Summary
Artikeln beskriver ett snabbt protokoll för att gonadectomize och ta prov på blod från den lilla teleostfisken, med hjälp av japanska medaka (Oryzias latipes) som modell, för att undersöka sex steroiders roll i djurfysiologi.
Abstract
Sex steroider, produceras av gonads, spela en viktig roll i hjärnan och hypofysen vävnad plasticitet och i neuroendokrina kontroll av reproduktion i alla ryggradsdjur genom att ge feedback till hjärnan och hypofysen. Teleost fiskar har en högre grad av vävnad plasticitet och variation i reproduktiva strategier jämfört med däggdjur och verkar vara användbara modeller för att undersöka rollen av kön steroider och de mekanismer genom vilka de agerar. Avlägsnandet av den huvudsakliga källan till sex steroid produktion med gonadectomy tillsammans med blodprov för att mäta steroidnivåer har varit väletablerad och ganska genomförbar i större fisk och är en kraftfull teknik för att undersöka rollen och effekterna av sex steroider. Dessa tekniker ger dock upphov till utmaningar när de implementeras i små teleostmodeller. Här beskriver vi steg-för-steg förfarandena av gonadectomy hos både män och kvinnliga japanska medaka följt av blodprov. Dessa protokoll visas vara mycket genomförbara i medaka anges av en hög överlevnad, säkerhet för livslängden och fenotyp av fisken och reproducerbarhet när det gäller kön steroid clearance. Användningen av dessa förfaranden i kombination med de andra fördelarna med att använda denna lilla teleost modell kommer att avsevärt förbättra förståelsen av återkopplingsmekanismer i neuroendokrina kontrollen av reproduktion och vävnad plasticitet som tillhandahålls av kön steroider i ryggradsdjur.
Introduction
Hos ryggradsdjur, kön steroider, som huvudsakligen produceras av gonaderna, spela viktiga roller i regleringen av brain-hypofysen-Gonadal (BPG) axeln genom olika feedback mekanismer1,2,3,4,5. Dessutom, kön steroider påverkar spridningen och aktiviteten av nervceller i hjärnan6,7,8 ochendokrina celler, inklusive gonadotropes, i hypofysen9,10, och därmed tjäna avgörande roller i hjärnan och hypofysen plasticitet. Trots relativt god kunskap hos däggdjur, mekanismen för BPG axelreglering medierad av kön steroider är långt ifrån förstådd i icke-däggdjur arter, vilket leder till dålig förståelse för evolutionära bevarade principer11. Det finns fortfarande ett begränsat antal studier dokumenterar sex steroiders roll på hjärnan och hypofysen plasticitet, vilket ökar behovet av ytterligare undersökningar av könssteroidernas roll och effekter på olika ryggradsdjur arter.
Bland ryggradsdjur har teleoster blivit kraftfulla modelldjur för att ta itu med många biologiska och fysiologiska frågor, inklusivestressrespons 12,13,tillväxt14,15,näringsfysiologi16,17 och reproduktion2. Teleoster, där könssteroider mestadels representeras av estradiol (E2) hos kvinnor och 11-ketotestosteron (11-KT) hos män18,19, har länge varit tillförlitliga experimentella modeller för att undersöka den allmänna principen om reproduktion över arter. Teleosts visar unikhet i sin hypotalamus-hypofysenanslutning 20,21 och distinkta gonadotrope celler22, som ibland är praktiska för att klargöra regleringsmekanismer. På grund av deras mottaglighet för både laboratorie- och fältexperiment erbjuder teleoster dessutom många fördelar jämfört med andra organismer. De är relativt billiga att köpa och underhålla23,24. I synnerhet är små teleostmodeller som zebrafisk (Danio rerio) och den japanska medaka (Oryzias latipes), arter med mycket hög fecunditet och en relativt kort livscykel som möjliggör snabb analys av genfunktion ochsjukdomsmekanismer 23, vilket ger ännu större fördelar när det gäller att ta itu med en mängd biologiska och fysiologiska frågor, med tanke på de många välutvecklade protokoll och genetiska verktygslåda som finns tillgängliga för dessa arter25.
