Summary
Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.
Abstract
Os cânceres colorretais são caracterizados pela heterogeneidade e uma organização hierárquica composta por uma população de células-tronco cancerígenas (CSCs) responsáveis pelo desenvolvimento do tumor, manutenção e resistência aos fármacos. Uma melhor compreensão das propriedades do CSC para seu direcionamento específico é, portanto, um pré-requisito para uma terapia eficaz. No entanto, há uma escassez de modelos pré-clínicos adequados para investigações aprofundadas. Embora as linhas de células cancerígenas in vitro bidimensionais (2D) forneçam insights valiosos sobre a biologia tumoral, elas não replicam a heterogeneidade fenotípica e genética do tumor. Em contraste, modelos tridimensionais (3D) abordam e reproduzem a complexidade do câncer quase fisiológico e a heterogeneidade celular. O objetivo deste trabalho foi projetar um sistema de cultura 3D robusto e reprodutível para estudar biologia CSC. A presente metodologia descreve o desenvolvimento e otimização das condições para a geração de esferoides 3D, que são homogêneos em tamanho, a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2, modelo que pode ser utilizado para a cultura de longo prazo. É importante ressaltar que, dentro dos esferoides, as células que se organizavam em torno de estruturas semelhantes ao lúmen, foram caracterizadas por padrões diferenciais de proliferação celular e pela presença de CSCs expressando um painel de marcadores. Esses resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação desta abordagem 3D para estudar heterogeneidade celular e biologia CSC, incluindo a resposta à quimioterapia.
Introduction
O câncer colorretal (CRC) continua sendo a segunda principal causa de mortes associadas ao câncer no mundo1. O desenvolvimento do CRC é resultado de uma progressiva aquisição e acúmulo de mutações genéticas e/ou alterações epigenéticas2,3, incluindo a ativação de oncogenes e a inativação dos genes supressores tumorais3,4. Além disso, fatores não genéticos (por exemplo, o microambiente) podem contribuir e promover a transformação oncogênica e, assim, participar da evolução dos CRCs5. É importante ressaltar que os CRCs são compostos por diferentes populações celulares, incluindo CSCs indiferenciados e células tumorais a granel exibindo alguns traços de diferenciação, que constituem uma estrutura hierárquica que lembra a organização do epitélio em uma cripta normal de cólon6,7.
Os CSCs são considerados responsáveis pela aparência do tumor8,sua manutenção e crescimento, capacidade metastática e resistência às terapias convencionais6,7. Dentro dos tumores, as células cancerígenas, incluindo os CSCs, apresentam um alto nível de heterogeneidade e complexidade em termos de seus distintos perfis mutacionais e epigenéticos, diferenças morfológicas e fenotípicas, expressão genética, metabolismo, taxas de proliferação e potencial metastático9. Portanto, para entender melhor a biologia do câncer, a progressão do tumor e a aquisição da resistência à terapia e sua tradução para tratamentos eficazes, modelos pré-clínicos humanos que capturam essa heterogeneidade e hierarquia do câncer são importantes10,11.
As linhas in vitro de células cancerígenas 2D têm sido usadas há muito tempo e fornecem insights valiosos sobre o desenvolvimento do tumor e os mecanismos subjacentes à eficácia das moléculas terapêuticas. No entanto, sua limitação em relação à falta da heterogeneidade fenotípica e genética encontrada nos tumores originais é agora amplamente reconhecida12. Além disso, nutrientes, oxigênio, gradientes de pH e o microambiente tumoral não são reproduzidos, sendo o microambiente especialmente importante para a manutenção de diferentes tipos celulares, incluindo CSCs11,12. Para superar essas principais desvantagens, vários modelos 3D foram desenvolvidos para abordar experimentalmente e reproduzir a complexidade e heterogeneidade dos cânceres. Com efeito, esses modelos recapitulam a heterogeneidade celular tumoral, interações células celulares e arquitetura espacial, semelhantes às observadas in vivo12,13,14. Os organoides tumorais primários estabelecidos a partir de tumores frescos, bem como esferoides derivados de linhas celulares, são em grande parte empregados15,16.
Esferoides podem ser cultivados de uma maneira livre de andaimes ou baseados em andaimes para forçar as células a se formarem e crescerem em agregados celulares. Os métodos livres de andaimes baseiam-se na cultura das células em condições não aderentes (por exemplo, o método de queda suspensa ou placas de fixação ultra-baixas), enquanto os modelos baseados em andaimes dependem de biomateriais naturais, sintéticos ou híbridos para células culturais12,13,14. Os esferoides à base de andaimes apresentam diferentes desvantagens, pois a formação final de esferoides dependerá da natureza e composição do (bio)material utilizado. Embora os métodos esferoides livres de andaimes disponíveis até agora não dependam da natureza do substrato, eles geram esferoides que variam em estrutura e tamanho17,18.
Este trabalho teve como objetivo projetar um robusto e reprodutível sistema de cultura 3D de esferoides, que são homogêneos em tamanho, composto por células de adenocarcinoma de cólon caco2 para estudar biologia CSC. As células caco2 são de particular interesse devido à sua capacidade de diferenciar ao longo do tempo19,20, sugerindo fortemente um potencial semelhante a uma haste. Assim, a cultura de longo prazo dos esferoides revelou a presença de diferentes populações de CSC com diferentes respostas à quimioterapia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Os detalhes de todos os reagentes e materiais estão listados na Tabela de Materiais.
1. Formação esferoide
- Mídia de cultura esféide
- Prepare o meio basal composto pelo DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco, complementado com dipeptida l-alanyl-L-glutamina de 4 mM.
