und einer höheren Fehlerquote bei der HRM-Variantenerkennung führen. Zusätzliche Optimierungen für die anspruchsvollen Proben wie DNA, die aus paraffin-eingebetteten Proben extrahiert wurde, könnten erforderlich sein, um ein optimales HRM-Ergebnis zu erhalten15.

Große Unterschiede in der DNA-Menge, die im qPCR-HRM-Assay verwendet wird, können sich auf die resultierende Schmelztemperatur (Tm) auswirken und folglich zu nicht schlüssigen Ergebnissen führen. Daher sind die genaue Bestimmung der DNA-Konzentration und verdünnung aller DNA-Proben obligatorisch20. Ultraviolette (UV) Absorptions- und Fluoreszenzfärbungsmethoden bestimmen genau die Konzentrationen hochreiner DNA-Lösungen21. Die UV-Absorptionsmethode könnte zur Bewertung der Reinheit der DNA-Lösungen verwendet werden, indem Verhältnisabsorptionsmessungen bei A260/A280 und A260/230 durchgeführt werden. Die fluoreszierende Färbemethode ist jedoch empfindlicher gegenüber dem Abbau von DNA als die UV-Absorptionsmethode und kann die DNA-Konzentration genauer bestimmen21. Daher ist es besser geeignet für die Standardisierung der Quantifizierung und Verdünnung aller DNA-Proben in der HRM-Analyse20,21.

Die Indels sind die wichtigsten genetischen Varianten im CALR-Gen, die bei MPN-Patienten beobachtetwurden 1. Wenn sich die Produktlänge ändert und zunimmt, wird der Unterschied zwischen Wildtyp- und Heterozygotenkurven kleiner und die Variantenerkennung wird schwieriger7. Daher sollte eine zusätzliche Methode zur Abklärung einer solchen genetischen Variante verwendet werden.

Ein gutes Beispiel ist die Agarosegelelektrophorese. Dies ist eine einfache und effektive Methode, um DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe zu trennen22,23. DNA-Moleküle werden innerhalb des Agarosegels nach Größe getrennt, so dass die zurückgelegte Strecke umgekehrt proportional zum Logarithmus seines Molekulargewichts24ist. Abbildung 4A, Abbildung 4B und Abbildung 7 zeigen Beispiele, bei denen die beiden häufigsten Arten von CALR-Genvarianten, 52 bp Deletion und 5 bp Insertion, durch kombination von qPCR HRM und Agarosegelelektrophorese Ergebnissen identifiziert werden. Wenn jedoch das HRM-Ergebnis und das Agarosegel-Elektrophorese-Bandenmuster auf eine andere genetische Variante (einschließlich Einzelnukleotidänderung) hinweisen wie bei den Kontrollen(Abbildung 8),ist immer noch eine Sanger-Sequenzierung erforderlich, um die genaue genetische Variante zu identifizieren10.

Ein niedriger Gehalt an somatischer genetischer Variante im CALR-Gen kann in der Probe des Patienten vorhanden sein, was eine Interpretation der qPCR-HRM-, Agarosegelelektrophorese- und Sanger-Sequenzierungsergebnisse anspruchsvoller macht, insbesondere an der Nachweisgrenze des Assays (Abbildung 9). Jede Schmelzkurvenformlinie, die sich von der des Wildtyps unterscheidet, zeigt die genetische Variante an, die in der Probe vorhanden ist. Die Sensitivität des qPCR-HRM-Assays ist niedriger als 5% (Abbildung 9 und Referenz19) und ist empfindlicher als die Sanger-Sequenzierungsmethode, deren Sensitivität 15-20%betrug 19. In diesen Fällen könnte die Deep-Sequencing-Methode der nächsten Generation angewendet werden, die größere Indels erkennt und das HRM-Ergebnis bestätigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die HRM-Analyse eine leistungsfähige Methode zur Genotypisierung und genetischen Variationsprüfung von somatischen genetischen Varianten im CALR-Gen ist. Die Identifizierung verschiedener Arten genetischer Varianten basiert hauptsächlich auf den Kontrollen, die im qPCR-HRM-Assay verwendet werden. Zuverlässigere Ergebnisse werden durch die Kombination der HRM-Ergebnisse mit Den Ergebnissen der Agarosegelelektrophorese erzielt. Im Falle von nicht schlüssigen Ergebnissen kann die Standard-Sanger-Sequenzierung oder eine noch empfindlichere Next-Generation-Sequenzierungsmethode verwendet werden, um die genetische Variante richtig zu identifizieren.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren danken allen akademischen Experten und Mitarbeitern des Spezialisierten Hämatologielabors, Abteilung für Hämatologie, Abteilung für Innere Medizin, Universitätsklinikum Ljubljana.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-Gel EX 4% Agarose Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific 4415440 Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4346907
MicroAmp Optical adhesive film Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4311971
NuGenius Syngene NG-1045 Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51306 DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32856
QUBIT dsDNA HS assay Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder Invitrogen, Thermo Fischer Scientific 10488058 Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4453534
Water nuclease free VWR, Life Science 436912C RNase, DNase and Protease free water

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Genetics High resolution melting analysis fluorescence-based quantitative real-time polymerase chain reaction genetic variant pre-cast agarose gel electrophoresis indel somatic mutation heteroduplex scanning CALR
Genetischer Variantennachweis im <em>CALR-Gen</em> mittels hochauflösender Schmelzanalyse
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