Summary
높은 플랫폼은 제한없이 쥐를 고치고 침술 조작 중에 뒷면의 궤점을 완전히 노출 할 수 있습니다. 이 문서는 높은 플랫폼의 제조 방법을 설명하고, 천식의 쥐 모델을 설정하고 비침습적 및 실시간 전신 몸 플레티스마그래피 (WBP) 시스템을 사용하여 호흡 기능의 변화를 측정합니다.
Abstract
높은 플랫폼은 제한없이 쥐를 고치고 침술 조작 중에 뒷면의 궤점을 완전히 노출 할 수 있습니다. 이 문서는 높은 플랫폼의 제조 방법을 설명하고, 천식의 쥐 모델을 설정하고 비침습적 및 실시간 전신 몸 플레티스마그래피 (WBP) 시스템을 사용하여 호흡 기능의 변화를 측정합니다.
Introduction
천식은 기관지 수축 및 기도 하이퍼 반응성1을특징으로 하는 만성 질환이다. 전 세계적으로 약 3억 3,940만 명이 천식2로진단된다. 천식의 보급은 앞으로 10년간 1억 개의 새로운 케이스가 예상되는3와 함께, 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 흡입된 코르티코 스테로이드및 장작동β 2-작용제는 모든 환자의 증상을 효과적으로 조절하지 않는다4. 따라서 천식을 치료하기 위해 침술과 같은 대체 요법의 사용은 주목을 받고 있다5. 천식 을 치료하기 위한 효과적인 방법은 바늘 GV14 (다즈후이), 양측 BL12 (펭멘) 및 양측 BL13 (Feishu)6이다. 침술은 알레르기 성 천식 환자의 타액 및 비강 분비물에서 분비 면역 글로불린 A (SIgA)의 수준을 현저히 감소시키고 총 유효률85%6의말초 혈액 호산구 수를 감소시킨다. 만성 천식을 가진 마우스의 BL13 및 ST36(Zusanli)의 침술은 IL-17의 수준을 40% 감소시키고, 배부안(OVA) 그룹의 그것에 비해 33% 경질근육 두께를 감소시키고, 따라서 염증현상을완화시키는7,8. 그러나 천식에 대한 침술 치료의 메커니즘은 완전히 명확하지 않습니다.
동물 모델은 천식 연구를 위한 중요한도구입니다9 동물 모델은 천식 치료의 효과를 평가하기 위해 호흡기 기능의 지속적인 측정에 사용될 수 있기때문이다(10) 한편, 천식의 병리생리학의 연구는 기관, 폐 및 기관지정맥용암의 샘플을 포함한 테스트 샘플을 요구하여 주요 요인11의수준에 변화를 확인한다. 천식의 쥐 모형은 오래 지속되는 기도 반응을 생성하고 즉각적이고 후기 단계기도 반응을 보여주기 때문에 천식 병리생리학을 평가하기 위하여 일반적으로 이용됩니다12. 그러나 반복되는 실험 자극으로 인해 쥐는 종종 짜증이 나게됩니다. 따라서 쥐를 고치는 적절한 방법이 필요합니다. 쥐 고정을 위해 일반적으로 사용되는 방법은 마취 및 결합13을포함한다. 마취 방법은 인큐포인트의 더 나은 노출을 제공하지만, 신경 전도에 영향을 미치고 궁극적으로 실험 결과에 영향을 미칠 수있습니다(14). 결합 방법은 마취와 같은 생리적 효과를 유도하지 않지만 절제 된 쥐는 골격 근육 긴장을 경험하게됩니다. 또한, 바늘은 지정된위치(15)에쉽게 도달할 수 없다. 여기에서는 쥐를 제한하지 않고 쥐를 고치고 뒷면의 통찰력사항을 완전히 노출시키는 데 사용할 수 있는 높은 플랫폼을 소개합니다. 쥐는 침술의 투여 중에 높은 플랫폼에 배치 될 수있다. 높은 플랫폼은 서있는 동안만 쥐를 수용 할 수 있으며, 지면에서 일정한 거리를 배치하기 때문에 랫트는높이 16의두려움 때문에 움직이지 않습니다.
이 문서에서는 높은 플랫폼의 제조, 천식의 쥐 모델의 확립, 높은 플랫폼에서 쥐를 필요로 하는 동작 및 전신 과자 (WBP) 시스템을 사용하여 호흡기 기능의 측정을 자세히 설명합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 상하이 전통 중국 의학 대학의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았습니다 (윤리적 허가 번호 PZSHUTCM190308020).
1. 높은 플랫폼의 제작
- 지지 장치의 길이와 폭을 86cm x 17cm(도1)로설정합니다.