- Prepare o MDM MÉDIO completo contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina (Pen/Estreptomicina) em meio basal a partir da etapa 1.1.1.
- Prepare o meio da matriz de membrana DMEM/porão contendo matriz de membrana de 2,5% no porão, 10% FBS e 1% Caneta/Estreptococos em meio basal a partir da etapa 1.1.1.
- Preparação de placas para formação de esferoides
- O meio de matriz de membrana basal quente e DMEM/porão em temperatura ambiente (RT) por aproximadamente 20 minutos.
- Pré-traça os poços de uma placa de 24 poços dedicada à formação de esferoides adicionando 500μL de solução anti-adesão para cada poço.
NOTA: Nestas placas, cada poço é composto por 1.200 microwells. - Centrifugar a placa a 1.200 × g por 5 min em um rotor de balde balançando com adaptadores para placas.
NOTA: Se apenas uma placa for usada, prepare uma placa padrão adicional cheia de água para contrabalançar o peso. - Enxágüe cada poço com 2 mL de meio basal quente e aspire o meio dos poços.
- Observe a placa sob o microscópio para garantir que as bolhas tenham sido completamente removidas dos microwells. Se as bolhas permanecerem presas, centrífuga novamente a 1.200 × g por 5 minutos para eliminar as bolhas.
- Repita as etapas de lavagem 1.2.4-1.2.5.
- Adicione 1 mL de matriz de membrana DMEM quente/porão para cada poço.
- Geração de esferoides
- Cultivar as células Caco2 em uma monocamada 2D em DMEM médio suplementado com 10% de FBS e 1% Caneta/Estreptococos a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 (doravante referido como 37 °C/5% CO2).
NOTA: O número máximo de passagens celulares a serem utilizadas é de 80. - Quando 80% da confluência for atingida, lave as células com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) 1x (5 mL para um prato de 10 cm), adicione o ácido tetraacético de trippsin-etilenodiamina (EDTA) (2 mL para um prato de 10 cm) e incuba por 2-5 min a 37 °C/5% CO2.
- Verifique o desprendimento celular sob o microscópio e neutralize a trippsina adicionando 4 mL de DMEM meio completo por prato de 10 cm.
- Conte células usando um hemócito para determinar o número total de células.
- Centrifugar a suspensão celular a 1.200 × g por 5 min. Descarte o supernasce e resuspenque a pelota em um volume apropriado de meio de matriz de membrana DMEM/porão.
- Consulte a Tabela 1 para determinar o número de células necessárias por poço para alcançar o número desejado de células por microwell. Alternativamente, calcule o número de células usando a seguinte fórmula para uma placa de 24 poços, considerando que cada poço contém 1.200 microwells
Número necessário de células por poço = Número desejado de células por microwell × 1.200 - Adicione o volume necessário da suspensão da célula a cada poço para alcançar o número de célula desejado em um volume final de 1 mL.
- Adicione 1 mL de matriz de membrana DMEM/porão média para cada poço para atingir o volume final de 2 mL por poço (veja também o passo 1.2.7).
NOTA: Tenha cuidado para não introduzir bolhas nos microwells. - Centrifugar a placa imediatamente a 1.200 × g por 5 minutos para capturar as células nos microwells. Se necessário, contrabalanceia a centrífuga com uma placa padrão cheia de água.
- Observe a placa sob o microscópio para verificar se as células estão distribuídas uniformemente entre os microwells.
- Incubar a placa a 37 °C/5% de CO2 por 48 h sem perturbar a placa.
NOTA: De acordo com o protocolo original21, embora muitas linhas celulares possam formar esferoides dentro de 24 horas, algumas requerem um tempo de incubação mais longo. Neste protocolo, 48 h são suficientes para a formação de esferoides.
- Cultivar as células Caco2 em uma monocamada 2D em DMEM médio suplementado com 10% de FBS e 1% Caneta/Estreptococos a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 (doravante referido como 37 °C/5% CO2).
- Colhendo os esferoides dos microwells
- Aqueça o meio da matriz de membrana basal e DMEM/porão em RT por aproximadamente 20 minutos.
- Utilizando uma pipeta sorológica, remova metade do meio de cultura (1 mL) de cada poço.
- Adicione o meio de volta à superfície do poço para desalojar os esferoides dos microwells.
NOTA: Não toque ou tritura os esferoides. - Coloque um coador reversível de 37 μm (ou um coador padrão de 40 μm) na parte superior de um tubo cônico de 15 mL para coletar os esferoides.
NOTA: Se usar um coador padrão de 40 μm, coloque-o de cabeça para baixo. - Aspire suavemente os esferoides desalojados (a partir da etapa 1.4.3), e passe a suspensão esferoide através do coador.
NOTA: Os esferoides permanecerão no filtro; células únicas fluirão através do meio. - Usando uma pipeta sorológica, dispense 1 mL do meio basal quente em toda a superfície do poço para desalojar quaisquer esferoides restantes e recuperá-los no coador.
- Repita esta etapa de lavagem 1.4.6 duas vezes.
- Observe a placa sob o microscópio para garantir que todos os esferoides tenham sido removidos dos microwells. Repita a lavagem se necessário (etapas 1.4.6-1.4.7).
- Inverta o coador e coloque-o em um novo tubo cônico de 15 mL. Colete os esferoides lavando o coador com meio de matriz de membrana DMEM/porão.
NOTA: Os esferoides coletados estão prontos para aplicações e análises a jusante.
- Cultura de longo prazo de esferoides
- Prepare a solução de 1,5% de agarose em meio basal e esterilize-a por autoclaving (ciclo padrão).
