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Biochemistry

एक Galectin-3 द्वारा Splicing गतिविधि के पूरक - मोती पर U1 snRNP परिसर

Published: December 9, 2020 doi: 10.3791/61990
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Summary

यह आलेख (ए) परमाणु अर्क से U1 snRNP की कमी के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन करता है, splicing गतिविधि के सहवर्ती नुकसान के साथ; और (ख) गैलेक्टिन-3 द्वारा U1-समाप्त अर्क में splicing गतिविधि का पुनर्गठन - U1 snRNP कणों को मोतियों के लिए बाध्य सहसंयोजक रूप से विरोधी गैलेक्टिन -3 एंटीबॉडी के साथ युग्मित।

Abstract

क्लासिक कमी-पुनर्गठन प्रयोगों से संकेत मिलता है कि गैलेक्टिन -3 परमाणु अर्क में एक आवश्यक स्प्लिसिंग कारक है। स्प्लिसिंग मार्ग में गैलेक्टिन -3 को शामिल करने के तंत्र को इस पेपर में संबोधित किया गया है। 12% -32% ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट पर हेला सेल परमाणु अर्क का अवसादन एक अंतर्जात ~ 10एस कण में समृद्ध अंशों को उत्पन्न करता है जिसमें गैलेक्टिन -3 और यू 1 एसएनआरएनएपी शामिल हैं। अब हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए splicing गतिविधि के सहवर्ती नुकसान के साथ U1 snRNP के परमाणु अर्क को कम करने के लिए. U1-समाप्त निकालने में splicing गतिविधि गैलेक्टिन-3 द्वारा पुनर्गठित किया जा सकता है - U1 snRNP कण agarose मोतियों पर फंसे सहसंयोजक विरोधी गैलेक्टिन -3 एंटीबॉडी के साथ युग्मित. परिणामों से संकेत मिलता है कि गैलेक्टिन -3 - U1 snRNP - प्री-एमआरएनए टर्नरी कॉम्प्लेक्स एक कार्यात्मक ई कॉम्प्लेक्स है जो मध्यवर्ती और स्प्लिसिंग प्रतिक्रिया के उत्पादों के लिए अग्रणी है और गैलेक्टिन -3 यू 1 एसएनआरएनएपी के साथ अपने सहयोग के माध्यम से स्प्लिसिंग मार्ग में प्रवेश करता है। एक विशिष्ट स्प्लिसिंग कारक के समाप्त होने वाले अर्क में स्प्लिसिंग गतिविधि को पुनर्गठित करने के लिए मोतियों पर जटिल आत्मीयता- या इम्यूनो-चयनित का उपयोग करने की योजना आमतौर पर अन्य प्रणालियों पर लागू हो सकती है।

Introduction

अधिकांश यूकेरियोटिक मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) के उत्पादन में एक परमाणु प्रक्रिया में इंट्रोन को हटाना और एक्सोन के बंधाव को शामिल करना शामिल है जिसे प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग 1 कहा जाता है। आरएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स (आरएनपी) के दो वर्ग पूर्व-मैसेंजर आरएनए के प्रसंस्करण को स्प्लिसोसोमल कॉम्प्लेक्स के माध्यम से परिपक्व एमआरएनए में निर्देशित करते हैं। एक वर्ग, नवजात पूर्व-दूत आरएनपी, विषम परमाणु आरएनपी प्रोटीन और अन्य आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के बंधन द्वारा सह-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से बनाया जाता है, जिसमें एसआर परिवार के कुछ सदस्य शामिल हैं, जो एचएनआरएनपी कॉम्प्लेक्स 2 की उपज देते हैं। दूसरी श्रेणी, यूरासिल-समृद्ध छोटे परमाणु आरएनपी (U1, U2, U4, U5, और U6 snRNAs के साथ U snRNPs) यू-विशिष्ट और कोर प्रोटीन 3,4 के साथ जुड़ा हुआ है। यू snRNPs एक गतिशील remodeling मार्ग में पूर्व मैसेंजर RNPs के विशिष्ट क्षेत्रों के साथ एक आदेशित फैशन में बातचीत के रूप में introns excised रहे हैं और exons परिपक्व mRNPs5 का उत्पादन करने के लिए ligated रहे हैं. कई अतिरिक्त परमाणु प्रोटीन इन प्रसंस्करण घटनाओं में भाग लेते हैं6।

गैलेक्टिन -1 (Gal1) और गैलेक्टिन -3 (Gal3) दो प्रोटीन हैं जो स्प्लिसिंग मार्ग में आवश्यक कारक हैं जैसा कि कमी-पुनर्गठन अध्ययन7,8 द्वारा दिखाया गया है। सक्षम परमाणु अर्क (एनई) को स्प्लिसिंग से दोनों गैलेक्टिन को हटाने से स्प्लिसोसोम असेंबली और स्प्लिसिंग गतिविधि को शुरुआती चरण में समाप्त कर दिया जाता है। इस तरह के दोगुने समाप्त एनई में या तो गैलेक्टिन के अलावा दोनों गतिविधियों को बहाल करता है। Gal1 और Gal3 सक्रिय spliceosomes के घटक हैं जैसा कि पूर्व-mRNA के विशिष्ट immunoprecipitation, splicing intermediates, और परिपक्व mRNA द्वारा या तो Gal1 या Gal39 के लिए विशिष्ट एंटीसीरम द्वारा प्रमाणित है। महत्वपूर्ण रूप से, Gal3 अंतर्जात U snRNA के साथ सहयोग करता है जिसमें splicing pathway के बाहर NE में कण होते हैं, जैसा कि एंटी-Gal3 antisera10 द्वारा snRNPs की वर्षा द्वारा दिखाया गया है। अंत में, हेला कोशिकाओं में Gal3 की चुप्पी कई जीन11 के splicing पैटर्न को बदल देती है।

पूर्वनिर्मित spliceosomes12 को अलग करने के लिए एनई प्री-इनक्यूबेटेड में, snRNPs कई परिसरों में पाए जाते हैं जो 7S से 60S से अधिक तक ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट में तलछट करते हैं। यद्यपि ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट फ्रैक्शनेशन स्प्लिसोसोमल कॉम्प्लेक्स और घटकों के अलगाव के लिए एक आम तकनीक है (उदाहरण के लिए संदर्भ 13,14,15 देखें), हमने एंटीबॉडी इम्यूनोप्रिसिपेशन का उपयोग करके विशिष्ट अंशों की विशेषता करके इस विधि का विस्तार किया है। 10S पर एक snRNP तलछट में Gal3 के साथ केवल U1 snRNA होता है। Gal3 या U1 snRNP सह-अवक्षेप दोनों U1 और Gal3 के लिए विशिष्ट antisera के साथ 10S अंश के immunoprecipitation U1 और Gal3 दोनों को दर्शाता है कि U1 snRNP मोनोपार्टिकल्स में से कुछ Gal310 के लिए बाध्य हैं। U1 snRNP के रूप में पहला जटिल है कि spliceosomal assembly1,5 में पूर्व-mRNP के लिए बांधता है, यह कदम splicing मार्ग में Gal3 के लिए एक संभावित प्रवेश साइट का प्रतिनिधित्व करता है। इस आधार पर, हमने दिखाया कि 10S Gal3-U1 snRNP मोनोपार्टिकल्स एंटी-गैल 3 से बंधे हैं, जिसमें मोतियों ने U1 snRNP को समाप्त करने के लिए splicing गतिविधि को बहाल किया है, इस परिसर को एक तंत्र के रूप में स्थापित किया गया है जिसके द्वारा Gal3 को spliceosomal pathway16 में भर्ती किया जाता है। यह splicing प्रतिक्रिया में विशिष्ट चरणों में spliceosomes को अलग करने और संबंधित कारकों को सूचीबद्ध करने के प्रयासों के साथ विरोधाभास करता है17,18। इस तरह के अध्ययनों में, कुछ समय बिंदु पर कुछ कारकों की उपस्थिति का पता लगाया जाता है लेकिन उस तंत्र को नहीं जिसके द्वारा उन्हें लोड किया गया था।