- 연결 장치를 지원 장치에 수직으로 수정합니다. 연결 장치는 쥐가 높은 플랫폼의 상단 표면으로 실행되지 않도록 약 30cm 길이여야하며 폭이 14cm이어야합니다.
- 수평 페달(5cm x 5cm)을 연결 장치에 고정합니다. 수평 페달의 하단에 있는 정지된 높이는 50cm보다 크거나 같아야 합니다.
참고: 실험용 쥐의 수에 따라 여러 개의 수평 페달을 사용할 수 있으며 각 페달에 쥐 한 개를 배치할 수 있습니다.
2. 천식의 쥐 모델 의 설립
- OVA로 쥐를 민감화
- 0일째에 감도 화 솔루션을 준비합니다. 1 mg의 OVA와 10 mg의 알루미늄 수산화물로 감광 용액의 각 1mL을 제조하고 일반 식염수를 용매로 준비합니다.
- 0일째에 감세액의 1mL로 각 쥐를 내분하노라. 나중에 사용하기에 적합한 주사기로 감쇠 솔루션을 그립니다.
- 꼬리를 잡고 쥐를 들어 올리고 거친 표면에 놓고 꼬리를 부드럽게 당깁니다. 왼쪽 엄지 손가락과 검지 손가락으로 두 개의 귀를 잡고 손바닥나머지 세 손가락과 손바닥으로 뒤쪽 피부를 단단히 잡습니다 (쥐를 질식시키는 과도한 힘을 바르는 것을 삼가하십시오).
- 오른손으로, 감작용 1mL로 준비된 주사기를 쥐에 회대주사를 수행한다.
- OVA와 도전 쥐
- 뚜껑이 있는 상자를 선택하고(길이, 너비 및 높이는 39cm x 28cm x 23cm)를 선택하고 측면에 작은 구멍을 뚫습니다. 밀폐된 상자, 분무기 컵 및 압축 분무기를 고무튜브(보충 도 1)와연결합니다.
참고: 압축 분무기의 분무기 입자 크기는 1 -5 μm, 분무기 속도는 0.2 mL/min보다 크고, 궁극적인 압력은 205 kPa입니다. - 감작 후 14일에는 수제 밀봉 상자의 뚜껑을 열고 쥐를 상자에 넣고 (상자는 5 마리의 쥐를 수용 할 수 있음), 밀봉 된 상자를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다.
- 챌린지 솔루션을 준비합니다. 철저하게 혼합 300 일반 식염수의 30 mL와 OVA의 mg.
- 초음파 분무기를 켜고 도전 용액의 30mL를 분무기 컵에 넣습니다. 도전 용액의 투여량과 수제 밀봉 상자의 부피에 따라 쥐수를 조정합니다.
- 성운을 여러 번 반복 (하루에 한 번) 또는 천식 증상의 심각도에 따라 절차를 조정.
- 뚜껑이 있는 상자를 선택하고(길이, 너비 및 높이는 39cm x 28cm x 23cm)를 선택하고 측면에 작은 구멍을 뚫습니다. 밀폐된 상자, 분무기 컵 및 압축 분무기를 고무튜브(보충 도 1)와연결합니다.
3. 침술 치료
- 천식 치료를 위한 중국 전통 의학이론에 따라 GV14, 양측 BL12 및 양측 BL13을 포함한 통찰력을 선택한다(보조도 2). 2일째에 수동 침술을 관리하고 총 7회(그림 2)를위해 격일로 한 번수행한다.
- 침술 GV14는 일곱 번째 자궁 경부 척추와 첫 번째 흉부 척추 (견갑골의 중공) 사이의 위치, 뒤쪽의 중간선에(도 3).
- 물컵 BL13 세 번째 흉부 척추 아래에 위치한, 늑간 공간의 양쪽에 (견갑골의 아래 가장자리).
- 침술 BL12 두 번째 흉부 척추 아래에 위치한, 늑간 공간의 양쪽에 (견갑골 아래, BL13에 따라 식별 위치).
- 쥐를 잡고 높은 플랫폼에 배치합니다.
- 일회용 스테인레스 스틸 바늘(0.3mm x 13.0 mm, 보충 도 3)은오른손의 엄지손가락과 검지 손가락으로 손잡이를 잡고 오른손의 손바닥으로 쥐의 뒷면을 누릅니다.
참고: 일회용 바늘은 일회용 일만 사용해야 합니다. 반복 된 사용은 쥐에 있는 증가한 고통으로 이끌어 내는 바늘을 무디게 하기 때문에. - 상부 가장자리(GV14) 또는 견갑골의 하부 가장자리(BL12 및 BL13)의 중간에서 우울증을 터치한 다음 바늘 끝으로 쥐의 피부를 부드럽게 찌르면 아큐포인트를 찾습니다.