- Enquanto a solução agarose é quente e ainda líquida, cubra os poços de pratos ou pratos de cultura padrão, conforme descrito na Tabela 2.
NOTA: Aquecer o prato/prato no forno facilitará a etapa de revestimento. Pratos/pratos revestidos podem ser deixados na RT por até 10 dias em um ambiente estéril e protegidos da luz. - Sementes os esferoides colhidos (a partir da etapa 1.4.9) nas placas revestidas de agarose, e adicionem o meio de matriz de membrana DMEM/porão para alcançar o volume final, dependendo do tamanho da placa.
NOTA: Para evitar agregados eferóides, semeá-los na densidade ideal de 22 esferoides/cm2. Observe que o revestimento não é perfeitamente plano, e ele sobe em direção à borda, criando uma leve concavidade no centro da placa. Se o número de esferoides é muito alto, eles são mais propensos a aderir uns aos outros. - Incubar a placa a 37 °C/5% de CO2 até a recuperação dos esferoides para análises específicas.
- Tratamento de esferoides com quimioterapia
- Placas esferoides do passo 1.5.4, e plantá-los por 2 dias. A partir do dia 3 (D3), trate-os com FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 μg/mL; Irinotecan, 100 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL) ou com FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 μg/mL; Oxaliplatina, 10 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL) combinações de regime quimioterápico rotineiramente utilizado para tratar pacientes com CRC22,23,24,25, ou mantê-los em (controle) não tratado (NT).
- Colete os esferoides após 3 dias de tratamento usando uma pipeta com a ponta cortada (ponta de 1.000 μL), garantindo que cada condição seja representada por pelo menos três réplicas. Centrifuá-los a 1.000 × g por 3 min, e depois remover o supernante.
- Fixar as pelotas em 2% de paraformaldeído (PFA) para análise histológica (ver seção 3) ou usar as pelotas para extração de RNA (ver seção 4).
- Para analisar a morte celular, incubar os esferoides do passo 1.6.1 na cultura negra bem placas em DMEM/porão matriz de membrana média por 30 min com uma mancha de ácido nucleico (diluição 1:5000) que não permeia células vivas, mas penetra nas membranas comprometidas das células mortas26. Meça o acúmulo de fluorescência com um leitor de microplaca.
2. Monitoramento do crescimento de spheroid
- Utilizando um microscópio invertido, adquira imagens representativas de esferoides mantidos em diferentes condições ao longo dos dias na cultura.
- Analise as imagens medindo três diâmetros representativos diferentes de cada esferoide usando software apropriado.
- Use a seguinte fórmula para obter o volume estimado da esfera.
NOTA: Os termos, d1, d2 e d3, são os três diâmetros do esferoide.
3. Imunofluorescência (IF) e coloração histológica
- Fixação e incorporação de parafina
- Colete os esferoides em pontos de tempo selecionados usando uma pipeta com a ponta cortada conforme descrito na etapa 1.6.2, e fixe-os por 30 min em RT em 2% pfa.
NOTA: Alternativamente, armazene as amostras nesta etapa a 4 °C até que use mais. - Para incorporação de parafina, lave os esferoides 3x com PBS 1x e resuspensá-los em 70% de etanol. Após inclusão e secção de parafina, realize a coloração de hematoxilina & eosina (H&E) para análise histológica.
- Colete os esferoides em pontos de tempo selecionados usando uma pipeta com a ponta cortada conforme descrito na etapa 1.6.2, e fixe-os por 30 min em RT em 2% pfa.
- Imunolabelamento de seções de parafina
NOTA: Use seções de 5-μm de espessura para imunossão indireta.- Incubar lâminas a 60 °C por 2h para derreter a cera e melhorar a desparafinação.
- Lave os slides duas vezes por 3 minutos em metilciclone.
- Lave os slides por 3 min em 1:1 metilcicclohexano:100% etanol.
- Lave os slides duas vezes por 3 min em 100% etanol.
NOTA: Realize todas as manipulações para a etapa 3.2.2 para a etapa 3.2.4 em um capô químico. - Lave os slides por 3 min em 90% de etanol.
- Lave os slides por 3 min em 75% de etanol.
- Lave os slides por 3 min em 50% de etanol.
- Lave os slides sob a água da torneira.
- Reidratar os slides em água destilada por 5 minutos.
- Prepare 700 mL de tampão citrato de 0,01 M, pH 6.0, e adicione-o a um recipiente adequado (largura: 11,5 cm, comprimento: 17 cm, altura: 7 cm); submergir os slides nele. Aqueça o recipiente no micro-ondas por 9-10 min a 700 W, e quando a ebulição começar, diminua a potência para 400-450 W. Incubar por mais 10 minutos.
- Deixe os slides esfriarem no buffer para RT por aproximadamente 30-40 min.
- Lave os slides duas vezes em PBS por 5 minutos.
- Desenhe um círculo ao redor das seções com uma caneta marcadora para criar uma barreira para líquidos aplicados às seções.
- Incubar cada seção com 50 μL de tampão de bloqueio (10% soro de cabra normal, 1% albumina de soro bovino (BSA) e 0,02% Triton X-100 em PBS) por pelo menos 30 min na RT.
- Remova o tampão de bloqueio e adicione 50 μL de anticorpos primários diluídos no tampão de incubação (soro de cabra normal de 1%, 0,1% BSA e 0,02% Triton X-100 em PBS). Incubar por 2 h no RT ou durante a noite a 4 °C.
- Remova os anticorpos primários e lave os slides 3x em PBS por 5 minutos.