हमने पहले एनई की तैयारी, स्प्लिसिंग सब्सट्रेट, स्प्लिसिंग प्रतिक्रिया मिश्रण की असेंबली, और प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग 19 में गैलेक्टिन की भूमिका के हमारे प्रलेखन में उत्पादों के विश्लेषण का विस्तार से वर्णन किया था। अब हम परमाणु अर्क के फ्रैक्शनेशन के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन करने के लिए Gal3 - U1 snRNP परिसर में समृद्ध एक अंश प्राप्त करने के लिए और बाद के परिसर के immuno-चयन के लिए एक U1-depleted परमाणु निकालने में splicing गतिविधि का पुनर्गठन करने के लिए।

Figure 1
चित्र 1: परमाणु अर्क में स्प्लिसिंग गतिविधि के पूरक को दर्शाने वाला योजनाबद्ध आरेख मोती पर एक Gal3-U1 snRNP परिसर द्वारा U1 snRNP के समाप्त हो गए हैं। (A) बफर C (NE(C)) में NE को प्रोटीन A-Sepharose मोतियों के साथ सहसंयोजक रूप से एंटी-U1 snRNP (αU1 मोतियों) के साथ युग्मित किया गया है। अनबाउंड भिन्न U1 snRNP (U1ΠNE) से समाप्त हो गया है। (बी) बफर डी (एनई (डी)) में एनई को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 12% -32% ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट पर विभाजित किया जाता है। 10S क्षेत्र (अंश 3-5) के अनुरूप अंशों को संयुक्त किया जाता है और मोतियों के साथ मिश्रित किया जाता है जो एंटी-गैल 3 एंटीबॉडी (αGal3 मोतियों) के साथ सहसंयोजक रूप से युग्मित होते हैं। मोतियों के लिए बाध्य सामग्री एक Gal3-U1 snRNP मोनोपार्टिकल शामिल हैं। (ग) भाग (बी) से Gal3-U1 snRNP परिसर को भाग (ए) से U1ΠNE के साथ मिश्रित किया जाता है, जिसमें 32P-लेबल वाले MINX पूर्व-mRNA सब्सट्रेट का उपयोग किया जाता है और splicing प्रतिक्रिया के मध्यवर्ती और उत्पादों का विश्लेषण जेल वैद्युतकणसंचलन और ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

1. सामान्य प्रक्रियाओं पर नोट्स

  1. सुनिश्चित करें कि सभी रसायनों (बफर घटकों, एंजाइमों, आदि) को राइबोन्यूक्लिएज (RNase) से मुक्त रखा जाता है। सामान्य प्रयोगशाला उपयोग से सभी व्यावसायिक रूप से खरीदी गई अभिकर्मक बोतलों को अनुक्रमित करें। प्रयोगात्मक प्रक्रिया के सभी चरणों के लिए दस्ताने पहनें। केवल कांच के बर्तन और बर्तनों का उपयोग करें जिन्हें बेक किया गया है (नीचे चरण 1.2 देखें) और समाधान जो पूर्व-उपचारित किए गए हैं (नीचे चरण 1.3 देखें)।
  2. सभी ग्लासवेयर (बीकर, फ्लास्क, बोतलें, पिपेट्स, आदि) को 177 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे के लिए बेक करें। एक ही परिस्थितियों में बेकिंग से पहले एल्यूमीनियम पन्नी में अन्य बर्तनों (स्पैटुला, हलचल-सलाखों, आदि) को लपेटें।
  3. डबल-आसुत पानी (ddH2O) में diethylpyrocarbonate (DEPC) का 0.1% (vol / vol) समाधान तैयार करें। एक चुंबकीय हलचल-बार का उपयोग करके, इस समाधान को रात भर हिलाएं और फिर आटोक्लेव करें। Tris युक्त सभी समाधान बनाने के लिए इस DEPC-उपचारित H2O का उपयोग करें; फिर, एक बोतल शीर्ष वैक्यूम फिल्टर का उपयोग कर निष्फल फ़िल्टर. अन्य सभी समाधान (ट्रिस के बिना) तैयार करने के लिए नियमित रूप से ddH2O का उपयोग करें; फिर, डीईपीसी (0.1%, vol / vol) और आटोक्लेव के साथ इलाज करें।
    नोट:: प्रयोगात्मक कार्यविधियों के निम्न सेट में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स तालिका 1 में वर्णानुक्रम में सूचीबद्ध हैं।
बफ़र का नाम संयोजन
बोरेट बफर 0.2 एम सोडियम बोरेट, पीएच 9
बफर C 20 mM HEPES, pH 7.9, 25% (vol/vol) ग्लिसरॉल, 0.42 M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF), 0.5 mM dithiothreitol (DTT)
बफर D 10 mM HEPES, pH 7.9, 20% (vol/vol) ग्लिसरॉल, 0.1 M KCl, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM DTT
60%D 60% बफर D और 40% H2O
इथेनॉलामाइन 0.2 एम इथेनॉलामाइन, पीएच 8
HEPES बाइंडिंग बफर 20 mM HEPES, pH 7.9
HEPES धुलाई बफर 20 mM HEPES, pH 7.9, 0.5 M NaCl
आरएनए लोड िंग बफर 90% formamide, 20 mM EDTA, pH 8, 0.05% (w / v) ब्रोमोफेनॉल नीला
SDS-पृष्ठ बफ़र 25 mM Tris, 169 mM ग्लाइसिन, 0.1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (SDS), pH 8.8
SDS नमूना बफ़र 62.5 mM Tris, pH 6.8, 2% SDS, 10% ग्लिसरॉल, 5% 2-mercaptoethanol, 0.1% (w / v) ब्रोमोफेनॉल नीला
आरएनए जैल के लिए टीबीई बफर 89 mM Tris, 89 mM बोरिक एसिड, 2.5 mM EDTA, pH 8.3
TE बफर 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA
स्थानांतरण बफ़र 25 mM Tris, 1.92 M ग्लाइसिन, 20% मेथनॉल, pH 8.3
T-TBS बफ़र 10 mM Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.5
TX धोने बफर 0.05% Triton X-100 (TX) 60% D में

