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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Génération et expansion de cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62206
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,4, 1,2,5, 3, 1,2,5,6
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour générer et développer de manière robuste des cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient.

Abstract

La génération de cardiomyocytes spécifiques au patient à partir d’une seule prise de sang a suscité un énorme intérêt pour la médecine de précision sur les maladies cardiovasculaires. La différenciation cardiaque à partir des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) est modulée par des voies de signalisation définies qui sont essentielles au développement cardiaque embryonnaire. De nombreuses méthodes de différenciation cardiaque sur des plateformes 2D et 3D ont été développées avec diverses efficacités et rendements cardiomyocytaires. Cela a intrigué les chercheurs en dehors du terrain, car la variété de ces méthodes peut être difficile à suivre. Nous présentons ici un protocole complet qui élabore la génération et l’expansion robustes de cardiomyocytes spécifiques au patient à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). Nous décrivons d’abord un protocole de reprogrammation iPSC à haute efficacité à partir de l’échantillon de sang d’un patient en utilisant des vecteurs du virus Sendai non intégrés. Nous détaillons ensuite une méthode de différenciation monocouche médiée par de petites molécules qui peut produire de manière robuste des cardiomyocytes battants à partir de la plupart des lignées iPSC humaines. En outre, un protocole évolutif d’expansion des cardiomyocytes est introduit à l’aide d’une petite molécule (CHIR99021) qui pourrait rapidement étendre les cardiomyocytes dérivés du patient pour des applications de qualité industrielle et clinique. À la fin, des protocoles détaillés pour l’identification moléculaire et la caractérisation électrophysiologique de ces iPSC-CM sont décrits. Nous nous attendons à ce que ce protocole soit pragmatique pour les débutants ayant des connaissances limitées sur le développement cardiovasculaire et la biologie des cellules souches.

Introduction

La découverte de cellules souches pluripotentes induites par l’homme a révolutionné la médecine cardiovasculaire moderne1,2. Les CSPi humaines sont capables de s’auto-renouveler et de générer tous les types de cellules dans le cœur, y compris les cardiomyocytes, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les fibroblastes cardiaques. Les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC des patients (iPSC-MC) peuvent servir de ressources indéfinies pour modéliser les maladies cardiovasculaires génétiquement héréditaires (MCV) et tester la sécurité cardiaque pour les nouveaux médicaments3. En particulier, les patients iPSC-CM sont bien placés pour étudier les étiologies génétiques et moléculaires des MCV dérivées de défauts dans les cardiomyocytes, tels que le syndrome du QT long4 et la cardiomyopathie dilatée (DCM)5. Combinés à l’édition du génome médiée par CRISPR / Cas9, les iPSC-CM des patients ont ouvert une voie sans précédent pour comprendre la base génétique complexe des MCV, y compris les malformations cardiaques congénitales (CHD)6,7,8. Les iPSC-CM humains ont également montré le potentiel de servir de sources cellulaires autologues pour reconstituer le myocarde endommagé lors d’une crise cardiaque9. Au cours des dernières années, il est devenu primordial de générer des iPSC-CM humains de haute qualité avec des sous-types définis (auriculaire, ventriculaire et nodal) pour la régénération cardiaque et les tests de médicaments10.

La différenciation cardiaque par rapport aux CSPi humaines a été très avancée au cours de la dernière décennie. Les méthodes de différenciation sont passées de la différenciation spontanée basée sur le corps embryoïde (EB) à la différenciation cardiaque chimiquement définie et dirigée11. Les molécules de signalisation clés essentielles au développement du cœur embryonnaire, telles que Wnt, BMP, Nodal et FGF, sont manipulées pour améliorer la différenciation des cardiomyocytes des CSPi humains10,12. Les progrès significatifs comprennent la modulation séquentielle de la signalisation Wnt (activation suivie d’inhibition) pour une génération robuste de cardiomyocytes à partir de CSPi humains13,14. Des recettes de différenciation cardiaque chimiquement définies ont été explorées pour faciliter la production à grande échelle de cardiomyocytesbattants 15,16, qui ont le potentiel d’être mis à niveau vers la production industrielle et clinique. De plus, l’expansion robuste des premiers iPSC-CM humains est obtenue par exposition à l’activation constitutive de Wnt à l’aide d’un petit produit chimique (CHIR99021)17. Plus récemment, les cardiomyocytes spécifiques au sous-type sont générés par manipulation des voies de signalisation de l’acide rétinoïque (PR) et de Wnt à des fenêtres de différenciation spécifiques lors de l’engagement de la lignée cardiomyocytaire des CSPi humaines18,19,20,21,22.