- Incubar os slides com 50 μL de anticorpos secundários fluorescentes diluídos no tampão de incubação por 1 h no RT.
- Remova os anticorpos secundários e lave os slides 3x em PBS por 5 minutos.
- Adicione 50 μL de meio de montagem com 4′,6-diamidino-2-fenilôdole em cada seção e coloque um deslizamento de vidro sobre a seção.
4. Extração de RNA, reação em cadeia de transcrição reversa-polimerase (RT-PCR) e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)
- Coletar esferoides em diferentes pontos de tempo, cada ponto representado por pelo menos três réplicas. Centrifuá-los a 1.000 × g por 3 min, e depois remover o supernante.
NOTA: As pelotas podem ser usadas diretamente para extração de RNA ou armazenadas a -20 °C até serem utilizadas posteriormente. - Isole o RNA total usando um kit comercial de isolamento de RNA, de acordo com as instruções do fabricante.
- Transcreva inversa 500 ng de cada amostra de RNA em DNA complementar (cDNA) com um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante.
- Após transcrição reversa, realize uma análise pcr em 1 μL de cDNA para amplificar um gene de limpeza com primers localizados em diferentes exons.
NOTA: Esta etapa permite a verificação da ausência de qualquer contaminação genômica de DNA nas preparações do RNA. Para este protocolo, foram utilizados primers de isomerase de peptidylprolyl B(PPIB). - Realize a amplificação qPCR em 4 μL de cDNA previamente diluída (1:10 em água dupla-destilada sem RNAse) usando primers específicos para os genes de interesse. Em cada amostra, quantifique a expressão específica de mRNA usando o método ΔΔCt e valores normalizados em relação aos níveis genéticos de limpeza.
NOTA: Para este protocolo, foi selecionado β-actin(ACTB). Os primers usados neste protocolo estão listados na Tabela 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Como a falta de homogeneidade no tamanho dos esferoides é uma das principais desvantagens dos sistemas de cultura 3D3D 13disponíveis atualmente, o objetivo deste trabalho foi criar um protocolo confiável e reprodutível para obter spheroids homogêneos. Primeiro, para estabelecer condições ideais de trabalho, foram testados diferentes números de células Caco2, variando de 50 a 2.000 células por microwell/esferoide utilizando placas dedicadas(Tabela 1). Com efeito, cada poço nessas placas contém 1.200 microwells, permitindo a formação do mesmo número de esferoides por bem, e, mais importante, a formação de um esferoide per microwell21. Após dois dias de cultura, os poços contendo 2.000 células por esferoide cresceram como uma monocamada, e 50 células por esferoide deram origem a pequenos e não homogêneos esferoides(Figura 1A). Essas duas condições foram, portanto, excluídas de análises posteriores. Para estabelecer culturas de longo prazo, os esferoides foram colhidos dos microwells e semeados em condições não aderentes em placas recém-preparadas revestidas de agarose. O crescimento esferoide foi então monitorado ao longo do curso experimental de tempo, medindo a mudança de volume. Para levar em conta a forma não esférica, foram medidos três diâmetros diferentes de cada esferoide, e a fórmula de volume foi aplicada27 (Figura 1B). Esferoides gerados a partir de 100 e 200 células mantiveram seu tamanho inicial durante todo o curso do experimento, enquanto aqueles que continham 1.000 células se desintegraram durante a colheita devido ao seu grande tamanho e, consequentemente, apresentaram mais variabilidade em seu volume. Portanto, como os esferoides provenientes de 500 células apresentaram o aumento mais homogêneo do tamanho ao longo do tempo experimental, esse número de células foi utilizado para a formação de esferoides.
Em segundo lugar, além de 500 células por esferoide, foram estudados números celulares adicionais que variam de 300 a 800 células. Além disso, para melhorar as condições não aderentes, o protocolo original foi modificado ao pré-tratar os poços duas vezes em vez de aplicar apenas uma lavagem. Observou-se melhora na homogeneidade e compactação esferoides com essas alterações (Figura 2A). O tamanho dos esferoides em cada condição foi medido no momento da colheita(Figura 2B),e seu crescimento a longo prazo foi monitorado ao longo dos dias na cultura em pratos revestidos de agarose(Figura 2C). Com base nos resultados, 500 e 600 células/esferoides foram confirmadas como as condições ideais que produzem bom crescimento e baixa variabilidade. Devido ao perfil de crescimento mais homogêneo ao longo do curso de tempo experimental e às estruturas compactas formadas, 600 células por spheroid foram selecionadas como número celular para experimentos subsequentes. Finalmente, para melhorar ainda mais o protocolo, o meio completo do DMEM foi complementado com 2,5% da matriz de membrana do porão, que contém fatores adicionais de crescimento e um grande painel de proteínas de matriz extracelular28. De fato, a forma multilobular dos esferoides pode ser devido à falta de sinais do microambiente que podem ter afetado a polarização celular29,30. A adição da matriz de membrana do porão aumentou o crescimento esferoide e melhorou sua homogeneidade(Figura 2D). Um exemplo dessa melhoria pode ser visto para 500 células por esferoide. Na ausência da matriz de membrana do porão(Figura 1B),o tamanho dos esferoides era mais heterogêneo, dobrando de D3 para D7 e depois atingindo um platô. No entanto, na presença da matriz de membrana do porão(Figura 2C),o tamanho dos esferoides em cada ponto de tempo era mais homogêneo, aumentando proporcionalmente ao longo do tempo.