I många studier har avlägsnandet av gonad (gonadectomy) tillsammans med blodprovtagningstekniker använts som en metod för att undersöka många fysiologiska frågor, inklusive dess inverkan på ryggradsdjur reproduktiv fysiologi hos däggdjur26,27,28,fåglar29 och amfibier30. Även om gonadectomy effekten på reproduktiv fysiologi kan alternativt efterliknas av kön steroid antagonister, såsom tamoxifen och klonifen, effekten av drogerna verkar vara inkonsekvent på grund av bimodala effekter31,32. Kronisk exponering för en sex steroid antagonist kan leda till äggstockscancer utvidgningen33,34, som kan inaktivera observation av dess effekter för långsiktiga ändamål på grund av en ohälsosam fenotyp. Dessutom, Det är omöjligt att utföra ett återhämtningsexperiment efter sex steroid antagonist behandling, att motivera den specifika effekten av vissa kön steroider. Tillsammans med dessa ovannämnda punkter, andra kompromisser av kön steroid antagonist användning har granskats utförligt31,32. Därför, gonadectomy fortfarande visas idag som en kraftfull teknik för att undersöka rollen av kön steroider.
Medan gonadectomy och blodprovstekniker är relativt lätta att utföra i större arter, såsom europeisk havsabborre (Dicentrarchus labrax)35, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)36, dogfish (Scyliorhinus canicula)37 och havskatt (Heteropneustes fossilis och Clarias bathracus)38,39, de väcker utmaningar när de appliceras i små fiskar som medka. Till exempel är användningen av Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 mindre genomförbar och verkar vara benägen för överdriven fysisk skada för små fiskar. Dessutom är ett gonadectomy förfarande som vanligtvis används för större fisk40 inte lämplig för små fiskar som kräver hög precision för att undvika överdriven skada. Slutligen är blodprov utmanande på grund av den begränsade tillgången till blodkärl och den lilla mängden blod hos dessa djur. Därför är ett tydligt protokoll som visar varje steg av gonadectomy och blodprov i en liten teleost av betydelse.
Detta protokoll visar steg-för-steg förfarandena av gonadectomy följt av blodprov i japanska medaka, en liten sötvatten fisk infödda till Östasien. Japanska medaka har ett sekvenserat genom, flera molekylära och genetiska verktygtillgängliga 25, och ett genetiskt könsbestämningssystem som möjliggör undersökning av sexuella skillnader före sekundära sexuella egenskaper eller gonads är välutvecklade41. Intressant nog har japansk medaka smälta gonads som strider mot många andra teleostarter42. Dessa två tekniker tillsammans tar bara 8 minuter totalt och kommer att slutföra listan över videoprotokoll som redan finns för denna art som inkluderade märkning avblodkärl 43, patchklämma på hypofysenavsnitt 44 och hjärnneuroner45, och primär cellkultur46. Dessa tekniker kommer att göra det möjligt för forskarsamhället att undersöka och bättre förstå könssteroidernas roller i feedbackmekanismer samt hjärnan och hypofysplastik i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök och djurhantering genomfördes i enlighet med rekommendationerna om försöksdjurs välbefinnande vid Norges universitet. Försök med gonadektomi godkändes av Den norska myndigheten för livsmedelssäkerhet (FOTS ID 24305).
OBS: Experimenten utfördes med vuxna manliga och kvinnliga (6-7 månader gamla, vikt ca 0,35 g, längd ca 2,7 cm) japanska medaka. Könet bestämdes genom att skilja de sekundära sexuella egenskaperna, såsom storleken och formen på dorsal och analfena, som beskrivsi 42,47.
1. Förberedelser av instrument och lösningar
- Förbered bedövningslagerlösning (0,6% Tricaine).
- Späd 0,6 g trikain (MS-222) i 100 ml 10x fosfatbuffert saltlösning (PBS).
- Fördela 1 ml trikainlagerlösning i flera 1,5 ml plaströr och förvara vid -20 °C tills den används.
- Förbered återvinningsvatten (0,9% NaCl-lösning) genom att tillsätta 18 g NaCl i 2 L akvarievatten. Förvara lösningen i rumstemperatur tills den används.
- Förbered snittverktygen genom att bryta en rakhyvel diagonalt för att få en skarp punkt (Figur 1A).