Dans ce protocole, nous détaillons une procédure de travail pour la génération et la prolifération robustes de MC humaines provenant de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient. Nous présentons des protocoles pour 1) reprogrammer les PBMC humains en iPSC, 2) la génération robuste de cardiomyocytes battants à partir d’iPSC humains, 3) l’expansion rapide des iPSC-CM précoces, 4) la caractérisation moléculaire des iPSC-MC humains et 5) la mesure électrophysiologique des iPSC-CM humains au niveau d’une seule cellule par pince de patch. Ce protocole couvre les procédures expérimentales détaillées sur la conversion des cellules sanguines des patients en cardiomyocytes battants.

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Protocol

Les protocoles expérimentaux et le consentement éclairé pour les sujets humains ont été approuvés par le Comité d’examen institutionnel (CISR) du Nationwide Children’s Hospital.

1. Préparation des milieux de culture cellulaire, des solutions et des réactifs

  1. Préparer les supports PBMC
    1. Mélanger 20 mL de milieux de culture PBMC basaux (1x) et 0,52 mL de supplément. Ajouter 20 μL de SCF et de FLT3 chacun (concentration en stock : 100 μg/mL), 4 μL d’IL3, d’IL6 et d’EPO chacun (concentration en stock : 100 μg/mL) et 200 μL d’alternative À la L-glutamine (100x). Mélangez-les bien. Filtrer dans une hotte stérile à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm. Nommez-le comme Complete Blood Media.
    2. Mélanger 20 mL de milieux de culture PBMC basaux (1x) et 0,52 mL du supplément. Ajouter 200 μL d’alternative À la L-glutamine (100x). Mélangez-les bien. Filtrer à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm. Nommez ceci comme Supplément Blood Media.
  2. Préparer le support E8 complet
    1. Mélanger 500 mL de milieu basal E8 et 10 mL de supplément E8 (décongelé pendant la nuit à 4 °C) pour obtenir un milieu E8 complet. Équilibrer à la température ambiante (RT) avant utilisation.
  3. Préparer les supports de passage iPSC
    1. Ajouter 40 μL d’inhibiteur de roche Y-27632 (dilution 1:5 000, concentration en stock : 10 mM) à 200 mL de milieu E8 complet. Mélangez bien. Équilibrez à RT avant utilisation.
  4. Préparer les milieux de différenciation cardiomyocytaire
    1. Média I : Mélanger 500 mL de RPMI1640 avec 10 mL de B27 moins supplément d’insuline (50x).
    2. Milieu II : Ajouter un volume approprié de CHIR99021 (inhibiteur de GSK3) au milieu I (concentration finale de CHIR99021 de 6 μM). Mélanger.
    3. Milieu III : Ajouter un volume approprié de stock d’IWR-1 (inhibiteur de Wnt) au milieu I (concentration finale d’IWR-1 de 5 μM). Mélanger.
    4. Média IV : Mélanger 500 mL de RPMI1640 avec 10 mL de supplément de B27 (50x). Mélanger.
    5. Média V : Mélanger 500 mL de RPMI1640 (sans glucose) avec 10 mL de supplément de B27 (50x). Mélanger.
    6. Média VI : Ajouter un volume approprié de stock de CHIR99021 au média IV (concentration finale de CHIR99021 de 2 μM). Mélanger.
  5. Préparer les supports de transmission iPSC-CM
    1. Ajouter 10 mL de Knockout Serum Replacement (KSR) à 90 mL de Média IV (concentration finale de KSR : 10 %). Bien mélanger.
  6. Préparer les supports de congélation iPSC-CM
    1. Ajouter 1 mL de DMSO à 9 mL de KSR (concentrations finales : 10 % de DMSO/90 % de KSR) et bien mélanger.
  7. Préparer des plaques à revêtement moyen de la matrice de membrane basale
    1. Décongeler le milieu de la matrice de la membrane basale à 4 °C pendant la nuit et aliquote dans des tubes de 1,5 mL. Ajouter 1 mL de ce milieu à 250 mL de milieu DMEM/F12 (dilution 1:250) et bien mélanger. Appliquer 2 mL de la solution diluée par puits dans une plaque à 6 puits et incuber dans 5 % de CO2 à 37 °C pendant 30 min avant utilisation.