Para analisar características de longo prazo dos esferoides, eles foram recuperados em diferentes momentos após a cultura em pratos revestidos de agarose para análises histológicas detalhadas e IF em seções de parafina. A coloração da H&E mostrou que as células dentro dos esferoides sofreram alterações em sua organização e forma ao longo do tempo. De fato, as células eram densamente dispostas em multicamadas na D3, enquanto as células achatadas dispostas em monocamadas eram claramente visíveis em D10. Curiosamente, como indicado pelas linhas pontilhadas pretas nas imagens, um lúmen apareceu dentro dos esferoides a partir de D5(Figura 3). Paralelamente, a proliferação celular e a apoptose foram analisadas pelo IF utilizando o marcador de proliferação, o antígeno nuclear de células proliferação (PCNA) e o marcador de morte celular, caspase ativada 3. A rotulagem para PCNA revelou que as células proliferadoras estavam frequentemente presentes na superfície externa dos esferoides, às vezes em estruturas semelhantes a criptas ou semelhantes a botões que lembram as culturas organoides15. Além disso, observou-se um claro aumento das células positivas do PCNA em D5 e D7 que diminuiu por D10 (Figura 4, painéis esquerdos). Surpreendentemente, o caspase 3 ativado foi observado em pouquíssimas células nos esferoides tanto na D3 quanto na D5(Figura 4, painéis esquerdos) e em períodos mais longos de tempo (dados não mostrados). O padrão de expressão de β-catenin também foi avaliado em seções de parafina. Curiosamente, altos níveis de expressão β-catenin foram observados em cada ponto de tempo com coloração clara ligada à membrana e citoplasmática(Figura 4, painéis à direita). Vale ressaltar que a β-catenin ligada à membrana participa da adesão celular-célula, vinculando-se à E-cadherin31. Um alto nível de rotulagem ß-catenin foi observado em aglomerados de células em todos os pontos de tempo. Em alguns casos, as células também apresentaram localização nuclear clara(Figura 4, painéis à direita). As células caco2 são conhecidas por diferenciar in vitro em 2D principalmente em enterócitos19,32. No entanto, a expressão de marcadores de diferenciação, como cromograna A (células enteroendócrinas), lysozyme (células paneth) ou mucina 2 (MUC 2, células de cálice), era indetectável nesses esferoides pelo IF (dados não mostrados). No entanto, foi confirmado o potencial de diferenciação em enterócitos, uma vez que os esferoides expressaram ALPI (fosfattase alcalina) e família portadora soluto 2, variante de transcrição 2(SLC2A5)/transportador de glicose 5(GLUT5) mRNAs(Figura 5). Estes níveis de mRNA aumentaram em D5 e D7, mas a diferença não foi significativa (ALPI) ou apenas marginalmente significante(SLC2A5) em comparação com os níveis em D3.
Com o objetivo final de definir se os esferoides gerados e cultivados com base neste novo método são uma ferramenta confiável para estudar CSCs, a expressão dos marcadores CSC foi analisada pelo IF e qRT-PCR. CD133 e CD44 caracterizam populações de células cancerígenas, incluindo CSCs7,33,34 e também são expressos por CCS no intestino normal e cólon33,34,35. Os clusters de células CD133 positivas foram localizados principalmente na superfície externa dos esferoides em cada ponto de tempo(Figura 6A, painéis esquerdos). As células CD44-positivas foram menos frequentes, mas sempre estiveram associadas a células CD133-positivas (Figura 6A, painéis à direita), indicando a existência de uma população de células CSC duplamente positivas CD133/CD44 e uma população expressando apenas CD133. Olfactomedin 4 (OLFM4) e Musashi 1 (MSI1) foram examinados como marcadores SC/CSC; esses marcadores são expressos de forma muito limitada nas criptas de cólon36,37 e também em populações celulares distintas35,38. Apenas algumas células MSI1 positivas foram observadas em cada ponto de tempo(Figura 7),enquanto o OLFM4 permaneceu indetectável (dados não mostrados). No entanto, como observado para CD44 e CD133, as células rotuladas por MSI1 estavam localizadas na superfície externa dos esferoides em estruturas semelhantes a criptas ou semelhantes a botões. Os mesmos marcadores também foram analisados no nível mRNA ao mesmo tempo após a cultura em pratos revestidos de agarose. Aldeído desidrogenase 1 (ALDH1a1), marcador bem caracterizado de CSCs39,40, também foi incluído no estudo (Figura 8). A análise de prominina-1 ( codificaçãoPROM1 para CD133) e CD44 mRNAs confirmou a expressão de ambos os marcadores em esferoides em todos os pontos de tempo analisados. Note-se, no entanto, enquanto os níveis de mRNA PROM1 foram bastante semelhantes ao longo do tempo na cultura, os níveis de CD44 diminuíram a partir de D3 em diante. A diferença, no entanto, foi apenas marginalmente significativa quando comparada com os níveis de mRNA de D10 e D3.