तालिका 1: बफ़र्स का नाम और संरचना

2. U1 snRNP (U1 ΠNE) के समाप्त NE की तैयारी

  1. immunoadsorption के लिए विरोधी U1 मोतियों की तैयारी
    1. पूर्व सूजन 50 मिलीग्राम प्रोटीन ए-सेफारोज सीएल -4 बी मोती अतिरिक्त डीईपीसी-उपचारित एच 2 ओ में लगभग 200 μL सूजन मोतियों का उत्पादन करने के लिए और फिर HEPES धोने बफर में धोने के लिए।
    2. इस धोने और बाद के सभी धोने के लिए, सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा मोतियों को गोली मारें (10-15 सेकंड के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झूलते हुए बाल्टी रोटर में 1,000 x जी ) और एक माइक्रोपिपेटर का उपयोग करके अनबाउंड वॉश को हटा दें और छोड़ दें।
    3. U1 snRNP के लिए विशिष्ट मानव ऑटोइम्यून सीरम के 150 μL के साथ धोए गए मोतियों के 150 μL मिश्रण (1: 1 के अनुपात में मोतियों की मात्रा के लिए एंटीबॉडी की मात्रा)।
    4. समायोजित करें, की कुल मात्रा के आधार पर (~ 300 μL ऊपर चरण 2.1.3 से), मिश्रण 20 mM HEPES, पीएच 7.9, HEPES बाध्यकारी बफर की शर्तों के अनुरूप; 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर निरंतर रॉकिंग के साथ इस मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    5. बोरेट बफर (0.2 एम सोडियम बोरेट, पीएच 9) के 1 मिलीलीटर के साथ एंटीबॉडी के साथ बंधे मोतियों को धोएं और एक ही बोरेट बफर के 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें।
    6. प्रोटीन ए-सेफारोज मोतियों से बंधे एंटीबॉडी को सहसंयोजक रूप से जोड़ने के लिए, 20 मिमी की अंतिम एकाग्रता में डाइमिथाइलपिमेलिमिडेट जोड़ें और 60 मिनट के लिए रॉकिंग के साथ कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    7. बोरेट बफर के 1 मिलीलीटर के साथ मोतियों को धोएं।
    8. किसी भी unreacted क्रॉस-लिंकिंग अभिकर्मक को अवरुद्ध करने के लिए, 0.2 M इथेनॉलामाइन (pH 8) का 1 mL जोड़ें और 60 मिनट के लिए रॉकिंग के साथ कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    9. एंटीबॉडी-युग्मित मोतियों को धोएं, इसके बाद एंटी-यू 1 मोतियों के रूप में नामित किया गया, दो बार टीएक्स वॉश बफर के 0.5 मिलीलीटर (60% डी में 0.05% ट्राइटन एक्स -100) के साथ।
  2. NE से U1 snRNP की कमी ( चित्र 1A देखें)
    नोट: हेला कोशिकाओं से एनई तैयार करने की प्रक्रिया शुरू में डिग्नम एट अल.20 द्वारा विकसित की गई थी। हमने splicing assays19 के लिए एनई की तैयारी के लिए सामग्री और विस्तृत तरीकों का वर्णन किया है (उस संदर्भ के चरण 2.1 और 3.1 देखें)। एनई, जैसा कि शुरू में तैयार किया गया था, बफर सी में है और इसके बाद एनई (सी) के रूप में नामित किया जाएगा। एनई (सी) के खिलाफ डायलाइज़ किया गया और बफर डी के साथ संतुलित किया गया, इसे एनई (डी) के रूप में नामित किया जाएगा।
    1. ऊपर दिए गए चरण 2.1.9 से एंटी-यू 1 मोतियों के 100 μL के साथ NE(C) के 200 μL इनक्यूबेट करें।
    2. मिश्रण में RNasin के 5 μL जोड़ें।
    3. माइक्रोट्यूब हेड-ओवर-टेल को 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
    4. centrifugation द्वारा मिश्रण गोली (1,000 x g एक झूलते बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 s के लिए) और एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर unbound सामग्री (U1ΠNE) इकट्ठा.
    5. मूल nondepleted NE (C) के एक अलग 50 μL एलीकोट के साथ U1ΠNE की पूरी मात्रा को डायलाइज़ करें, एक माइक्रोडायलाइज़र के अलग-अलग डिब्बों में, सरगर्मी के साथ, 60% डी के खिलाफ 75 मिनट के लिए 8 K आणविक भार कटऑफ के साथ एक डायलिसिस झिल्ली का उपयोग करके।
    6. डायलिसिस के तुरंत बाद, इन तैयारियों को विभाजित करें (U1ΠNE और NE 60% D में) 20 μL एलीकोट में; फिर एक सूखी बर्फ / इथेनॉल स्नान में फ्रीज स्नैप करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. आरएनए और U1ΠNE की प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण और एंटी-U1 मोतियों पर बाध्य सामग्री
    1. अनबाउंड सामग्री (U1ΠNE) (चरण 2.2.4) को हटाने के बाद, TX धोने बफर के 0.5 mL जोड़कर एंटी-U1 मोतियों से बंधी सामग्री को धोएं। centrifugation द्वारा मिश्रण गोली (10-15 s के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झूलती बाल्टी रोटर में 1,000 x जी ) और एक micropipettor का उपयोग कर supernatant को हटाने और त्याग.
    2. धोने के चरणों को 2.3.1 दो बार दोहराएं।
    3. मोतियों के 100 μL करने के लिए 2x SDS नमूना बफर के 100 μL जोड़ने और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए incubating द्वारा विरोधी U1 मोतियों के लिए बाध्य सामग्री को हटा दें।
    4. centrifugation द्वारा मिश्रण गोली (1,000 x g एक झूलते बाल्टी रोटर में 10-15 s के लिए 4 °C पर); हैमिल्टन सिरिंज द्वारा supernatant को हटाने, और एक सूखी बर्फ / इथेनॉल स्नान में स्नैप फ्रीज। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. गैर-भरे हुए NE, समाप्त NE (U1ΠNE), और मोतियों से बंधी सामग्री की तुलना करें (ऊपर दिए गए चरणों 2.3.3 और 2.3.4 में वर्णित SDS नमूना बफर द्वारा मोतियों से हटा दिया गया)। आरएनए विश्लेषण के लिए चरण 2.3.6-2.3.8 या प्रोटीन विश्लेषण के लिए चरण 2.3.9-2.3.10 का पालन करें।
    6. प्रत्येक नमूने के लिए, फिनोल-क्लोरोफॉर्म के 200 μL के साथ आरएनए निकालें (50: 50, v / v); फिर क्लोरोफॉर्म-आइसोमाइल अल्कोहल के 180 μL (25: 1, v / v) के साथ फिर से निकालें। निष्कर्षण के बाद, ठंडे 200-प्रूफ इथेनॉल के 300 μL जोड़ें, मिश्रण करने के लिए उलटें, और अवक्षेपित आरएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें।
    7. इथेनॉल-अवक्षेपित आरएनए को सेंट्रीफ्यूज करें (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x g )। ठंडे 70% इथेनॉल के 150 μL के साथ छर्रों को धोएं। सेंट्रीफ्यूज फिर से (12,000 x g) 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। एक micropipettor का उपयोग कर supernatant निकालें और गर्मी के बिना 10-15 मिनट के लिए एक गति vac में छर्रों सूखी.
    8. आरएनए लोडिंग बफर के 10 μL में सूखे आरएनए गोली को फिर से निलंबित करें, धीरे से भंवर, 90 सेकंड के लिए 75-85 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी, और फिर 2 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 13% पॉलीएक्रिलामाइड - 8.3 एम यूरिया जैल के माध्यम से जेल वैद्युतकणसंचलन (16 एमए पर 2 ज) द्वारा एसएनआरएनए को अलग करें और फिर या तो एथिडियम ब्रोमाइड के साथ दाग या उत्तरी ब्लोटिंग 10,16 के अधीन।
    9. प्रोटीन के नमूने लोड, चरण 2.3.5 से एसडीएस नमूना बफर में, 12.5% polyacrylamide जैल और 200 V पर वैद्युतकणसंचलन पर लगभग 45-50 मिनट के लिए SDS-PAGE (सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन) बफर में.
    10. स्थानांतरण बफर में 2 ज के लिए 400 mA पर नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के लिए अलग प्रोटीन हस्तांतरण। स्थानांतरण के बाद, 10% गैर-वसा वाले सूखे दूध वाले टी-टीबीएस में रात भर इनक्यूबेट करके झिल्ली को अवरुद्ध करें। फिर, विशिष्ट प्रोटीन 8,21 को प्रकट करने के लिए झिल्ली को इम्यूनोब्लॉट करें।