- Bered blod antikoagulantialösning (0,05 U/μL natrium heparin) genom att späda ut 25 μL natrium heparin i 500 μL 1x PBS. Förvara den antikoagulantialösningen vid 4 °C tills den används.
- Förbered två glasnålar från en 90 mm lång glas kapillär genom att dra en glas kapillär med en nåldragare (Figur 1B) enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Glasnålens ytterdiameter är 1 mm, medan innerdiametern är 0,6 mm. - Förbered ett 1,5 ml plaströrslock genom att klippa locket och göra ett hål som passar med nålens ytterdiameter (Figur 1C). För att göra hålet, värm ena änden av 9 mm glas kapillär och hugg den uppvärmda glas kapillären genom locket. Alternativt kan du använda en nål för att hugga genom locket tills hålets diameter passar med 9 mm glas kapillär.
2. Gonadectomy förfarande
- Förbered 0,02% av bedövningslösningen genom att späda ut ett rör trikainlager (0,6%) i 30 ml akvarievatten.
- Förbered dissekeringsverktyg inklusive en ultrafin och två fina tångar (en med relativt bred spets), liten sax, nylontråd och rakhyvel enligt beskrivningen i steg 1.3.
- Söv fisken genom att sätta den i 0,02% bedövningslösning i 30-60 sekunder.
OBS: Anestesin beror på fiskens storlek och vikt och måste anpassas. För att säkerställa att fisken är helt sövd kan fiskkroppen klämmas försiktigt med tång. Om fisken inte reagerar kan gonadectomy startas. - Ta ut fisken från bedövningslösningen och placera fisken horisontellt på sidan, ur vattnet under ett dissekeringsmikroskop.
- Ovariektomi (OVX) hos kvinnor
- Ta bort ägg med oviposited (ägg som hänger utanför kvinnokroppen) om några och skrapa vågen i snittområdet (figur 2A).
- Gör försiktigt ett snitt som är ca 2-2,5 mm långt mellan revbenen, mellan bäcken- och analfenorna (figur 2A), med rakbladet. Nyp sedan försiktigt fisk buken medan du tar ut äggstockarna lite efter en liten stund med fina tång med bred spets.
- Skär äggstockens ände med fina tångar och lägg äggstockarna åt sidan (figur 2B).
OBS: Var försiktig så att du inte bryter äggstockssäcken om möjligt. Om äggstockssäcken är bruten, ta bort eventuella gonadspår så fullständigt som möjligt utan att lämna några icke ägglossade ägg.
- Orkidéektomi hos män
- Gör försiktigt ett snitt mellan revbenen ovanför anusen (figur 2A), och öppna upp snittet långsamt med hjälp av fina tångar.
- Ta försiktigt tag i testiklar med hjälp av de fina tångarna och ta långsamt ut testiklar. Skär därefter provikelens ände för att helt avlägsna testikelarna (figur 2B). För manlig orkidéektomi liknar alla preparat hos kvinnor fram till snittdelen. När du tar tag i testiklar erhålls ibland fettet som liknar testiklar. Men efter att ha återställt fettet är det möjligt att försöka hitta testikelerna igen (figur 2B).
OBS: För både män och kvinnor är det viktigt att minimera snittstorleken i buken för att förhindra överdriven skada som kan leda till dödlighet. Ibland kan tarmarna också dyka upp genom snittet tillsammans med gonaderna, så se till att de returneras ordentligt inuti snittet före stängning. Förkunskaper om äggstockar och testikörer plats i medaka buken är avgörande.
- Suturera snittet på samma sätt hos män och kvinnor (figur 3).
- Placera nylongängan bredvid snittområdet och hugg huden från snittets högra sida genom innerkroppshålan med ultrafina tångar för att ta in tråden med fina tångar (bild 3, 1-2).
- Stick huden från vänster sida av snittet genom yttre kroppshålan för att ta ut tråden ( Bild 3, 3-4).
- Stäng snittöppningen och gör två knop och klipp den överdrivna gängan (Bild 3, 4-6).
OBS: Suturen måste vara tillräckligt tät, och den återstående tråden på fisken måste vara tillräckligt lång för att förhindra lossning av suturen. Hela proceduren från anestesi till suturing tar vanligtvis upp till 6 minuter. Längre tid kan leda till dödlighet. - Lägg fisken i återhämtningsvattnet och lämna dem i minst 24 timmar innan du överför dem till akvariesystemet.