2. Reprogrammation iPSC des PBMC

  1. Séparer les PBMC des échantillons de sang.
    1. Prélever des échantillons de sang de patients (~5 mL) et les transférer dans des tubes de séparation des cellules sanguines (voir tableau des matériaux). Mélanger en inversant 10x.
    2. Centrifuger à 1 500 x g pendant 30 min à température ambiante.
    3. Retirez soigneusement les tubes et vaporisez avec de l’éthanol à 70%. Sous une hotte de biosécurité, retirez les bouchons sans perturber les cellules mononucléaires (couche bouffante). Les PBMC seront dans une couche blanchâtre juste sous la couche de plasma(Figure 1A). Recueillir toute la couche de buffy à l’aide d’une pipette de 1000 μL et transférer dans un tube conique de 15 mL.
    4. Comptez le numéro de cellule à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Faire tourner le tube à 300 x g pendant 25 min à RT.
    5. Jetez le surnageant. Laver avec 10 mL de DPBS (Ca2+/ Mg2+ libre).
    6. Faire tourner le tube à 300 x g pendant 15 min à RT.
    7. Retirez le surnageant. Remettre en suspension les pastilles de cellules dans 1 mL de milieu de congélation (KSR plus 10 % de DMSO). Ajustez la densité cellulaire pour faire 1 x10 6 cellules par flacon.
    8. Placer les cryoviaux PBMC dans un récipient de congélation cellulaire et conserver à -80 °C pendant la nuit. Transférer dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme le lendemain.
  2. Reprogrammation iPSC.
    1. Ajouter 3 mL de supplément de média sanguin dans un tube conique de 15 mL. Décongeler les PBMC au bain-marie à 37 °C et les transférer dans un tube conique. Tourner à 300 x g pendant 7 min à RT.
    2. Jetez le surnageant. Remettre en suspension les PBMC avec des supports sanguins complets. Ensemencez-les dans deux puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits (pas de matrice de membrane basale).
    3. Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant la nuit. Le lendemain, retirez doucement la moitié de l’ancien milieu (0,5 ml) et ajoutez 0,5 mL de milieu sanguin complet frais.
    4. Changez de média tous les deux jours en rafraîchissant la moitié des anciens médias.
    5. Après une semaine, lavez agressivement le puits avec 1 mL de média sanguin supplémentaire et transférez les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
    6. Comptez le numéro de cellule. Prendre 2 x 105 cellules et centrifuger à 300 x g pendant 7 min.
    7. Jetez le surnageant. Remettre en suspension des cellules avec 300 μL de milieu sanguin complet. Effectuer la transfection en ajoutant le volume approprié de vecteurs de reprogrammation du virus Sendai conformément aux instructions du fabricant. Transférez-les dans un puits d’une plaque de 24 puits (pas de matrice de membrane basale). Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant la nuit.
    8. Le lendemain, tournez à 300 x g pendant 7 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 2 mL de milieu sanguin complet. Transférer dans un puits d’une plaque de 6 puits pré-enduite d’une matrice de membrane basale. C’est le Jour 1 (J1).
    9. Ne touchez pas l’assiette le lendemain.
    10. Sur D3, retirez 1 mL de l’ancien support. Ajouter 1 mL de supplément de média sanguin.
    11. Répétez l’étape 2.2.10 sur D5.
    12. Sur D7, retirez 1 mL de l’ancien support. Ajoutez 1 mL de média E8 complet.
    13. Sur D8, répétez l’étape 2.2.12.
    14. Sur D9, supprimez l’ancien support. Ajoutez 2 mL de média E8 complet. On s’attend à ce que les cellules entièrement reprogrammées se fixent et commencent à former des colonies.
    15. Rafraîchissez avec 2 mL de média E8 complet chaque jour.
    16. Environ 2 semaines après la transduction du virus Sendai, de grandes colonies d’iPSC apparaîtront et seront prêtes à être cueillies.
    17. Coupez les colonies d’iPSC sous un stéréomicroscope dans le capot et transférez les colonies individuelles sur une plaque de 24 puits recouverte d’une matrice de membrane basale préchargée avec 0,5 mL de milieu de passage iPSC.
    18. Rafraîchissez avec 0,5 mL de milieu E8 complet chaque jour jusqu’à ce que les colonies d’iPSC deviennent suffisamment grandes pour passer dans une nouvelle plaque de 6 puits recouverte d’une matrice de membrane basale.

3. Maintenance et passage humains de l’iPSC

  1. Lorsque les CSPi humains atteignent plus de 90 % de confluence, supprimez les anciens supports. Rincer avec 3 mL de DPBS une fois.
  2. Ajouter 1 mL de 0,5 mM d’EDTA dans la solution DPBS. Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant 5-8 min.
  3. Éliminer l’EDTA par aspiration. Ajouter 1 mL de support de passage iPSC. Délogez manuellement les iPSC.
  4. Prendre 600-900 μL de suspension à cellule unique et les plaquer à nouveau sur une plaque de 6 puits recouverte d’une matrice de membrane basale (dilution: 1:6 à 1:10). Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant la nuit.
  5. Rafraîchissez avec 2 mL de média E8 complet chaque jour. Les cultures iPSC atteignent généralement la confluence après 3-4 jours.