3. विरोधी Gal3 द्वारा ग्लिसरॉल gradients के 10S अंशों के immunoprecipitation

  1. Immunoadsorption के लिए विरोधी Gal3 मोतियों की तैयारी
    नोट: खरगोश # 2421 के लिए और खरगोश # 4910 के लिए Gal3 के खिलाफ खरगोश polyclonal antisera की व्युत्पत्ति और लक्षण वर्णन पहले वर्णित किया गया है।
    1. नियंत्रण के रूप में खरगोश # 49 से प्रीइम्यून सीरम का उपयोग करें।
    2. विरोधी Gal3 मोतियों की तैयारी के लिए पहले विरोधी U1 मोतियों (चरण 2.1) की तैयारी के लिए वर्णित प्रक्रिया का पालन करें, अपवाद के साथ कि चरण 2.1.3 के अनुरूप, antiserum (जैसे, विरोधी Gal3, # 49) का अनुपात मोतियों के लिए 3: 1 है।
    3. उपयोग करने से ठीक पहले, एंटीबॉडी-युग्मित मोतियों को धोएं, इसके बाद एंटी-गैल 3 मोतियों के रूप में नामित किया गया, दो बार टीएक्स वॉश बफर के 0.5 मिलीलीटर के साथ। supernatant निकालें, पहले एक micropipettor के साथ तरल के सबसे बाहर पाने के लिए और फिर एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ मोतियों से बाहर तरल पाने के लिए; फेंक देना।
  2. विरोधी Gal3 द्वारा ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट अंशों के immunoprecipitaton ( चित्रा 1B देखें)
    1. Fractionate NE (D) एक 12% -32% ग्लिसरॉल gradient10 पर। ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट अंशों 3, 4, और 5 (ग्रेडिएंट के शीर्ष से गिने हुए) को मिलाएं और मिलाएं, जो ग्रेडिएंट के 10S क्षेत्र के पास हैं।
    2. दो नमूने तैयार करें, प्रत्येक 150 μL एलीकोट के साथ संयुक्त ग्रेडिएंट अंश 3-5 (चरण 3.2.1) के साथ, और एंटी-गैल 3 मोतियों के 50 μL में रखें।
    3. समानांतर में, अंश 1 के 150 μL के साथ प्रत्येक में दो नमूने तैयार करें (जिसमें Gal3 U1 snRNP10 के साथ जटिल नहीं है; चरण 3.2.1) और एंटी-Gal3 मोतियों के 50 μL में रखें।
    4. एक नियंत्रण के रूप में, 50 μL विरोधी Gal3 मोतियों के एक और माइक्रोट्यूब में 60% डी के 150 μL जगह.
    5. ट्यूब को टैप करके धीरे से मिलाएं, फिर माइक्रोट्यूब हेड-ओवर-टेल को 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
    6. कोमल centrifugation द्वारा मिश्रण गोली (1,000 x जी एक झूलते बाल्टी रोटर में 10-15 s के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर).
    7. एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर supernatant (अनबाउंड सामग्री) निकालें। मोतियों को न धोएं और स्प्लिसिंग प्रतिक्रियाओं (अनुभाग 4.2) के अलावा के लिए तुरंत उपयोग करें।
  3. 10S ग्रेडिएंट अंशों के एंटी-Gal3 वर्षा से अनबाउंड और बाउंड सामग्री में आरएनए और प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण
    1. 10S ग्रेडिएंट अंशों के एंटी-गैल 3 वर्षा से बाध्य और अनबाउंड सामग्री के घटकों के विश्लेषण के लिए, अनबाउंड सामग्री (चरण 3.2.6 के बाद supernatant) एकत्र करें, एक ताजा माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    2. TX धोने बफर के 0.5 मिलीलीटर जोड़कर चरण 3.2.6 (एंटी-Gal3 करने के लिए बाध्य सामग्री युक्त) से अवक्षेपित मोतियों को धोएं।
    3. कोमल centrifugation द्वारा मिश्रण गोली (1,000 x जी 10-15 s के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झूलती बाल्टी रोटर में); एक micropipettor का उपयोग कर supernatant निकालें और छोड़ दें. धोने के चरणों को दो बार और दोहराएं।
    4. धोया और गोली विरोधी Gal3 मोती करने के लिए 2X SDS नमूना बफर के 50 μL जोड़ें।
    5. मोतियों को धीरे से मिलाएं और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. कोमल centrifugation द्वारा मिश्रण गोली (10-15 s के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झूलती बाल्टी रोटर में 1,000 x जी ), हैमिल्टन सिरिंज द्वारा supernatant इकट्ठा और -20 डिग्री सेल्सियस पर एक ताजा माइक्रोट्यूब में स्टोर.
    7. आरएनए और प्रोटीन घटकों के संदर्भ में एंटी-गैल 3 वर्षा की अनबाउंड सामग्री (अनुभाग 3.3.1) और बाउंड सामग्री (चरण 3.3.6) की तुलना करें, चरण 2.3.6 में वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग करके। क्रमशः 2.3.10 के लिए।