OBS: Gonadectomized fisk visar vanligtvis normalt beteende efter 1-2 timmar i återvinningsvattnet. Därför, beroende på experimentsyftet, kan man prova fisken efter detta tidsintervall.
3. Blodprovsförfarande
- Förbered verktygen: en glasnål, en silikonkapillär, ett plaströr med ett hål, ett tomt 1,5 ml plaströr, en minicentrifuge och tejp.
- Bedöva fisken med 0,02 % bedövningslösning enligt beskrivningen i steg 2.1 och placera fisken under ett dissekeringsmikroskop i vertikalt läge (figur 4A). Placera fisken på en ljus yta för att underlätta visualiseringen av den kaudala punkterings venen.
- Montera blodlådan genom att fästa en glasnål på silikonkeillären (Figur 4B). Bryt nålens spets med breda spetstångar och täck nålens insida med antikoagulantialösning genom att suga och blåsa.
OBS: Användning av en sugmaskin och en silikon kapillär med minst 50 cm längd rekommenderas för säkerhetsåtgärder för att undvika direkt kontakt med blodet vid sugning. Se dessutom till att nålspetsens öppning är tillräckligt stor för att tillåta dragning av blodet. - Rikta nålen mot fiskens peduncle-område, sikta på den kaudala peduncle venen (Figur 5A) och dra blodet med munnen tills minst en fjärdedel av nålens totala volym fylls (Figur 5B).
OBS: Det är viktigt att sluta suga innan nålen avlägsnas från fiskkroppen. - Släpp nålen och sätt en bit tejp i närheten av nålens skarpa sida. Placera locket med ett hål på ett uppsamlingsrör och sätt nålen i röret genom hålet med nålspetsen på utsidan (Bild 5C).
- Lägg fisken i återhämtningsvattnet och lämna dem i minst 24 timmar innan du överför dem till akvariesystemet.
OBS: För att utföra en andra blodprovtagning från samma fisk, ta blodprov en vecka efter den första blodprovtagningen. - Flash snurra ner det insamlade blodet i 1-2 sekunder med 1000 x g vid rumstemperatur för att samla blodet i röret.
- Fortsätt direkt till nedströmsapplikationer eller förvara blodet vid -20 °C tills det används.
OBS: Se den tidigare studien för sex steroid extraktion från helblod48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver varje steg för att utföra gonadectomy och blodprov i en liten storlek modell teleost, den japanska medaka. Överlevnadsgraden för fisken efter ovariectomy (OVX) hos kvinnor är 100% (10 av 10 fiskar) medan 94% (17 av 18 fiskar) av hanarna överlevde efter orkidéektomi. Under tiden, efter blodprovet utfördes, överlevde alla (38 fiskar) fiskar.
Sham-operated honor visar oviposition (Figur 6A) och alla ägg befruktades och tillät embryonal utveckling (Figur 6B). Sham-operated män kunde också befrukta ägg efter endast 1-2 veckor. Två av sex delvis gonadectomized honor uppfödda med delvis gonadectomized män visade också oviposition med 100% av befruktade ägg efter 2 månader. Däremot observerades ingen oviposition hos kvinnor eller befruktning av män i helt gonadectomized fisk, även efter 4 månader.
När fiskens kroppsform utförs korrekt ändras fiskens kroppsform något (figur 7A), och ingen gonadbit bör finnas kvar efter gonadektomiproceduren (figur 7B). Under tiden, 4 veckor post-gonadectomy, snitt och sutur helt försvann (Figur 8), och efter 4 månader, alla gonadectomized fisk fortfarande visade friska fenotyp, och ingen gonadal vävnad hittades.