A análise do MSI1 mRNA confirmou sua expressão em esferoides em cada ponto de tempo, com níveis significativamente mais elevados em D3 e D5 em comparação com os de D7 ou D10(Figura 8),enquanto o OLFM4 mRNA não foi detectável (não mostrado). Finalmente, o mRNA ALDH1a1 foi expresso em esferoides em cada ponto de tempo e mostrou um perfil de expressão que diminuiu em D10, sendo os níveis apenas marginalmente significativos em comparação com os da D3(Figura 8). Para validar a adequação do novo modelo para estudar biologia celular cancerosa, a resposta à quimioterapia foi analisada em esferoides tratados com FOLFOX ou FOLFIRI, terapias combinadas rotineiramente administradas aos pacientes do CRC22,23,24,25. Primeiro, a eficácia dos tratamentos na indução da morte celular foi examinada pela incubação dos esferoides com uma mancha de ácido nucleico fluorescente que entra especificamente em células mortas26. Em comparação com a condição de NT de controle, o tratamento com cada um dos fármacos induziu morte celular significativa medida pelo acúmulo de fluorescência (Figura 9A). Esta observação também foi confirmada no nível morfológico utilizando microscopia viva, que mostrou que os tratamentos afetaram fortemente o tamanho e o aparecimento dos esferoides(Figura 9B). Por fim, a expressão dos marcadores SC/CSC foi analisada por qRT-PCR em esferoides nas mesmas condições(Figura 9C). Curiosamente, observou-se uma diminuição significativa dos níveis de PROM1 mRNA nas condições FOLFOX e FOLFIRI em comparação com os níveis de controle, enquanto os níveis de MSI1 não foram afetados pelos tratamentos. Além disso, enquanto o FOLFOX não teve efeito na expressão de MRNA ALDH1a1 em comparação com o controle, o tratamento com FOLFIRI aumentou significativamente seus níveis. Não foram detectados níveis de MRNA OLFM4 e os níveis de MRNA de CD44 foram extremamente baixos (dados não mostrados).
Figura 1: Configuração de culturas esferoides. (A) Formação esferoide iniciada a partir das concentrações indicadas das células de Caco2 per esferoid/microwell. O painel superior mostra uma imagem representativa de uma placa de cultura inteira após dois dias de cultura. O painel inferior mostra imagens de microwells selecionados por condição. As imagens foram tiradas em 4x de ampliação (tamanho microwell: 400 μm). Barras de escala: baixa ampliação, 100 μm; alta ampliação, 30 μm. (B) Características de crescimento dos esferoides gerados a partir de diferentes células por microwell e analisados em diferentes momentos. Note que os dias indicados incluem os dois primeiros dias de cultura nos microwells e a cultura subsequente dos esferoides colhidos em placas revestidas de agarose. Histogramas mostram ± desvio padrão médio, n = 4-6. Círculos negros mostram os valores para esferoides individuais. A fórmula para o volume estimado é mostrada na parte superior do painel, onde d1, d2 e d3 indicam os três diâmetros medidos para cada esferoide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Otimização das condições para formação e cultura esferoides. (A) Imagens representativas de esferoides na D7 após sua recuperação dos microwells (2 dias) e cultura em pratos revestidos de agarose (5 dias), utilizando novas condições médias de preparação e cultura de poços. Barra de escala: 30 μm. (B) Volume estimado dos esferoides recém-colhidos dois dias após o início da cultura celular nos microwells. Histogramas mostram desvio padrão ± médio (SD), n = 4-6. Círculos negros indicam o tamanho dos esferoides individuais. (C) Volume estimado dos esferoides na cultura de longo prazo com base nas condições recém-selecionadas. Os gráficos mostram as características de crescimento dos esferoides gerados a partir de diferentes células por esferoide e analisados em diferentes momentos após sua colheita, como indicado. Histogramas mostram ± média SD, n = 6-10. Círculos negros indicam o tamanho dos esferoides individuais. (D) Imagens representativas das 600 células escolhidas per esferoide em relação ao curso de tempo experimental (painéis à direita) e dentro dos microwells (painel esquerdo). As imagens foram tiradas na ampliação 4x. Barras de escala: baixa ampliação, 100 μm; alta ampliação, 30 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização histológica dos eferóides. Hematoxilina histológica e eosina (H&E) de manchas de parafina. Imagens representativas de esferoides nos pontos de tempo indicados após a colheita, como indicado. Linhas pontilhadas pretas em cada entrada de alta ampliação delimitam os lúmen dentro dos esferoides. Barras de escala: baixa ampliação, 30 μm; alta ampliação, 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Caracterização esferoide de Caco2 por imunolabeling. Imunostaining de esferoides para marcador de proliferação, proígeno de antígeno nuclear celular (PCNA, vermelho) e marcador de morte celular, caspase ativada 3 (verde) (painéis esquerdos) e para β-catenin (vermelho) (painéis à direita) nos horários indicados. As imagens mostram rotulagem mesclada de PCNA (vermelho), caspase ativada 3 (verde) e núcleos (azul) ou de β-catenin (vermelho) e núcleos (azul). Setas brancas apontam para células ou grupos de células expressando altos níveis de β-catenin. As imagens foram tiradas com um objetivo de 20x. Barra de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise dos marcadores de diferenciação de enterócitos por qRT-PCR. Análise das proteínas ALPI e SLC2A5, respectivamente. Histogramas mostram ± desvio padrão médio, n = 3, após a normalização contra actb. Os dados são representados como mudança de dobra em relação à mucosa de cólon normal (linha vermelha = 1). NS: não significativo; MS: marginalmente significativo comparado com d3 por t-testede aluno não remunerado. Abreviaturas: qRT-PCR = reação quantitativa de cadeia de transcrição reversa-polimerase; GLUT5 = transportador de glicose 5; SLC2A5 = família transportadora solute 2, variante de transcrição 2; ACTB = β-actin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Expressão heterogênea de