- 인큐포인트의 특정 위치를 결정한 후 바늘을 신속하게 삽입하고 오른손을 빠르게 제거합니다.
- 바늘을 10-20s의 60배/분 비율로 약 360°로 고르게 꼬고, 5분마다 조작한 다음 20-30분(보충도4)후에바늘을 철회합니다.
4화 펜 측정
- 메타콜린 준비: 100 mg의 메타콜린을 5mL 원심분리기 튜브에 넣고 PBS를 2mL(50 mg/mL 메타콜린)의 부피에 추가합니다. 다음, 희석 50 mg/mL 메타 콜린 솔루션 25 mg/mL, 12.5 mg/mL, 6.25 mg/mL 및 3.125 mg/mL.
- 계측기 검사
- 신호 증폭기(에어로졸 분배 시스템 및 설치류 바이어스 흐름 공급 시스템이 모두 꺼져 있고 분기 커넥터가 닫힙니다)를 켭니다.
- 채널 확인: 보정을클릭하고 거친 조정 기준을 0으로 반환하고 직접 전류(DC) 위치로 전환합니다. 기준선을 0으로 미세 조정하고 주사기로 5mL의 가스를 주입합니다. 그런 다음 교대 전류(AC) 위치로 전환합니다.
- 채널을 확인한 후 오류 값이 0.5% 미만인지 확인합니다.
- 매개 변수 설정
- 에어로졸 분배 시스템과 설치류 바이어스 흐름 공급 시스템을 켭니다. 수은공의 액체 수준에 따라 유량을 4.5mL로 조정합니다.
- 연구 옵션 만들기를 클릭하고 용량 응답 연구를선택하고 종의 쥐를 선택하고 다음을 클릭합니다.
- 간단한 복용량 목록을선택, 용량의 수를 설정 6 다음을클릭 .
- 펜 및 영역 매개 변수 선택: 동물 적응 시간을 5분으로 설정하고, 분기화 시간을 2분으로 설정하고, 응답 시간을 3분으로 설정하고, 복구 시간을 2분으로 설정합니다.
- 분무기에 다음과 같은 솔루션을 순차적으로 추가 (쥐 당 200 μL): methacholine (0 mg/mL, 3.125 mg/mL, 6.25 mg/mL, 12.5 mg/mL, 25 mg/mL 및 50 mg/mL). 펜의 실시간 변화를 관찰할 수있다(도 4).
- 농도가 다른 6개의 솔루션이 모두 반응한 후 파일 및 종료 세션을 클릭하여 실험을 완료합니다.
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Representative Results
GV14, 양자 BL12 및 양자 BL13 포인트의 침술로 쥐는 경향이있는 위치를 유지합니다. 한 방향이 나무 판으로 막혔기 때문에 쥐는 머리를 외부가 아닌 외부로만 비틀 수있습니다(그림 5).
메타콜린 농도가 증가함에 따라 펜은 증가 추세와 성장률이 점차 증가합니다. 농도 3.125 mg/mL, 6.25 mg/mL, 12.5 mg/mL, 25 mg/mL 및 50 mg/mL, 펜은 18.40% ± 10.70%, 27.55% ± 26.30%, 88.10% ± 45.63%, 427.60% ± 172.92%, ± 121.97% 증가(672.92%)를 나타냈다.
그림 1. 높은 플랫폼의 제작. 높은 플랫폼은 지원 장치, 3개의 연결 장치 및 3개의 페달로 구성됩니다. 지지 장치의 길이와 폭은 86cm x 17cm, 연결 장치의 길이와 폭은 30cm x 14cm, 페달의 길이와 너비는 5cm x 5cm이다. 각 연결 장치는 20cm로 구분됩니다.