E2-blodkoncentrationer hos kvinnor (tabell 1), mätt med ELISA enligt tillverkarens instruktioner, visade att E2-halten i OVX-fisk är betydligt lägre än hos skenopererade fiskar 24 timmar efter operationen (s. < 0.00001). Efter 4 månader är E2-nivån i OVX-fisk också betydligt lägre än hos skenopererade fiskar(p < 0,00001) och visar ingen signifikant skillnad jämfört med den på 24 timmar efter OVX-fisken(p > 0,05). Slutligen visar delvis OVX-fisk, där endast 1/3 till 1/2 av gonad avlägsnades, betydligt lägre E2-halter än skenopererad fisk (p = 0,0437) och betydligt högre E2-nivåer än helt OVX-fisk (p < 0,00001) (Figur 9A).
På samma sätt är koncentrationen 11 KT hos orkidédektomerad fisk signifikant lägre hos hanar ( tabell1) och är betydligt lägre än hos skenopererad fisk 24 timmar efter operationen (p < 0,00001). Nivån på 11 KT i orkidédektomerad fisk efter 4 månader är också betydligt lägre än hos skenopererad fisk(p < 0,00001) och visar ingen skillnad jämfört med 24 timmar postorktektomerad fisk (p > 0,05). Slutligen uppger delvis orkidédektomerad fisk betydligt lägre halter på 11 KT än skenopererad fisk (p = 0,0428) och betydligt högre halter på 11 KT än helt orkidéektomerad fisk (p < 0,00001) (Figur 9B).
Figur 1. Instrument förberedelse. A)Rakblad för gonadektomi,(B)glasnål för blodextraktion och(C)ett plaströr tillsammans med ett lock med ett hål för bloduppsamling. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Placering av snittområdet. A) Ritning av snittområdet som ligger mellan revbenen, mellan bäcken- och analfenorna hos honor (vänster panel) och hanar (höger panel); B) gonadborttagning hos kvinnor (vänster panel) och hanar (höger panel), vita cirklar som visar den gemensamma delen, vit pil som visar testiklarna och den svarta pilen som visar fettet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3. Suturproceduren. 1) Ett hål görs på höger sida av snittet med ultrafina tångar. 2) Nylontråden passerar genom huden med hålet i 1. 3) Ett hål görs på vänster sida av snittet. 4) Nylongängan passerar genom hålet i 3. 5) En överhandsknut görs två gånger för att stänga snittet. 6) Överflödig gänga skärs. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. Fiskposition under blodprov (A), installation av glasnål med silikon kapillär (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5. Sugområdet för blodprov (A), utdraget blod (B) och bloduppsamlingssteg (C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6. Sham-operated fisk visar oviposition av ägg spetsiga med vit pil (A) och befruktade ägg (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7. Morfologiska (A) och anatomiska (B) utseende av intakt och gonadectomized fisk. Vita pilar (övre paneler) visar operationsmärket på gonadectomiserad fisk. Svarta pilar (bottenpaneler) visar gonads i intakt fisk. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 8. Kirurgi märken i manliga och kvinnliga fisk efter 4 veckor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 9. Blodnivåer av E2 hos kvinnor (A) och 11-KT hos manliga (B) japanska medaka, 24 timmar efter skenoperation (kontroll), delvis gonadectomy eller gonadectomy och 4 månader efter gonadectomy (OVX, ovariectomy hos kvinnor; Cas, orkidédectomy hos män). De statistiska analyserna utfördes med hjälp av One Way ANOVA följt av Tukey Post Hoc-test. Olika bokstäver (a-c) visar signifikanta skillnader (p-värde < 0,05). Data i diagrammet tillhandahålls som medelvärde + SD, n = 5. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| E2-nivåer (Honor) | 11-KT nivåer (Män) | |
| Skenstyrd | 4,15 ± 0,5 (n = 5) | 10,38 ± 1,32 (n = 5) |
| Delvis gonadectomerad | 3,37 ± 0,6 (n = 5) | 8,37 ± 1,92 (n = 5) |
| 24h post-gonadectomy | 0,36 ± 0,2 (n = 5) | 0,4 ± 0,2 (n = 5) |
| 4 månader efter gonadectomy | 0,54 ± 0,28 (n = 5) | 0,74 ± 0,22 (n = 5) |
Tabell 1. E2- och 11-KT-nivåer (ng/ml) hos kvinnor och män av sham-operated och gonadectomized och delvis gonadectomized fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som rapporterats i tidigare litteratur, gonadectomy och blodprov har länge använts i andra modellarter för att undersöka frågor relaterade till rollen av kön steroider i reglering av BPG axeln. Dessa tekniker verkar dock vara mottagliga endast för större djur. Med tanke på den lilla storleken på den vanliga teleostmodellen, japansk medaka, tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för gonadectomy och blodprov som är genomförbart för denna art.