4. splicing प्रतिक्रिया और उत्पादों के विश्लेषण की विधानसभा

  1. splicing सब्सट्रेट की तैयारी
    नोट: पूर्व-mRNA सब्सट्रेट, नामित MINX, दो एक्सोन अनुक्रम और एडेनोवायरस 22 से एक intron अनुक्रम शामिल हैं। प्लास्मिड में MINX डीएनए अनुक्रम T3, T7, या SP6 RNA पोलीमरेज़ प्रमोटरों के नियंत्रण में है। BamHI प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएज के साथ MINX प्लास्मिड डीएनए के linearization के लिए सामग्री और विस्तृत तरीके, α-32P की उपस्थिति में SP6 RNA पोलीमरेज़ द्वारा प्रतिलेखन [GTP] और splicing assays के लिए 32P-लेबल MINX के शुद्धिकरण को पहले 19 वर्णित किया गया है (उस संदर्भ के चरण 2.2 और 3.2 देखें)।
    1. रेडियोलेबल MINX को -20 डिग्री सेल्सियस पर एक इथेनॉल अवक्षेप के रूप में स्टोर करें; प्रतिलेखन के बाद 4-6 सप्ताह के भीतर लेबल स्प्लिसिंग सब्सट्रेट का उपयोग करें।
    2. उपयोग करने से ठीक पहले, इथेनॉल को सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x g पर 32P-लेबल वाले MINX पर अवक्षेपित किया गया; एक micropipettor के साथ supernatant निकालें और छोड़ें।
    3. 70% इथेनॉल के 150 μL और 4 °C पर 15 मिनट के लिए 12,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। supernatant त्याग और 15 मिनट के लिए कोई गर्मी के साथ गति vac में गोली सूखी.
    4. डीईपीसी पानी के 50 μL में गोली rehydrate. दो जीएफ / सी फिल्टर में से प्रत्येक पर स्पॉट 2 μL; 10 मिनट के लिए ठंडे 5% trichloroacetic एसिड (TCA) में फिल्टर विसर्जित करें। ठंडे 5% टीसीए के साथ कुल्ला करें, इसके बाद वैक्यूम फ्लास्क पर 180-प्रूफ इथेनॉल। हवा फिल्टर सूखी और सुरक्षा हल के 4 मिलीलीटर में scintillation गिनती के अधीन.
    5. पतला 32P-लेबल MINX में 60% डी करने के लिए 104 सीपीएम /
  2. splicing प्रतिक्रिया की असेंबली ( चित्रा 1C देखें)
    1. बर्फ पर, 24 μL (8 μL U1ΠNE (चरण 2.2.6 से), 3.5 mM MgCl2, 1.5 mM एटीपी, 20 mM क्रिएटिन फॉस्फेट, 0.5 mM DTT, 0.5 mM DTT, 20 इकाइयों RNasin, 4 μL 32P-लेबल वाले MINX splicing सब्सट्रेट (104 cpm/μL), 60% D) की कुल मात्रा में स्प्लिसिंग प्रतिक्रियाओं को इकट्ठा करें और 3.2.7 अनुभाग से मोतियों की प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें। 24 μL की कुल मात्रा में splicing प्रतिक्रियाओं के एक समान सेट को इकट्ठा करें, लेकिन U1ΠNE के बिना और चरण 3.2.7 से मोतियों की प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें।
    2. एक 12 μL कुल मात्रा (4 μL NE (D), 3.5 mM MgCl2, 1.5 mM एटीपी, 20 mM क्रिएटिन फॉस्फेट, 0.5 mM DTT, 20 इकाइयों RNasin, 2 μL 32P-लेबल MINX splicing सब्सट्रेट (104 सीपीएम / μL), 60% D) में एक नियंत्रण splicing प्रतिक्रिया तैयार करें।
    3. टैप करके ट्यूबों को धीरे से मिलाएं और 90 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एंड-ओवर-टेल घुमाएं। 10-15 सेकंड के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झूलते बाल्टी रोटर में 1,000 x g पर कोमल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा मिश्रण को गोली मारो।
    4. प्रतिक्रिया बंद करो और मोतियों युक्त ट्यूबों के लिए 2x एसडीएस नमूना बफर के 24 μL जोड़कर मोतियों से प्रोटीन को दूर करें, और एनई युक्त नियंत्रण ट्यूब के लिए 2x एसडीएस नमूना बफर के 12 μL लेकिन कोई मोती नहीं। 7 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को गर्म करें।
    5. 10-15 सेकंड के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झूलते बाल्टी रोटर में 1,000 x g पर ट्यूबों को धीरे से सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. ताजा माइक्रोट्यूब के लिए supernatants (elutions) हस्तांतरण: मनका ट्यूब से लगभग 48 μL और NE नियंत्रण ट्यूब से 24 μL.
    7. प्रोटीन को पचाने और घुलनशील बनाने के लिए प्रोटीनेज के (20 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें: मोतियों से 48 μL क्षालन में 5 μL जोड़ें और 24 μL NE नियंत्रण में 2.5 μL जोड़ें।
    8. 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    9. धीरे से 10 s के लिए 4 °C पर एक झूलती बाल्टी रोटर में 1,000 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    10. 39.5 μL TE और 10 μL 3 M सोडियम एसीटेट के साथ मनका क्षालन पतला. 63.5 μL TE और 10 μL 3 M सोडियम एसीटेट के साथ NE नियंत्रण को पतला करें।
    11. निकालें और नीचे वर्णित के रूप में आरएनए का विश्लेषण (अनुभाग 4.3).
  3. splicing प्रतिक्रिया के उत्पादों का विश्लेषण
    1. फिनोल-क्लोरोफॉर्म के साथ प्रत्येक नमूने में आरएनए निकालें, इसके बाद क्लोरोफॉर्म-आइसोमाइल अल्कोहल; इथेनॉल, सेंट्रीफ्यूज के साथ आरएनए को अवक्षेपित करें, छर्रों को धोएं, supernatant को हटा दें और चरणों 2.3.6 और 2.3.7 में वर्णित एक ही प्रक्रिया के बाद छर्रों को सूखा दें।
    2. आरएनए लोडिंग बफर के 10 μL में सूखे आरएनए गोली को फिर से निलंबित करें, धीरे से भंवर, 90 सेकंड के लिए 75-85 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी, और फिर 2 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    3. 8.3 एम यूरिया में 13% पॉलीएक्रिलामाइड (बिसाक्रिलामाइड: एक्रिलामाइड, 1.9: 50 [डब्ल्यूटी / डब्ल्यूटी]) युक्त एक समाधान के 20 मिलीलीटर तैयार करें; कास्ट जैल इस समाधान का उपयोग करके लंबाई में 15 सेमी।
    4. एक बार जेल डाली जाती है, तो इसे (बिना किसी नमूने के लोड किए गए) 20 मिनट के लिए 400 वी पर चलने वाले बफर के रूप में टीबीई का उपयोग करके इलेक्ट्रोफोरीज़। इस चरण के बाद, TBE चल रहे बफर के साथ कुओं को धो लें।
    5. आरएनए नमूनों को लोड करें, आरएनए लोडिंग बफर में, और टीबीई के साथ इलेक्ट्रोफोरीज 3.5 से 4 घंटे के लिए 400 वी पर बफर चला रहा है। वैद्युतकणसंचलन के बाद, 10 मिनट के लिए आसुत पानी में जेल को डुबोकर और घुमाकर यूरिया को हटा दें।
    6. वैक्यूम 3 एम फिल्टर पेपर पर जेल को सूखा देता है, पहले 80 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे 15 मिनट के लिए और फिर इसे धीरे-धीरे ठंडा करने के लिए गर्मी के बिना 30 मिनट के लिए। रेडियोधर्मी घटकों के प्रवास की स्थिति का पता लगाने के लिए फिल्म पर ऑटोरेडियोग्राफी के लिए सूखे जेल के विषय।