4. Différenciation des cardiomyocytes chimiquement définie

  1. Cultiver des CSPi humaines dans des milieux E8 complets jusqu’à 95% confluent (3-4 jours).
  2. Supprimez l’ancien support. Ajouter 2 mL de média de différenciation CM II (6 μM CHIR dans RPMI1640 plus B27 moins supplément d’insuline) à chaque puits d’une plaque de 6 puits. C’est D0. Ne touchez pas à D1.
  3. Sur D2, remplacer par 2 mL de média de différenciation CM I (RPMI1640 plus B27 moins supplément d’insuline).
  4. Sur D3, remplacer par 2 mL de média de différenciation CM III (5 μM IWR-1 dans RPMI1640 plus B27 moins supplément d’insuline). Ne touchez pas à D4.
  5. Sur D5, remplacer par 2 mL de différenciation CM Media I.
  6. Sur D7, remplacer par 2 mL de MÉDIA DE DIFFÉRENCIATION CM IV (RPMI1640 plus supplément B27). Par la suite, actualisez les médias tous les deux jours.
  7. Sur D11 lorsque des cellules contractantes sont observées, remplacer par 2 mL de média de différenciation CM V (pas de glucose).
  8. Sur D13, remplacer par 2 mL de différenciation CM Media V.
  9. Sur D15, remplacer par 2 mL de différenciation CM Media IV.
  10. Sur D17-D21, remplacer par 2 mL de différenciation CM Media IV tous les deux jours.

5. Passage des iPSC-CM humains

  1. Retirez les vieux milieux et rincez les cellules avec 3 mL de DPBS une fois.
  2. Appliquer 1 mL de solution de dissociation CM (voir Tableau des matériaux)sur chaque puits d’une plaque de 6 puits. Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant 5-8 min.
  3. Dissocier mécaniquement les iPSC-CM en cellules uniques par pipetage vigoureux.
  4. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL. Ajouter 2 mL de milieu de passage CM (10% KSR dans RMPI1640 plus supplément B27) pour neutraliser la solution de dissociation CM.
  5. Tourner à 300 x g pendant 5 min à RT.
  6. Jetez le surnageant. Resuspendez les cellules avec un volume souhaité de milieux de passage CM. Ensemencez-les dans une plaque/un plat recouvert d’une matrice de membrane basale. Les iPSC-CM humains recommencent à battre 1 à 3 jours après le passage.

6. Expansion des iPSC-CM humains

  1. Rincez D10-12 en battant les iPSC-CM avec 3 mL de DPBS pour chaque puits d’une plaque de 6 puits une fois. Ajouter 1 mL de solution de dissociation CM (étape 5.2). Incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant 7-10 min.
  2. Dissocier mécaniquement les iPSC-CM en cellules uniques par pipetage vigoureux.
  3. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL. Ajouter 2 mL de milieu de passage CM pour neutraliser la solution de dissociation CM.
  4. Tourner à 300 x g pendant 5 min à RT.
  5. Jetez le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec un volume approprié de milieux de passage CM. Pipette de haut en bas pour faire une suspension à cellule unique. Ensemencez un million d’iPSC-CM dans un plat de 10 cm recouvert d’une matrice de membrane basale.
  6. Le lendemain, supprimez les anciens médias. Ajouter 10 mL de milieux de prolifération cardiomyocytaire (Milieu VI : 2 μM CHIR99021). Changez les médias tous les deux jours.
  7. Lorsque les iPSC-CM deviennent confluents après 7 à 9 jours de culture, répétez l’étape de passage pour une expansion ultérieure des iPSC-CM.

7. Immunofluorescence

  1. Avant la coloration par immunofluorescence, ensemencez les iPSC-CM sur des couvercles recouverts de matrice de membrane basale qui sont placés dans une plaque de 24 puits (densité d’ensemencement: 0,5-1 x 106 cellules / mL). Maintenir les iPSC-CM en culture pendant au moins 4 jours.
  2. Lavez les cellules en utilisant 1 mL de DPBS une fois.
  3. Ajouter 0,5 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et incuber pendant 15 min à TA.
  4. Laver les cellules à l’aide de 1 mL de DPBS. Répétez une fois.
  5. Ajouter 0,5 mL de Triton X-100 à 0,1 % et incuber pendant 20 min à TA.
  6. Laver deux fois avec 1 mL de DPBS.
  7. Ajouter 0,5 mL de 0,2% de BSA dans DPBS (solution bloquante). Incuber à RT pendant 1 h.
  8. Ajouter 200 μL d’anticorps primaire dilué avec une solution bloquante (dilution : 1:400-1:1000). Incuber à 4 °C pendant la nuit.
  9. Laver les cellules à l’aide de 0,5 mL de solution bloquante pendant 3 min en agitant. Répétez deux fois.
  10. Ajouter 200 μL d’anticorps secondaire dilué dans la solution bloquante. Incuber à RT pendant 1 h.
  11. Rincez les cellules trois fois avec 0,5 mL de DPBS, chacune pendant 3 min en agitant.
  12. Contre-taches de noyaux avec DAPI (dilution 1:2000) et incuber pendant 5 min à RT.
  13. Rincez les cellules trois fois avec 0,5 mL de DPBS.
  14. Montez des cellules sur les couvercles sur une lame de microscope à l’aide de 5 μl de support de montage. Conserver à 4 °C et à l’abri de la lumière.