Det faktum att överlevnadsgraden för gonadectomiserad fisk nådde nästan 100% indikerar att gonadectomy förfarandet är möjligt att tillämpas på medaka. På samma sätt påverkar förfarandet för blodprov inte fiskens överlevnadsförmåga, vilket framgår av överlevnadsgraden på 100% efter att ha genomgått detta förfarande. Dessutom visar skenstyrda honor uppfödda tillsammans med skenstyrda män oviposition och 100% befruktade ägg, vilket indikerar att snittet och suturförfarandet inte påverkar fiskens reproduktion. Med andra ord var de friska nog att leka. Dessutom, delvis gonadectomized fisk visar jämförbara koncentrationer av kön steroider till sham-operated fisk, och oviposition hos vissa honor samt befruktning av ägg av män observerades i de delvis gonadectomized fisk. Dessa resultat tyder på att förfarandet för gonadectomy bör utföras med hög precision, vilket innebär att äggstockarna eller testiklar bör tas bort helt.
Som visas i figur 8försvann snitt- och suturmärket på fisken helt 4 veckor efter gonadektomin, och fisken lever fortfarande och ser frisk ut 4 månader efter operationen. Dessa indikerar att driftsförfarandet är säkert för fisken för långsiktiga ändamål och inte påverkar fiskens livslängd. Dessutom observerades inga gonads efter 4 månader. Detta bekräftas av de låga nivåerna av E2 och 11-KT som fortfarande liknar dem som finns i gonadectomiserad fisk efter 24 timmar.
Nivåerna av E2 och 11-KT i gonadectomized fisk är betydligt lägre än skenopererad fisk, redan efter 24 timmar post-gonadectomy och förblir lägre i fisk som provtagits 4 månader efter gonadectomy. De betydligt lägre köns steroidnivåerna i gonadectomized fisk jämfört med kontroll har observerats i tidigare studier på dogfish37,havskatt39 och medaka48. Dessa konsekventa bevis tyder på att gonadectomy förfarandet beskrivs i protokollet är en tillförlitlig teknik för att rensa cirkulerande kön steroider.
Eftersom detta förfarande inte förlitar sig på FADS som visasi 40, bör gonadectomy utföras så snabbt som möjligt för att förhindra dödlighet under kirurgi. Användningen av FADS gör det möjligt att bibehålla driftsrytmen eftersom detta verktyg möjliggör kontinuerligt bedövningstillstånd för fisken trots att det utsätts för luften. På grund av dess lägre genomförbarhet i den lilla teleosten som medaka kan användningen av FADS dock inte utföras med den storleken på fisken. Dessutom, till skillnad från det tidigare gonadectomy protokollet i större fisk som gör det möjligt för bred snitt att nå gonad, tillåter protokollet som beskrivs i detta manuskript inte omfattande snitt för att undvika överdriven skada på den lilla fisken. Därför bör man vara mycket försiktig när man försöker komma åt gonad med hjälp av tång för att förhindra skador i andra vävnader inuti fiskkroppshålan.
Protokollet bygger på en snabb och ren procedur. Träning rekommenderas därför starkt tills man når en hög framgångsgrad, vilket indikeras av en hög överlevnadsgrad hos fisken efter gonadectomy samt fullständig avlägsnande av gonaderna (se skillnaden mellan morfologiska och anatomiska utseende hos fisken före och efter framgångsrik gonadectomy i figur 7). Faktum är att många faktorer kan påverka förfarandets framgångsgrad, inklusive anestesiperioden, vidden av snittet, suturens noggrannhet och prydlighet under förfarandet. En annan viktig punkt är att man bör förbereda hälsosam fisk genom att behålla fisken optimalt innan man utför protokollet.
När det gäller blodprovsförfarandet har de tidigare studierna försökt ta blodprov från medaka48 och zebrafisk49,50,51, men förfarandet tillåter inte upprepad blodprovtagning i samma fisk eftersom blodet tas efter att fisken avlivats. Upprepad blodprovtagning har visats med zebrafisk i en annanstudie 52, men vi rapporterar denna typ av protokoll för första gången i medaka.