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Representative Results

NE U1 snRNP (धारा 2.2.6 से U1ΠNE) और Gal3 - U1 snRNP परिसरों के 10S क्षेत्र से ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट immunoprecipitated विरोधी Gal3 (चरण 3.2.7) द्वारा समाप्त एक splicing प्रतिक्रिया में मिश्रित थे। इस प्रतिक्रिया मिश्रण में U1 snRNA (चित्रा 2A, लेन 3) के साथ-साथ U1-विशिष्ट प्रोटीन, U1-70K (चित्रा 2B, लेन 3) शामिल था। जैसा कि अपेक्षित था, विरोधी Gal3 अवक्षेपित Gal3 (चित्रा 2B, लेन 3). ये घटक (U1 snRNA, U1-70K प्रोटीन, और Gal3) पूर्व-प्रतिरक्षा (PI) नियंत्रण वर्षा (चित्रा 2A, चित्रा 2B, लेन 2) में नहीं पाए गए थे। एक गैर-समाप्त एनई की तुलना में एक सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 2 सी, लेन 1) के रूप में किया गया, U1ΠNE ने स्प्लिसिंग गतिविधि (चित्रा 2 C, लेन 2) का प्रदर्शन नहीं किया। U1ΠNE में splicing गतिविधि मनका-बाध्य Gal3 - U1 snRNP परिसर (चित्रा 2C, लेन 6) द्वारा पुनर्गठित किया जा सकता है। splicing प्रतिक्रिया के दोनों उत्पादों, ligated exons और excised intron lariat (दाईं ओर तीर द्वारा हाइलाइट किया गया), साथ ही साथ मध्यवर्ती, एक्सोन 1 और lariat एक्सन 2, पाए गए थे। भिन्न 3-5 के घटक U1ΠNE करने के लिए splicing बहाल करने में महत्वपूर्ण थे। जब अंश 3-5 को इम्युनोप्रिसिपिटेशन में अकेले बफर (60% डी) द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था, तो U1ΠNE (चित्रा 2C, लेन 2) के साथ मिश्रण करने पर कोई स्प्लिसिंग गतिविधि नहीं देखी जा सकती थी, यह दर्शाता है कि एंटी-गैल 3 मोतियों को उत्तरार्द्ध में स्प्लिसिंग गतिविधि की बहाली के लिए जिम्मेदार नहीं थे। अधिक प्रेरक रूप से, जब अंश 3-5 को इम्युनोप्रिसिपेशन प्रक्रिया में अंश 1 द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था और फिर U1ΠNE में जोड़ा गया था, तो स्प्लिसिंग प्रतिक्रिया का कोई मध्यवर्ती या उत्पाद नहीं पाया गया था (चित्रा 2 सी, लेन 4)। पिछले विश्लेषण ने दस्तावेज किया था कि अंश 1 में Gal3 मुक्त Gal3 प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है, न कि किसी भी RNP complex10 के साथ सहयोग में और अंश 1 से immunoprecipitated सामग्री के उत्तरी ब्लोटिंग किसी भी U1 snRNA16 को प्रकट करने में विफल रहे। अंत में, fraction1 और अंश 3-5 से immunoprecipitates splicing गतिविधि का प्रदर्शन नहीं किया जब U1ΠNE (चित्रा 2C, लेन 3 और 5, क्रमशः) की अनुपस्थिति में परखा गया।

Figure 2
चित्रा 2: ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट के 10एस क्षेत्र के एंटी-गैल 3 अवक्षेप के आरएनए और पॉलीपेप्टाइड रचनाओं के प्रतिनिधि परिणाम और परमाणु अर्क में स्प्लिसिंग को पुनर्गठित करने की इसकी क्षमता U1 snRNP (U1ΠNE) के समाप्त हो गए। (ए) पूर्व-प्रतिरक्षा सीरम (पीआई; लेन 2) के साथ युग्मित मोतियों के लिए बाध्य U1 snRNA का उत्तरी ब्लोटिंग विश्लेषण या एंटी-गैल 3 (αGal3; लेन 3) के साथ युग्मित मोतियों के लिए। लेन 1 संयुक्त ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट अंशों की मात्रा का 20% का प्रतिनिधित्व करता है जो immunoprecipitation के अधीन है। लेन 2 और लेन 3 प्रत्येक संबंधित मोतियों से निकलने वाली बाध्य सामग्री के 25% का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) पूर्व-प्रतिरक्षा सीरम (लेन 2) या एंटी-गैल 3 (लेन 3) के साथ मिलकर मोतियों से बंधे पॉलीपेप्टाइड्स का पश्चिमी ब्लोटिंग विश्लेषण। प्रोटीन की पहचान दाईं ओर इंगित की जाती है। लेन 1 संयुक्त ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट अंशों की मात्रा का 20% का प्रतिनिधित्व करता है जो immunoprecipitation के अधीन है। लेन 2 और लेन 3 प्रत्येक संबंधित मोतियों से निकलने वाली बाध्य सामग्री के 75% का प्रतिनिधित्व करते हैं। (C) ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट अंश 1 (Fr 1), अंश 3-5 (Fr 3-5), या 60% बफर D (60% D) के एंटी-Gal3 (αGal3) immunoprecipitates द्वारा U1ΠNE को splicing गतिविधि को पुनर्स्थापित करने की क्षमता का विश्लेषण। बोल्ड ठोस रेखा के ऊपर + या - चिह्न स्प्लिसिंग प्रतिक्रिया मिश्रण में इन अवक्षेपों में से प्रत्येक की उपस्थिति या अनुपस्थिति को इंगित करता है। बोल्ड ठोस रेखा के नीचे + या - चिह्न U1ΠNE (या बफर डी में NE) की उपस्थिति या अनुपस्थिति को इंगित करता है। लेन 1: एक 12 μL splicing परख में 4 μL NE, जिनमें से 100% जेल विश्लेषण के अधीन थे. लेन 2-6 के लिए, splicing परख की कुल मात्रा 24 μL था, जिनमें से 50% जेल विश्लेषण के अधीन थे। लेन 2: 8 μL U1ΠNE प्लस 60% D. लेन 3 की वर्षा से मोती: Fr 1 की वर्षा से मोती। लेन 4: 8 μL U1ΠNE प्लस Fr 1 की वर्षा से मोती. लेन 5: Fr 3-5 की वर्षा से मोती। लेन 6: 8 μL U1ΠNE प्लस Fr 3-5 की वर्षा से मोतियों. पूर्व-mRNA सब्सट्रेट, मध्यवर्ती, और उत्पादों (intron lariat और ligated exons, तीर द्वारा हाइलाइट किया गया) के प्रवास की स्थिति दाईं ओर इंगित की जाती है। पैनल सी में डेटा उसी प्रयोग से प्राप्त होता है जैसा कि पैनल ए, हॉडेक एट अल.16 के चित्र 2 में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2 में दिखाए गए परिणाम एंटी-गैल 3 (# 49) के साथ प्राप्त किए गए थे। एक ही परिणाम एक और विरोधी Gal3 (# 24) के साथ मनाया जा सकता है, लेकिन खरगोश # 49 से पूर्व प्रतिरक्षा सीरम 3-516 अंशों के साथ इनक्यूबेशन के बाद U1ΠNE में splicing का पुनर्गठन करने में विफल रहा। इन सभी परिणामों से दृढ़ता से पता चलता है कि पूर्व-mRNA सब्सट्रेट 10S Gal3 - U1 snRNP कण को मोतियों पर स्थिर कर सकता है और यह कि टर्नरी कॉम्प्लेक्स स्प्लिसिंग मार्ग में कार्यात्मक है।

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Discussion

यह रिपोर्ट प्रयोगात्मक विवरण प्रदान करती है जो एक Gal3 - U1 snRNP परिसर को एंटी-गैल 3 लेपित मोतियों पर फंसा हुआ दस्तावेज करती है, पूर्व-mRNA सब्सट्रेट को बांध सकती है और यह टर्नरी कॉम्प्लेक्स एक U1 snRNP-depleted NE में स्प्लिसिंग गतिविधि को बहाल कर सकता है। Gal3 मूल रूप से इसके गैलेक्टोज-विशिष्ट कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग गतिविधि के आधार पर अलग-थलग प्रोटीन के परिवार का एक सदस्य है23 . प्रारंभिक immunofluorescence और उपकोशिकीय fractionation अध्ययनों splicing मशीनरी के घटकों के साथ Gal3 के एक संघ का प्रारंभिक संकेत प्रदान किया: snRNPs के Sm कोर polypeptides के साथ परमाणु धब्बेदार में सहस्थानीयकरण और spicing कारक24,25 के सेरीन- और arginine-अमीर (SR) परिवार और एक घनत्व (1.3-1.35 g / mL) पर cesium सल्फेट gradients पर अवसादन hnRNP और snRNP24 के उन लोगों से मेल खाते हैं . बाद में कमी-पुनर्गठन प्रयोगों, बदले में, Gal3 (साथ ही गैलेक्टिन परिवार के एक अन्य सदस्य, गैलेक्टिन -1 (Gal1)) की आवश्यकता थी, लेकिन अनावश्यक, सेल-मुक्त splicing assays7,8 में कारक।