marcadores de células-tronco, CD44 e CD133, nos esferoides. Imunostaining para os marcadores de células-tronco, CD133 e CD44, nos horários indicados. Imagens nos painéis esquerdos mostram rotulagem mesclada de CD133 (verde) e núcleos (azul); as mesmas imagens nos painéis certos mostram rotulagem mesclada de CD44 (vermelho) e núcleos (azul). As setas verdes nos painéis esquerdos apontam para células expressas por CD133, e setas brancas em ambos os painéis apontam para células ou grupos de células expressando CD44 e CD133. As imagens foram adquiridas com um objetivo de 20x. Barra de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Expressão heterogênea do marcador de células-tronco, MSI1, nos esferoides. Imunostaining para o marcador de células-tronco MSI1 (vermelho) nos horários indicados. As imagens mostram rotulagem mesclada de MSI1 (vermelho) e núcleos (azul). Linhas pontilhadas brancas sublinham algumas estruturas semelhantes a criptas onde as células são positivas para a imunolabelação MSI1. As imagens foram tiradas em ampliação de 20x. Barra de escala: 5 μm. Abreviação = MSI1 = Musashi 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Análise de marcadores de células-tronco por qRT-PCR. A quantificação dos níveis PROM1, CD44, MSI1 e ALDH1a1 foi realizada nos níveis mRNA dos esferoides nos horários indicados. Histogramas mostram ± desvio padrão médio, n = 3, após a normalização contra actb. Os dados são representados como mudança de dobra em relação à mucosa de cólon normal (linha vermelha = 1). NS: não significativo; MS: marginalmente significativo em comparação com a D3, usando o teste t-testdo aluno não remunerado. *: P < 0,05 em comparação com D3 ou D5, usando o t-testedo Aluno não remunerado. Abreviaturas: qRT-PCR = reação quantitativa de cadeia de transcrição reversa-polimerase; PROM1 = prominina-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldeído desidrogenase 1 alfa; ACTB = β-actin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Efeito da quimioterapia em esferoides. Após a colheita dos microwells, os esferoides foram cultivados em placas revestidas de agarose e tratados por 3 dias com FOLFOX ou FOLFIRI ou foram mantidos em condição (controle) não tratado (NT). (A) Análise da fluorescência devido à rotulagem de ácido nucleico em células mortas. Histogramas mostram desvio padrão ± médio (SD), n = 4. (B) Características morfológicas dos esferoides mantidos nas diferentes condições culturais. As imagens foram tiradas com um objetivo 4x. Barra de escala: 400 μm. (C) Quantificação de PROM1, MSI1 e ALDH1a1 mRNAs por qRT-PCR. Histogramas mostram média ± SD, n = 4, após a normalização contra actb. *: NS: não significativo; P < 0,05; **: P < 0,01; : P < 0,001 em relação à condição de controle (NT), utilizando o teste t doAluno não remunerado. Abreviaturas: FOLFOX = 5-Fluorouracil, 50 μg/mL; Oxaliplatina, 10 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL ; FOLFIRI = 5-Fluorouracil, 50 μg/mL; Irinotecan, 100 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL; qRT-PCR = reação quantitativa de cadeia de transcrição reversa-polimerase; PROM1 = prominina-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldeído desidrogenase 1 alfa; ACTB = β-actin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Número desejado de células por esferoide | Número necessário de células por poço |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1,2 x 105 |
| 200 | 2.4 x 105 |
| 300 | 3,6 x 105 |
| 400 | 4,8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7.2 x 105 |
| 700 | 8.4 x 105 |
| 800 | 9,6 x 105 |
| 1000 | 1.2 x 106 |
| 2000 | 2.4 x 106 |
Tabela 1: Resumo da formação esferoide e semeadura celular.
| Pratos de 10 mm | Placas de 6 poços | Placas de 12 poços | Placas de 24 poços | Placas de 96 poços | |
| Volume de revestimento | 4 mL | 300 μL | 250 μL | 150 μL | 50 μL (Down & Up) |
Tabela 2: Volumes de solução agarose para revestimento de diferentes pratos/pratos.
| Genes | Primers | seqüenciar | Comprimento do produto | |
| Marcadores de diferenciação | ALPI | encaminhar | CTG GTA CTC AGA TGC TGA CA | 81 |
| inverter | ATG TTG GAG ATG AGC TGA GT | |||
| SLC2A5 | encaminhar | TAC CCA TAC TGG AAG GAT GA | 94 | |
| inverter | AAC AGG ATC AGA GCA TGA AG | |||
| Marcadores de células-tronco | ALDH1a1 | encaminhar | GCC TTC ACA GGA TCA ACA GAG | 147 |
| inverter | TGC AAA TTC AAC AGC ATT GTC | |||
| MSI1 | encaminhar | AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA | 131 | |
| inverter | TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG | |||
| PROM1 | encaminhar | GTA AGA ACC CGG ATC AAA AGG | 131 | |
| inverter | GCC TTG TCC TTG GTA GTG TTG | |||
| CD44 | encaminhar | TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC | 160 | |
| inverter | TGA AGT GCT GCT CCT TTC ACT | |||
| OLFM4 | encaminhar | TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC | 118 | |
| inverter | ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT | |||
| Genes de limpeza | ACTB | encaminhar | CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C | 134 |
| inverter | AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T | |||
| PPIB | encaminhar | ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT | 100 | |
| inverter | GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG |
Tabela 3: Primers usados para transcrição reversa quantitativa reação em cadeia de polimerase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modelos 3D in vitro superam as principais desvantagens experimentais das culturas de células cancerígenas 2D, pois parecem ser mais confiáveis na recapitulação de características tumorais típicas, incluindo microambiente e heterogeneidade celular. Modelos 3D comumente usados de esferoides são livres de andaimes (cultivados em condições de baixa fixação) ou baseados em andaimes (usando biomateriais para células de cultura). Esses métodos apresentam diferentes desvantagens, pois dependem da natureza do andaime utilizado ou dão origem a esferoides que são variáveis em estrutura e tamanho.