그림 2. 천식의 쥐 모형을 설치하기 위한 프로토콜. 감광은 0일째에 수행되며, 침술은 2일부터 14일까지 높은 플랫폼에서 격일로 수행됩니다. 도전 후, 펜의 변화는 측정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. GV14 (Dazhui), BL12 (풍멘)및 BL13 (Feishu)의 해부학적 위치가 쥐에 있습니다. (A)견갑골, 제1 갈비뼈, 제2 갈비뼈, 세 번째 갈비뼈 및 두 번째 흉부 척추 (T2)를 나타내는 쥐의 뒤쪽의 해부학 적 해부. (B)갈비뼈와 흉부 척추의 적기. (C)견갑골의 단면. (D)GV14: 견갑골의 빈, 뒷면의 중간선에 위치; BL13: 견갑골의 아래쪽 가장자리에 위치; BL12: BL13에 따라 위치, 견갑골 아래에 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 호흡기 기능의 실시간 변화. 파란색 곡선은 Penh의 실시간 변화를 보여줍니다. 녹색 곡선은 특정 기간 동안 조수 체적(TVb)의 총 변화를 보여줍니다. 보라색 곡선은 특정 기간 동안 Penh의 총 변화를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. GV14 (Dazhui), BL12 (펑멘)및 BL13 (Feishu)의 침술은 높은 플랫폼에 쥐에서. (A)쥐의 GV14, BL12 및 BL13의 위치의 최고 보기. (B)높은 플랫폼에서 침술된 쥐의 측면 보기. 쥐는 플랫폼에 배치되고 침술 중에 경향이있는 위치에 유지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 펜의 측정. WBP는 일반 쥐의 펜을 측정하는 데 사용됩니다. 메타콜린의 농도가 증가함에 따라 펜도 점차 증가합니다. 데이터는 SEM(n = 3)± 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1. 분무기 사양. 압축 분무기의 분무기 입자 크기는 1 -5 μm, 분무기 속도는 0.2 mL/min보다 크고, 궁극적 인 압력은 205 kPa입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2. GV14 (다즈후이), BL12(펑멘)및 BL13 (Feishu)의회로도 위치는 쥐에서.
보충 도 3. 바늘 사양. 바늘의 길이는 13mm이고 직경은 0.3 mm입니다.
보충 도 4. 침술 조작의 회로도. 바늘을 삽입 한 후, 다른 방향으로 약 360 ° 바늘을 고르게 비틀었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서 사용되는 GV14, 양측 BL12 및 양측 BL13 acupoints는 뒷면에 위치하므로 높은 플랫폼은 쥐를 고정하는 데 적합합니다. 다른 연구에서는, 적절한 고정 방법은acupoints(15)의위치에 따라 선택되어야 한다. 복부에 대한 acupoints의 경우, 쥐는 검은 콘 (제빵사에 의해 사용되는 페이스트리 가방과 유사)17에아래쪽으로 배치 할 수 있습니다. 고정을 위해 구속원뿔에 체인이 부착되고 쥐의 뒷다리도 고정됩니다. 이런 식으로, 동물의 몸의 전면은 원뿔에 단단히 고정되고 복부와 뒷면이 노출됩니다. 다리의 acupoints의 경우, 쥐는 특별한 투명 양동이에 수직으로 배치 할 수 있습니다, 자연스럽게 양동이 외부 꼬리와 뒷다리를 떠나(18. 투명 배럴은 쥐의 몸을 덮지만 다리침에 편리합니다.
이러한 메서드를 수행할 때는 몇 가지 중요한 단계를 고려해야 합니다. 침술 처리 전에, 쥐는 쥐가 조용히 유지하고 높은 플랫폼에서 원활하게 호흡 할 때까지 며칠 동안 훈련을위한 높은 플랫폼에 배치해야합니다. 침술 조작의 경우 오른손의 손바닥이 쥐를 다시 누르기 가 어렵고 바늘을 삽입하기가 더 쉽습니다. 호흡기 기능 측정을 위해, WBP 시스템은 비침습적 방식으로 쥐의 폐 저항의 변화를 반영하고 심리적 스트레스19,20의효과를 최소화하는 펜의 변화를 측정한다. 쥐에 대한 외부 환경의 영향을 최소화해야 합니다. 쥐는 시험실에 배치한 다음 외부 환경으로 인한 자극을 줄이기 위해 비닐 봉지(환기를 위해 등쪽1cm x 1cm 구멍)로 시험실을 덮어야 합니다.
이 실험의 한계는 쥐가 침술 중에 흔들리면 바늘이 떨어질 수 있다는 것입니다. 따라서 깊이를 조정하려면 5분마다 필요를 조작해야 합니다. 또한, 높은 플랫폼은 쥐에 적합하지만, 마우스와 같은 작은 동물에게는 적합하지 않다.
요약하자면, 침술 중에 제한없이 쥐를 고정하기위한 높은 플랫폼의 제조 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 높은 플랫폼은 쥐 의 뒷면에 있는 통찰력사항을 완전히 노출시킬 수 있습니다. 높은 플랫폼 및 비침습적 호흡 기능 측정의 사용은 천식에 대한 치료로서 침술의 분석을 용이하게 할 수 있다. 뒷면에 침술의 치료 메커니즘을 연구 천식과 만성 폐쇄성 폐 질환과 같은 호흡기 질환에 새로운 치료를 가져올 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81922076호, 81973951, 81873373), 상하이 공동혁신 사업(No. ZYJKFW20181101010, ZYJKFW201701005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
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