जब एनई को ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट पर विभाजित किया जाता है, तो एंटी-गैल 3 के साथ ग्रेडिएंट अंशों के इम्यूनोप्रिसिपिटेशन ने विभिन्न एसएनआरएनए और संबंधित प्रोटीन के अलग-अलग अनुपात के साथ अलग-अलग परिसरों को प्राप्त किया, यह सुझाव देते हुए कि गैल 3 पूर्व-एमआरएनए स्प्लिसिंग सब्सट्रेट 10 की अनुपस्थिति में कई एसएनआरएनएपी के साथ जुड़ा हुआ है। विशेष रूप से, Gal3 और U1 snRNP को एक मोनोपार्टिकल में इकट्ठा किया जाता है जो ग्रेडिएंट के ~ 10S क्षेत्र में तलछट करता है (12% -32% ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट के अंश 3-5)। चूंकि पूर्व-mRNA की 5'-splice साइट के लिए U1 snRNP का बंधन spliceosome assembly5,26 में प्रारंभिक चरण का प्रतिनिधित्व करता है, इसलिए यह संभव था कि Gal3 U1 snRNP के साथ अपने सहयोग के माध्यम से splicing pathway में प्रवेश प्राप्त कर सकता है। इस धारणा को इस अवलोकन द्वारा समर्थित किया जाता है कि Gal3, 10S Gal3-U1 snRNP कॉम्प्लेक्स के एक हिस्से के रूप में, एक पूर्व-mRNA सब्सट्रेट के साथ संबद्ध करने के लिए पाया जा सकता है, लेकिन नियंत्रण आरएनए के साथ नहीं स्प्लिस साइटों की कमी है, यह सुझाव देते हुए कि U1 snRNP द्वारा 5'-splice साइट मान्यता एक spliceosome में इसकी असेंबली में एक महत्वपूर्ण आवश्यकता थी। इसके अलावा, माइक्रोकोकल न्यूक्लिएज के साथ Gal3-U1 snRNP कण युक्त अंशों के pretreatment पूर्व-mRNA10 पर Gal3 के लोडिंग को समाप्त कर दिया। मुख्य प्रश्न, फिर, यह है कि क्या यह शुरुआती टर्नरी कॉम्प्लेक्स, जिसमें Gal3, U1 snRNP और प्री-mRNA शामिल हैं, एक कार्यात्मक ई कॉम्प्लेक्स का प्रतिनिधित्व करता है जो स्प्लिसिंग मार्ग या एक डेड-एंड एच कॉम्प्लेक्स के लिए प्रतिबद्ध है जो स्प्लिसिंग पाथवे 5,26 में प्रवेश नहीं कर सकता है। हमने इस प्रश्न को यह परीक्षण करके संबोधित किया कि क्या Gal3 - U1 snRNP SPLICING क्षमता (U1ΠNE) के सहवर्ती नुकसान के साथ U1 snRNP के समाप्त NE में splicing गतिविधि का पुनर्गठन कर सकता है। हमारे प्रयोगों के परिणाम, जिनके प्रोटोकॉल वर्तमान लेख में विस्तृत हैं, इंगित करते हैं कि Gal3 - U1 snRNP एक कार्यात्मक ई कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए पूर्व-mRNA सब्सट्रेट को बांधता है और यह कि U1 snRNP को गैल 3 को स्प्लिसिंग पाथवे 16 में शामिल करने की आवश्यकता होती है।

वर्णित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के भीतर दो महत्वपूर्ण चरणों को नोट करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, चरण 3.2.7 ग्लिसरॉल अंशों के विरोधी Gal3 वर्षा के बाद supernatant unbound सामग्री को हटाने के लिए कहता है। छर्रे वाले agarose मोतियों से तरल का पूरा हटाने के लिए आवश्यक है कि हैमिल्टन सिरिंज की सुई की नोक को मोतियों के नीचे डाला जाए। इसे सावधानीपूर्वक इस तरह से करने की आवश्यकता है कि मोती सिरिंज सुई को बंद न करें या सुई का पालन करके खो जाएं क्योंकि बाद वाले को ट्यूब से बाहर निकाला जाता है। दूसरा, यह महत्वपूर्ण है कि पैलेट किए गए मोतियों का उपयोग जितना संभव हो उतना कम देरी के साथ स्प्लिसिंग प्रतिक्रियाओं की असेंबली के लिए किया जाए। प्रक्रिया की सफलता के लिए इन दो चरणों का समन्वय महत्वपूर्ण था। इस संबंध में, यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमने हाल ही में प्रोटीन ए-सेफारोज सीएल -4 बी मोतियों को प्रोटीन ए-चुंबकीय नैनोकणों के साथ प्रोटीन ए-चुंबकीय नैनोकणों के साथ प्रोटीन ए-सेफारोज सीएल -4 बी मोतियों को बदलकर पैलेट अंश में Gal3-U1 snRNP परिसरों की वसूली में सुधार किया है।

मुख्य निष्कर्ष उन प्रयोगों से लिया गया है जिनमें U1ΠNE, splicing गतिविधि से रहित, 10S Gal3 - U1 snRNP कण immunoprecipitated मोतियों द्वारा सहसंयोजक रूप से एंटी-Gal3 एंटीबॉडी के साथ व्युत्पन्न द्वारा पूरक है। यद्यपि इंट्रोन हटाने के स्पष्ट सबूत थे, एक्सोन में शामिल होने की दक्षता मोतियों की अनुपस्थिति में आयोजित प्रतिक्रिया में देखी गई प्रतिक्रिया की तुलना में कम थी ( चित्रा 2 सी में लेन 6 बनाम लेन 1 की तुलना करें)। हमारे सेल-मुक्त splicing assays में, पूर्व-mRNA सब्सट्रेट में रेडियोधर्मिता का लगभग 30% आमतौर पर लिगेटेड एक्सोन में परिवर्तित हो जाता है। एक्सोन बंधाव में यह कमी के कारण हो सकता है: (ए) एक महत्वपूर्ण घटक की कुछ कम-से-इष्टतम मात्रा, या तो U1ΠNE (चित्रा 1A) में या Gal3 - U1 snRNP कॉम्प्लेक्स (चित्रा 1B) में; या (बी) कुछ संरचनात्मक बाधाएं (उदाहरण के लिए, एक संरचनात्मक परिवर्तन से गुजरने में कठिनाई) Gal3 - U1 snRNP splicing प्रतिक्रिया (चित्रा 1 C) के दौरान विरोधी Gal3 मोतियों पर immobilized।