O presente protocolo relata condições otimizadas para a produção de esferoides homogêneos da linha celular de cólon adenocarcinoma, Caco2, utilizando um método livre de andaimes. Os esferoides são facilmente colhidos e contrários a um estudo relatado anteriormente41, eles crescem com sucesso e suas características de crescimento durante o tempo na cultura também podem ser analisadas. Além disso, com esse novo método, os esferoides (a) proliferam ativamente, (b) apresentam uma taxa muito baixa de morte celular, (c) organizam-se para formar um lúmen dentro das esferas, e (d) exibem capacidade de diferenciação das células componentes. Dado que o objetivo final da nova abordagem foi o seu uso para estudos sobre biologia do CSC, a expressão de diferentes marcadores de CSCs foi analisada. Curiosamente, os marcadores apresentaram um padrão de expressão dinâmica dependendo do ponto de tempo e definiram diferentes populações de CSC.
De extrema importância, os esferoides gerados através deste protocolo poderiam ser utilizados para analisar medicamentos relevantes para aplicações clínicas como os regimes quimioterápicos, FOLFOX e FOLFIRI. Os resultados também sublinham uma resposta heterogênea das células aos medicamentos, dependendo do marcador CSC analisado. Esta observação é consistente com a visão atual de que populações de células heterogêneas e múltiplas semelhantes a CSC dentro dos tumores apresentam diversas propriedades de quimioensibilidade/chemoresistance42,43. Este achado potencializa fortemente a aplicabilidade deste novo método para triagem em larga escala. Além das aplicações relatadas neste estudo, o novo protocolo também pode ser usado para uma gama mais ampla de análises (por exemplo, extração de RNA e/ou DNA e análises em larga escala, manchas ocidentais e imunofluorescência). De fato, o volume de esferoides e características de crescimento pode ser facilmente determinado aplicando a fórmula de volume da esfera que, se necessário, também leva em consideração diferentes diâmetros para contrabalançar desvios de uma forma perfeitamente esférica. No entanto, parâmetros específicos devem ser otimizados dependendo do tipo de célula (linha celular ou culturas primárias frescas) e da capacidade de crescimento, como o tempo de replicação. No entanto, o protocolo indica passos críticos que podem ser facilmente ajustados.
Alguns pontos de preocupação precisam ser considerados na execução da geração esferoide descrita neste artigo. Em primeiro lugar, várias etapas de lavagem devem ser realizadas com a solução anti-adesão para promover a homogeneidade e compactação das esferas. Neste caso, duas lavagens eram necessárias. Em segundo lugar, as bolhas devem ser removidas dos microwells, pois isso pode perturbar a formação correta dos esferoides. Em terceiro lugar, uma vez que as células são semeadas em cada microwell após o passo de centrifugação, a placa deve permanecer intacta por dois dias. Considerações adicionais e mudanças no protocolo são necessárias ao estudar os primeiros passos da formação de esferoides, possivelmente incluindo um sistema automatizado de visualização e imagem. Em quarto lugar, mudar o meio sem perturbar os esferoides, dado que eles estão em suspensão, pode ser desafiador. Por isso, recomenda-se alterar apenas metade do volume cada vez. Em quinto lugar, ao colher os esferoides, é importante preservar sua estrutura. Assim, recomenda-se o uso de pipetas sorológicas ou micropipettos com as pontas cortadas para todas as etapas de dispensação após a lavagem em um meio de soro ou PBS para evitar que os esferoides adricarem as pontas.
Algumas limitações também podem ser encontradas ao usar este protocolo. Em primeiro lugar, nem todas as linhas celulares ou tipos de células têm os mesmos parâmetros de cultura; em alguns casos, a heterogeneidade celular e o número de passagens/envelhecimento das células também podem afetar a capacidade de formar esferoides. Em segundo lugar, contrariamente aos organoides, pode ser difícil manter esferoides por muito tempo na cultura. Além disso, eles não podem ser replicados por simples fragmentação através de uma dica de micropipette15. Em terceiro lugar, este protocolo não pode ser adaptado para análise de spheroid único porque recuperar manualmente esferoides um a um pode ser complicado. Esta técnica é mais adequada para obter altas quantidades de esferoides homogêneos ao mesmo tempo. Finalmente, para estudos que investigam os efeitos de fatores de crescimento originários de outros tipos celulares ou analisando a importância do microambiente, seria importante enriquecer o modelo e realizar experimentos de cocultura.
Em conclusão, a presente metodologia descreve um novo protocolo para gerar eficientemente e cultivar esferoides a partir de células Caco2. Os resultados demonstram que esse método pode ser aplicado ao estudo da heterogeneidade tumoral e à análise de CSCs. Este método também pode ser usado para o rastreamento de medicamentos de alto rendimento e o estudo da biologia de células-tronco em células cancerosas e células não cancerosas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar
Acknowledgments
Reconhecemos as plataformas de histologia de recherche de imagem e anipath (CRCL, CLB). Estamos em dívida com a farmácia do Hospital Centro Léon Bérard (CLB) pelo tipo presente do FOLFOX e FOLFIRI. Agradecemos também a Brigitte Manship pela leitura crítica do manuscrito. A obra contou com o apoio da FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) e do Inca (PLBIO19-289). A MVG e a LC receberam apoio da FRM e cf recebeu apoio da fundação ARC e do Centro Léon Bérard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
- Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
- Fearon, E. R.
- Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
- Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
- Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
- Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
- Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J.
- Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
- Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
- Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
- Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
- van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
- Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
- Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
- Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).
