Analyse multiplexée de l’expression génique rétinienne et de l’accessibilité de la chromatine à l’aide de scRNA-Seq et scATAC-Seq
Summary
Ici, les auteurs démontrent l’utilité de MULTI-seq pour le phénotypage et les scRNA-seq et scATAC-seq appariés ultérieurs dans la caractérisation des profils d’accessibilité transcriptomique et chromatine dans la rétine.
Abstract
De puissantes techniques de séquençage de nouvelle génération offrent une analyse robuste et complète pour étudier le fonctionnement des réseaux de régulation des gènes rétiniens pendant le développement et dans les états pathologiques. Le séquençage de l’ARN unicellulaire nous permet de profiler de manière exhaustive les changements d’expression génique observés dans le développement rétinien et la maladie au niveau cellulaire, tandis que l’ATAC-Seq unicellulaire permet de profiler l’analyse de l’accessibilité de la chromatine et de la liaison au facteur de transcription à une résolution similaire. Ici, l’utilisation de ces techniques dans la rétine en développement est décrite, et MULTI-Seq est démontré, où les échantillons individuels sont marqués avec un complexe oligonucléotide-lipide modifié, permettant aux chercheurs à la fois d’augmenter la portée des expériences individuelles et de réduire considérablement les coûts.
Introduction
Comprendre comment les gènes peuvent influencer le devenir cellulaire joue un rôle clé dans l’interrogation de processus tels que la maladie et la progression embryonnaire. Les relations complexes entre les facteurs de transcription et leurs gènes cibles peuvent être regroupées dans des réseaux de régulation des gènes. De plus en plus de preuves placent ces réseaux de régulation des gènes au centre de la maladie et du développement à travers les lignées évolutives1. Alors que les techniques précédentes telles que la qRT-PCR se concentraient sur un seul gène ou un ensemble de gènes, l’application de la technologie de séquençage à haut débit permet le profilage de transcriptomes cellulaires complets.
RNA-seq offre un aperçu de la transcriptomique à grande échelle 2,3. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) donne aux chercheurs la possibilité non seulement de profiler les transcriptomes, mais aussi de relier des types cellulaires spécifiques aux profils d’expression génique4. Ceci est réalisé bioinformatiquement en alimentant des profils cellulaires individuels dans des algorithmes de tri à l’aide de marqueurs de gènes connus5. Le multiplexage à l’aide du séquençage d’indices marqués par les lipides (MULTI-seq) offre une diversité sans précédent dans le nombre de profils scRNA-Seq pouvant être collectés6. Cette technique à base de lipides diffère des autres techniques d’indexation des échantillons telles que le hachage cellulaire qui reposent sur la présence d’antigènes de surface et d’anticorps de haute affinité au lieu de l’intégration de la membrane plasmique7. Non seulement il est maintenant possible de profiler les profils d’expression génique en types de cellules, mais différentes expériences peuvent être combinées en une seule bibliothèque de séquençage, ce qui réduit considérablement le coût d’une expérience individuelle scRNA-seq6. Le coût de scRNA-seq peut sembler prohibitif pour une utilisation dans des expériences de phénotypage où de nombreux génotypes, conditions ou échantillons de patients différents sont analysés, mais le multiplexage permet de combiner jusqu’à 96 échantillons dans une seule bibliothèque6.
Le profilage de l’expression des gènes via scRNA-seq n’a pas été la seule technique basée sur le séquençage à haut débit à révolutionner la compréhension actuelle de la façon dont les mécanismes moléculaires dictent le destin cellulaire. Bien que la compréhension des transcriptions génétiques présentes dans une cellule permette d’identifier le type de cellule, il est tout aussi important de comprendre comment l’organisation génomique régule le développement et la progression de la maladie. Les premières études reposaient sur la détection d’un clivage médié par la DNase de séquences non liées aux histones, suivie d’un séquençage des fragments d’ADN résultants pour identifier les régions de chromatine ouverte. En revanche, le test unicellulaire pour le séquençage de la chromatine accessible aux transposons (scATAC-seq) permet aux chercheurs de sonder l’ADN avec un transposon domestiqué pour profiler facilement la chromatine ouverte au niveau de nucléotide unique8. Cela a subi une mise à l’échelle similaire à scRNA-seq et maintenant les chercheurs peuvent identifier des types de cellules individuelles et profiler des phénotypes sur des milliers de génomes individuels8.
L’appariement de scRNA-seq et scATAC-seq a permis aux chercheurs de profiler des milliers de cellules pour déterminer les populations cellulaires, l’organisation génomique et les réseaux de régulation des gènes dans les modèles de maladie et les processus de développement 9,10,11,12. Ici, les auteurs expliquent comment utiliser d’abord MULTI-seq pour condenser le phénotypage d’une myriade de modèles animaux et utiliser scRNA-seq et scATAC-seq appariés pour mieux comprendre le paysage de la chromatine et les réseaux de régulation dans ces modèles animaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
La puissance de MULTI-seq provient de l’intégration transparente des données provenant de plusieurs conditions ou modèles expérimentaux et de l’énorme avantage en termes de coût et de limitation des effets de lot. L’utilisation de MULTI-seq offre une profondeur de phénotypage sans précédent en laboratoire. Des méthodes de multiplexage non génétiques telles que le hachage cellulaire ou le hachage de noyaux ont ouvert la porte à des échantillons multiplexés grâce à l’utilisa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Linda Orzolek du Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core pour son aide dans le séquençage des bibliothèques produites et Lizhi Jiang pour l’exécution des explants rétiniens ex vivo .
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Riferimenti
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