8. Préparation d’échantillons de cytométrie en flux

  1. Lavez les iPSC-CM humains avec 3 mL de DPBS une fois.
  2. Ajouter 1 mL de solution de dissociation CM et incuber dans 5% de CO2 à 37 °C pendant 7-10 min.
  3. Déloger les cellules à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. Transférer la suspension de la cellule dans un tube FACS rond à travers un capuchon de crépine. Le tube FACS est pré-rempli de 1 mL de milieu de passage iPSC-CM (10% KSR) pour neutraliser l’activité enzymatique.
  4. Tourner à 300 x g pendant 5 min.
  5. Retirez le surnageant sans perturber les granulés cellulaires. Ajouter 250 μL de solution de fixation/perméabilisation (voir tableau des matériaux). Incuber pendant 20 min à 4 °C.
  6. Ajouter 1 mL de tampon Perm/Wash. Vortex brièvement et rotation à 300 x g pendant 4 min.
  7. Jetez le surnageant. Ajouter 100 μL d’anticorps primaires dilués (1:200-1:500) dans 1x tampon Perm/Wash. Vortex brièvement et incubation pendant la nuit à 4 °C.
  8. Lavez les cellules en ajoutant 1 mL de tampon Perm/Wash. Vortex brièvement et rotation à 300 x g pendant 4 min.
  9. Jetez le surnageant. Ajouter 100 μL d’anticorps secondaires dilués (1:500-1:1 000). Vortex brièvement et incubation à RT pendant 1 h. Protéger de la lumière si les anticorps secondaires sont conjugués avec une fluorescence sensible à la lumière.
  10. Lavez les cellules en ajoutant 1 mL de tampon Perm/wash. Vortex brièvement et rotation à 300g pendant 4 min.
  11. Jetez le surnageant. Remettez en suspension des cellules avec 400 μL de tampon de coloration FACS (PBS/4% FBS). Conserver à 4 °C jusqu’au chargement sur un instrument FACS.

9. QPCR en temps réel

  1. Supprimer les anciens médias dans la culture iPSC-CM humaine. Ajouter 500-700 μL de tampon de lyse aux cellules lysées. Incuber pendant 3 min à RT. Lysat de cellule Scape et transférer dans un tube sans RNase de 1,5 ml. Procéder immédiatement à l’extraction totale de l’ARN ou le stocker à -80 °C.
  2. Isolez l’ARN total à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN en suivant les instructions du fabricant.
  3. Mesurer la concentration d’ARN et évaluer la qualité de l’ARN total à l’aide d’un spectrophotomètre.
  4. Effectuez une réaction de transcription inverse à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc. Le volume total de la réaction RT est de 20 μL, y compris 4 μL de mélange réactionnel (5x), 1 μL de transcriptase inverse, 1 μg d’ARN total et d’eau sans RNase.
  5. Incuber le mélange complet de réaction RT dans un cycleur thermique en utilisant le protocole suivant: 25 °C pendant 5 min; 46 °C pendant 20 min; 95 °C pendant 1 min; maintenir à 4 °C.
  6. Diluer l’ADNc de 1:10 en utilisant de l’eau sans nucléase. Configurez la réaction qPCR en temps réel en mélangeant 1 μL de gabarit d’ADNc, 1 μL d’amorces/sondes, 10 μL de mélange maître de qPCR et 8 μL d’eau sans nucléase.
  7. Exécuter dans un système de PCR en temps réel. Le protocole de cycle est de 50 °C 2 min (maintien), 95 °C 10 min (maintien), 95 °C 15 sec, 60 °C 1 min, répétez pendant 40 cycles.
  8. Recueillir les valeurs CT pour chaque gène dans chaque échantillon. L’abondance relative de l’ARNm est calculée en soustrayant la valeur CT du gène cible de la valeur CT d’un gène d’entretien ménager. L’expression relative des gènes est analysée par la méthode2 -ΔΔCT.

10. Enregistrement de la pince de patch à cellules entières

  1. Dissocier les iPSC-CM en cellules uniques à l’aide d’une solution de dissociation CM comme décrit précédemment.
  2. Cellules de semence à faible densité sur des couvercles recouverts de matrice de membrane basale. Cultivez-les pendant 3-4 jours dans Media IV.
  3. Tirez des pipettes (résistance 0,9-1,5 MΩ) à partir de capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un extracteur horizontal à microélectrodes.
  4. Incuber des cellules dans la solution de Tyrode (pH = 7,35).
  5. Remplissez les pipettes avec une solution d’électrode (pH = 7,3) composée des produits chimiques suivants: 120 mM d’acide aspartique, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM phosphocréatine, 4 mM K-ATP et 2 mM créatine phosphokinase.
  6. Placez les cellules en mode de serrage actuel en utilisant une impulsion de courant de 5 ms à seuil diastolique de 1,5-2 à 1 Hz.
  7. Enregistrez les potentiels d’action (AP) à l’aide d’un amplificateur à microélectrodes et d’une carte d’acquisition pilotée par logiciel.