अन्य जांचकर्ताओं ने विशिष्ट परिसरों को फंसाने और उत्प्रेरक गतिविधि या स्प्लिसोसोम संरचनाओं की कुछ क्रमबद्ध प्रगति को फंसाने के लिए ठोस चरण इम्यूनो-चयन के उपयोग की सूचना दी है। उदाहरण के लिए, चिउ एट अल ने खमीर स्प्लिसिंग कारक Cwc25 के अतिरिक्त दिखाया जो पहले उत्प्रेरक प्रतिक्रिया में एक एंटीबॉडी-फंसे हुए स्प्लिसोसोम पर पूर्व-एमआरएनए सब्सट्रेट का पीछा कर सकता है, जिससे मध्यवर्ती, एक्सोन 1 और लैरिएट-एक्सोन 227 उत्पन्न होते हैं। एक ही खमीर प्रणाली में, कृष्णन एट अल ने बायोटिनिलेटेड-आईजीजी के माध्यम से स्थिर करने के लिए एक प्रोटीन ए-टैग का उपयोग किया, पहले स्प्लिसिंग चरण 28 से पहले पूर्व-एमआरएनए रीमॉडलिंग (5'-स्प्लिस साइट और शाखा बिंदु के बीच की दूरी) के बायोफिजिकल अध्ययन में स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों के लिए बेक्ट स्प्लिसोसोम कॉम्प्लेक्स को शुद्ध किया। हमारा वर्तमान लेख इन पहले के अध्ययनों को स्प्लिसिंग प्रतिक्रिया के दोनों चरणों को पूरा करने के संदर्भ में विस्तारित करता है और इसलिए, एक तकनीकी प्रकृति का महत्व ले सकता है: प्रक्रियाओं के इन समान सेट को किसी भी संख्या में अन्य स्प्लिसिंग कारकों पर लागू किया जा सकता है जो एसएनआरएनपी के साथ जुड़ते हैं ताकि यह जांच की जा सके कि ये कारक स्प्लिसोसोमल परिसरों पर कब और कैसे लोड होते हैं। splicing प्रतिक्रिया से mRNA उत्पाद गठन की निगरानी करने की क्षमता मजबूत सबूत है कि इन इकट्ठे spliceosomes वास्तव में कार्यात्मक हैं का गठन करता है। यह हमारी समझ को आगे बढ़ा सकता है कि स्प्लिसोसोम कैसे बनते हैं, क्योंकि प्रोटिओमिक दृष्टिकोण 17 का उपयोग करने वाली पिछली रिपोर्टें केवल किसी दिए गए परिसर में कुछ कारकों की उपस्थिति को सूचीबद्ध करती हैं, बजाय इसके कि कारकों को जटिल पर कैसे लोड किया जा सकता है।

स्प्लिसिंग में उनकी भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए अन्य प्रोटीन या snRNPs के लिए इन प्रक्रियाओं की सामान्य प्रयोज्यता की एक स्पष्ट सीमा एक विशिष्ट एंटीबॉडी की उपलब्धता है जो विशेष कारक के खिलाफ निर्देशित होती है जो कुशलतापूर्वक इसके संबंधित परिसर को अवक्षेपित करेगी। उदाहरण के लिए, कई खरगोशों (उदाहरण के लिए, # 24, # 49) से पॉलीक्लोनल एंटी-गैल 3 एंटीसेरा ने परमाणु अर्क या ग्लिसरॉल अंशों से गैल 3-यू 1 एसएनआरएनएपी कॉम्प्लेक्स को 3-5 (यू 1 एसएनआरएनए और यू 1 70के प्रोटीन सह-अवक्षेपित) से परमाणु अर्क या ग्लिसरॉल अंशों से एपोप्टोसिटेट किया (यू 1 एसएनआरएनए और यू 1 70के प्रोटीन सह-अवक्षेपित, गैल 3)। इसके विपरीत, Gal3, Mac-2 और NCL-GAL3 के खिलाफ निर्देशित दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, एक ही परिणाम देने में विफल रहे। मैक -2 और एनसीएल-जीएएल 3 के एपिटोप को गैल 3 पॉलीपेप्टाइड 29 के अमीनो-टर्मिनल डोमेन में मैप किया गया है और यह संभव है कि उनके संबंधित एपिटोप Gal3-U1 snRNP परिसर में सुलभ नहीं हैं। इसके अलावा, एक एंटीबॉडी-बाउंड फैक्टर (जैसे, Gal3) और इसके संबंधित कॉम्प्लेक्स (जैसे, U1 snRNP) अब पूर्व-mRNA या अन्य spliceosomal घटकों के साथ अतिरिक्त इंटरैक्शन बनाने में सक्षम नहीं हो सकते हैं। यह एंटीबॉडी द्वारा या मैट्रिक्स द्वारा शारीरिक हस्तक्षेप के कारण हो सकता है जिसके लिए एंटीबॉडी सहसंयोजक रूप से युग्मित है। इसलिए, ब्याज की प्रत्येक प्रणाली का मूल्यांकन मामले-दर-मामले के आधार पर किया जाना चाहिए। इन सीमाओं के बावजूद, हालांकि, ऐसा लगता है कि एक विशिष्ट स्प्लिसिंग कारक के निष्कर्षों में स्प्लिसिंग गतिविधि को पुनर्गठित करने के लिए मोतियों पर कॉम्प्लेक्स आत्मीयता- या इम्यूनो-चयनित का उपयोग करने की योजना आमतौर पर अन्य प्रणालियों पर लागू हो सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान MCB-0092919 और मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी इंट्राम्यूरल रिसर्च ग्रांट 09-CDFP-2001 (RJP के लिए) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट जीएम -38740 और मिशिगन AgBioResearch Project MICL02455 (JLW के लिए) द्वारा समर्थित किया गया है।

MINX पूर्व mRNA सब्सट्रेट splicing assays में इस्तेमाल किया डॉ सुसान Berget (Baylor College of Medicine, ह्यूस्टन, TX, संयुक्त राज्य अमेरिका) से एक तरह का उपहार था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-U1 snRNP The Binding Site Hu ENA-RNP #33471 human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filter Fisher Scientific Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) for filtering solutions containing Tris
centrifuge International Equipment Company IEC Model PR-6 for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 159220-5G for treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP) Sigma-Aldrich 80490-5G for cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cell BioRad Laboratories, Inc Mini-Protean II for SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000-100ml for blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis system Hoefer, Inc HSI SE 500 Series for separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryer BioRad Model 224 for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membrane GE Healthcare RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) Pierce Microdialyzer System 100 for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff) Pierce 66310 for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milk Spartan Stores Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B Millipore-Sigma GE 17-0780-01 for coupling antibody to beads
Proteinase K Millipore-Sigma P2308-5mg for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasin Promega N2111 for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotator Lab Industries, Inc  Labquake Shaker 400-110 for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-Solve Research Products International Corp. No. 111177 scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counter Beckman Instruments LS6000SC scintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentrator Savant SVC 100H for drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unit Hoefer, Inc Hoefer TE Series Transphor for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

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References

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जैव रसायन अंक 166 पूर्व mRNA splicing spliceosome सेल मुक्त splicing परख ग्लिसरॉल ढाल फ्रैक्शनेशन U1 snRNP परिसर गैलेक्टिन
एक Galectin-3 द्वारा Splicing गतिविधि के पूरक - मोती पर U1 snRNP परिसर
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Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads. J. Vis. Exp. (166), e61990, doi:10.3791/61990 (2020).

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