Utvärderingen av könssteroidkoncentrationer utförs ofta med hjälp av en enzym-linked immunosorbent analys (ELISA) kit, och det har funnits många ELISA kit kommersiellt tillgängliga för olika typer av sex steroider. På grund av den låga mängden blod som samlas in under blodprovet är nedströmsanalyserna avsedda för helblod. Tidigare studier har visat att det finns en skillnad i den uppmätta nivån av cirkulerande steroidnivåer extraheras från helblod och plasma53,54. Därför, skillnaden i kön steroid nivåer från helblod och plasma måste valideras innan du utför det verkliga experimentet med hjälp av protokollet.
Som dokumenterats i tidigare studier med olika djurmodeller kommer det protokoll som beskrivs här att göra det möjligt att undersöka frågor relaterade till reproduktiv fysiologi med hjälp av en liten storlek teleost som modell. Faktum är att dessa tekniker redan har bidragit till att svara på frågor om regleringen av BPG-axeln och dess återkopplingsmekanismer, såsom inblandning av kiss1 (kisspeptin gen typ 1) som uttrycker nervceller i positiva feedback loopar55, östrogenmedierad reglering av kyss1 uttrycker nervceller i nucleus ventralis tuberis (NVT) och kiss2 (kisspeptin gen typ 2) uttrycker nervceller i preoptic område (POA)56, 57, det möjliga deltagandet av östrogenreceptor β1 (Esr2a) i nedreglerande fsh uttrycksnivå hos kvinnliga japanska medaka58 samt profilen för dygnsrytmen E2 hos honfisk48. Dessutom, sedan tidigare studier visat att kön steroider också påverka spridningen av gonadotrope celler i hypofysen av teleosts59,60, Det är spännande att undersöka effekterna av kön steroid clearance efter gonadectomy på hypofysen plasticitet.
Blod provtagningstekniken inte bara kan användas för sex steroid analys, men också för andra blodinnehåll analys, inklusive blodsockernivåer. Protokollet kan faktiskt också tillämpas för blodsockermätningar som visas i zebrafisk52 och medaka61. Därför kan denna teknik utökas för att ta itu med forskningsfrågor inom andra fysiologiområden.
Slutligen är protokollen som beskrivs här avsedda och optimerade för vuxna japanska medaka, och resultaten på grund av olika storlek på fisk och material som används under procedurerna kan variera. Eftersom medaka vänster och höger äggstockar / testikörer smälts samman, vilket kan ge en viktig fördel för gonadectomy, kan detta protokoll behöva flera anpassningar innan det används i andra arter där detta inte är fallet, till exempel i zebrafisk. Således bör en optimering enligt valet av laboratorieutrustning och fiskstorlek beaktas innan dessa protokoll testas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Lourdes Carreon G Tan för hennes hjälp i fiskhållningen. Detta arbete finansierades av NMBU, Grants-in-Aid från Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Anslagsnummer 18H04881 och 18K19323) och bidrag till grundläggande vetenskapliga forskningsprojekt från Sumitomo Foundation till S.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
| Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
| Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
| Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
| Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
| Razor blade | - | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
| Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |
References
- Weltzien, F. -A., Andersson, E., Andersen, Ø, Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Yaron, Z., Levavi-Sivan, B. Encyclopedia of Fish Physiology. Farrell, A. P. 2, Academic Press. 1500-1508 (2011).
- Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
- Taranger, G. L., et al.
- Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
- Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
- Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
- Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
- Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
- Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
- Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
- Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
- Wendelaar Bonga, S. E.
- Mommsen, T. P.
- Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
- MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
- Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
- Borg, B.
- Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
- Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
- Zambrano, D.
- Weltzien, F. -A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones - Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
- Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
- Powers, D.
- Naruse, K. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 19-37 (2011).
- Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
- Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
- Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
- Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
- McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
- Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
- Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
- Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
- Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
- Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
- Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
- Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
- Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
- Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
- Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
- Hori, H. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 1-16 (2011).
- Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. Murata, K., et al. 2, John Wiley & Sons. 49-95 (2019).
- Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
- Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
- Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
- Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
- Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
- Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
- Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
- Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
- Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).