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Representative Results

Reprogrammation iPSC humaine à partir de PBMC
Après une pré-culture avec des milieux sanguins complets pendant 7 jours, les PBMC deviennent gros avec des noyaux visibles et du cytoplasme (Figure 1B), indiquant qu’ils sont prêts pour la transfection du virus. Après la transfection avec les facteurs de reprogrammation du virus Sendai, les PBMC subiront un processus de reprogrammation épigénétique pendant une autre semaine. En règle générale, nous obtenons 30 à 50 colonies d’iPSC à partir de la transfection de 1 x10 5 PBMC et l’efficacité de reprogrammation est de 0,03% à 0,05%. Des cellules entièrement reprogrammées se fixeront et commenceront à former des colonies lorsqu’elles seront introduites dans le milieu E8 complet(Figure 1C). Ces premières colonies d’iPSC sont agrandies pendant encore 7 jours, puis coupées mécaniquement et ramassées individuellement. Chaque colonie d’iPSC est transférée dans un puits d’une plaque de 6 puits pour établir des lignes iPSC individuelles. Après 4-5 passages, les colonies d’iPSC deviendront pures avec très peu de cellules différenciées autour (Figure 1D). À ce stade, la plupart des cellules des colonies iPSC sont OCT4 et NANOG positives(Figure 1E),ce qui démontre leur pluripotence. Les lignes iPSC stables sont établies par le cinquième passage.

Différenciation cardiaque
Le protocole de différenciation cardiaque est représenté à la figure 1F. La différenciation cardiaque est initiée lorsque les CSPi sont maintenus pendant au moins 10 passages. Le degré de confluence iPSC est essentiel lorsque CHIR99021 est appliqué. La densité cellulaire est confluente à plus de 90% mais pas trop confluente. Si les colonies d’iPSC deviennent trop encombrées, elles commenceront une différenciation spontanée qui affectera négativement l’efficacité de la différenciation cardiomyocytaire dirigée. Les cardiomyocytes battus sont généralement observés après le jour 12 de la différenciation (Vidéo 1). La date à laquelle le début des coups se produit varie et dépend des lignes iPSC utilisées. Après la famine de glucose et la replaquage, les iPSC-CM montrent des battements spontanés (Vidéo 2) et une structure de sarcomère alignée avec la troponine T cardiaque intercalée (TNNT2) et la α-actinine (Figure 1G-H). De plus, la pureté des iPSC-CM est élevée, avec plus de 93% des cellules étant TNNT2+ comme le montre l’analyse FACS (Figure 1I).

Bien que les CM-IPSC soient relativement immatures par rapport aux cardiomyocytes adultes, ils présentent des potentiels d’action ventriculaires et auriculaires mesurés par une pince de patch à cellules entières (Figure 2A, B). Dans une différenciation cardiaque typique, les iPSC-CM du jour 30 sont un mélange de sous-types ventriculaires, auriculaires et nodaux, les CM ventriculaires représentant la majorité (60%, Figure 2C)en utilisant le protocole de différenciation susmentionné(Figure 1F). Différents protocoles de différenciation donnent des pourcentages variables de sous-types de cardiomyocytes en raison de l’activation de voies de signalisation distinctes lors de la détermination de la lignée cellulaire10. Les CM ventriculaires sont marqués avec MYL2 (MLC2v, Figure 2D) tandis que les iPSC-CM auriculaires sont marqués par NR2F2 (COUP-TFII, Figure 2E). Ces marqueurs sont fortement exprimés dans les iPSC-CM (>D30) plus matures que ceux qui en sont à un stade précoce.

Extension des iPSC-CM par activation Wnt
Chez les mammifères, les cardiomyocytes adultes ne se divisent pas activement pour l’auto-renouvellement. Ce phénomène se produit également pour les iPSC-CM humains. Une fois matures au-delà de D30, la division cellulaire des iPSC-CM est un événement rare, limitant ainsi leur capacité de production de masse au niveau clinique et industriel. Pour imiter l’environnement de développement pendant la prolifération des cardiomyocytes embryonnaires, nous activons la voie Wnt par CHIR99021 pour stimuler la multiplication des iPSC-CM précoces. Les IPC-MC D12-14 (après purification par privation de glucose) sont ensemencés à faible densité en présence de 2 μM CHIR99021. L’activation Wnt stimule la division cellulaire des iPSC-CM et favorise l’expression de régulateurs du cycle cellulaire tels que la cycline D1(Figure 3A)qui peut pousser le cycle cellulaire à avancer à travers la phase G1. Fait intéressant, CHIR99021 permet une prolifération robuste des premiers iPSC-CM pour 2 passages par rapport aux témoins(Figure 3B). Cependant, la capacité de prolifération des CM-CSPi diminue avec le passage extensif(figure 3B),ce qui est cohérent avec la prolifération cardiaque limitée et bien contrôlée au cours du développement cardiaque embryonnaire. En outre, il ne semble pas que CHIR99021 soit capable de stimuler l’expansion des iPSC-CM plus matures lorsqu’ils atteignent plus de 30 jours de différenciation et développent des structures de sarcomères stables.

Figure 1
Figure 1: Reprogrammation de l’iPSC humain et différenciation des cardiomyocytes. (A) Un diagramme schématique montrant la couche PBMC après séparation des échantillons de sang des patients. (B) Les PBMC élargis sont prêts pour la transfection. (C) Premières colonies humaines d’IPSC. (D) Une ligne iPSC établie au passage 5. (E) Les CSPi humaines sont positives pour les marqueurs de pluripotence OCT4 (vert) et NANOG (rouge). Les noyaux sont contre-colorés par DAPI (bleu). (F) Vue d’ensemble d’un protocole de différenciation cardiomyocytaire. (G-H) La structure des sarcomères des iPSC-CM est révélée par coloration par immunofluorescence à l’aide d’anticorps dirigés contre le TNNT2 (vert) et la α-actinine (rouge). Les noyaux sont contre-colorés par DAPI (bleu). (I) Analyse FACS des iPSC-CM à l’aide d’un anticorps contre TNNT2. Barres d’échelle: 200 μm (B-D), 50 μm (E et G) et 20 μm (H). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Sous-types de cardiomyocytes dans les iPSC-CM humains. (A-B) Durées potentielles d’action représentatives pour les iPSC-CM de type ventriculaire(A)et de type auriculaire(B). (C) Pourcentages représentatifs de sous-types de type ventriculaire, auriculaire et nodal dans les CM iPSC humains. (D-E) Les IPC-CM D30 sont colorés avec des anticorps contre le marqueur cardiomyocytaire ventriculaire MYL2(D)et le marqueur auriculaire NR2F2(E). Les cellules sont simultanément colorées avec un anticorps TNNT2. Les noyaux sont contre-colorés par DAPI (bleu). Barres d’échelle: 50 μm (D-E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Expansion des iPSC-CM humains par activation Wnt. (A) Le pourcentage de Cycline D1 positif iPSC-CM est augmenté en présence de CHIR99021. Les cellules sont doublement colorées avec des anticorps contre TNNT2 (rouge) et Cycline D1 (vert). Les noyaux sont contre-colorés par DAPI (bleu). (B) Changements de pli du nombre de cellules pendant l’expansion des iPSC-CM humains avec ou sans CHIR99021 dans les 3 premiers passages. L’axe Y montre les changements de pliage du nombre de cellules. CHIR99021 stimule la prolifération robuste des premiers iPSC-CM. Barres d’échelle: 50 μm (A). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1. Battre les iPSC-CM humains au jour 18 de la différenciation. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2. Battre les iPSC-CM humains au jour 25 après la purification métabolique. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

Lors de la reprogrammation iPSC, il est essentiel de cultiver des PBMC pendant 1 semaine jusqu’à ce qu’ils soient élargis avec des noyaux clairs et du cytoplasme. Étant donné que les PBMC ne prolifèrent pas, un nombre de cellules approprié pour la transduction virale est important pour une reprogrammation réussie des CSPi. Le nombre de cellules des PBMC, la multiplicité de l’infection (MOI) et le titre du virus doivent être pris en compte et ajustés pour atteindre les résultats optimaux de transduction. Pour la différenciation cardiaque, la densité d’ensemencement initiale est essentielle pour que les CSPi atteignent plus de 90 % de confluence le jour de l’administration de CHIR99021. D’une part, si les CSPi sont moins confluents au moment de la différenciation cardiaque, CHIR99021 sera toxique et entraînera une mort cellulaire importante. D’autre part, si les CSPi sont trop confluents, ils subiront une différenciation spontanée qui compromettra l’efficacité de la différenciation cardiaque dirigée. Pour l’expansion des iPSC-CM précoces, le moment et la qualité des cardiomyocytes doivent être pris en compte. Les premiers iPSC-CM ne peuvent se multiplier de manière robuste que lorsque la pureté des cardiomyocytes est suffisamment élevée. Les non-cardiomyocytes existants dans la culture peuvent également proliférer en réponse au traitement par CHIR99021, ce qui affectera négativement la prolifération des iPSC-CM précoces. En outre, il est crucial de stimuler l’expansion des cardiomyocytes au jour 20 de la différenciation. Une fois que les iPSC-CM passeront le jour 30, il leur sera difficile de reprendre une division robuste.

Les CSPi humaines ont été initialement dérivées de fibroblastes dermiques et pulmonaires par transfection médiée par rétrovirus1,2. Il y a deux problèmes majeurs avec ces méthodes de reprogrammation qui empêchent les progrès dans la traduction clinique des CSPi des patients: 1) le rétrovirus s’intègre dans le génome de l’hôte introduisant ainsi des mutations génétiques potentielles; 2) les fibroblastes dérivés du patient nécessitent des biopsies cutanées que de nombreux patients peuvent refuser. Dans ce protocole, nous décrivons un protocole qui utilise le virus Sendai23 et les PBMC commerciaux sans intégration pour dériver de manière robuste les IPSC des patients. Ces iPSC sont exempts de vecteurs de reprogrammation exogènes et peuvent être maintenus avec l’auto-renouvellement et la pluripotence indéfiniment. De plus, les échantillons de sang des patients sont facilement prélevés dans les laboratoires cliniques. Notre protocole est polyvalent et peut être utilisé pour la production de masse d’IPSC spécifiques aux patients et aux maladies pour les référentiels à grande échelle et les traductions cliniques24.

Une différenciation cardiomyocytaire robuste est obtenue par modulation séquentielle de voies de signalisation spécifiques au cours de la différenciation cardiaque à partir de CSPi humaines. Les principales voies impliquées dans la spécification et la prolifération cardiaques comprennent Wnt, BMP, Activin, NOTCH, VEGF et l’acide rétinoïque (RA) 10,12. Nous présentons ici un protocole de différenciation cardiaque efficace par modulation séquentielle de la signalisation Wnt par de petits produits chimiques : d’abord activation par CHIR99021 puis inhibition par IWR-113,14. Les petits produits chimiques sont stables et donnent des résultats de différenciation cohérents par rapport à ceux qui utilisent des facteurs de croissance. La plupart des iPSC-CM générés par ce protocole sont des cardiomyocytes de type ventriculaire, mélangés à des cellules auriculaires et nodales. La génération précise de cardiomyocytes spécifiques au sous-type est obtenue en ajustant les étapes de différenciationultérieures 10,12. Par exemple, l’ajout de PR immédiatement après le traitement par IWR-1 donne un pourcentage élevé de cardiomyocytes de type auriculaire alors que l’inhibition de la PR favorise la génération d’iPSC-CM de type ventriculaire18,22. L’activation de la signalisation Wnt à un stade ultérieur de différenciation favorise l’induction de cellules progénitrices cardiaques en cardiomyocytes nodaux19,21, ce qui est prometteur pour la génération de cellules de stimulateurs cardiaques biologiques spécifiques au patient.

Les iPSC-CM humains sont immatures et ont une capacité de prolifération limitée25. Au cours du développement cardiaque embryonnaire, la maturation se poursuit tandis que la prolifération diminue. Il y a une fenêtre étroite lorsque les iPSC-CM peuvent être stimulés pour une prolifération robuste, ce qui reflète l’expansion des cardiomyocytes embryonnaires. Ici, nous utilisons un activateur Wnt CHIR99021 pour promouvoir la prolifération des premiers iPSC-CM pendant une période limitée, ce qui est cohérent avec un rapport récent17. On suppose que la voie de signalisation Wnt affecte la prolifération des cardiomyocytes peut-être à travers la diaphonie avec de multiples voies en amont telles que NOTCH et Hippo26,27. La signalisation NOTCH favorise la prolifération des cardiomyocytes tandis que la voie Hippo restreint la croissance cardiaque et la taille du cœur28,29,30. On ne sait toujours pas comment l’interaction entre NOTCH et Hippo détermine l’activité Wnt en aval et affine un degré approprié de prolifération cardiaque. Notre protocole a fourni un modèle intéressant pour la prolifération des cardiomyocytes afin d’étudier les mécanismes pathologiques des malformations cardiaques congénitales causées par l’hypoplasie des cardiomyocytes ventriculaires, tels que le syndrome du cœur gauche hypoplasique (HLHS) et l’atrésie pulmonaire avec septum ventriculaire intact (PA-IVS).

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par le prix de développement de carrière 18CDA34110293 (M-T.Z.) de l’American Heart Association (AHA), les prix Additional Ventures AVIF et SVRF (M-T.Z.), les subventions 1R01HL124245, 1R01HL132520 et R01HL096962 (I.D.). Le Dr Ming-Tao Zhao a également été soutenu par des fonds de démarrage de l’Institut de recherche Abigail Wexner du Nationwide Children’s Hospital.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

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References

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Biologie du développement numéro 168 cellules mononucléaires du sang périphérique PBMC cellules souches pluripotentes induites par l’homme CSPi différenciation cardiaque reprogrammation des CSPi expansion des cardiomyocytes.
Génération et expansion de cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient
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Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A.,… More

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. T. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

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