Aqui, os autores apresentam a utilidade de MULTI-seq para fenotipagem e posterior emparelhamento scRNA-seq e scATAC-seq na caracterização dos perfis de acessibilidade transcriptômica e cromatina na retina.
Poderosas técnicas de sequenciamento de próxima geração oferecem análises robustas e abrangentes para investigar como as redes reguladoras de genes da retina funcionam durante o desenvolvimento e nos estados de doenças. O sequenciamento de RNA unicelular nos permite traçar alterações abrangentes de expressão genética observadas no desenvolvimento da retina e na doença a nível celular, enquanto o ATAC-Seq unicelular permite que a análise da acessibilidade e do fator de transcrição de cromatina sejam perfilada em resolução semelhante. Aqui, descreve-se o uso dessas técnicas na retina em desenvolvimento, e multi-Seq é demonstrado, onde amostras individuais são rotuladas com um complexo oligonucleotídeo-lipídio modificado, permitindo aos pesquisadores aumentar o escopo de experimentos individuais e reduzir substancialmente os custos.
Entender como os genes podem influenciar o destino celular desempenha um papel fundamental na interrogação de processos como doenças e progressão embrionária. As complexas relações entre fatores de transcrição e seus genes-alvo podem ser agrupadas em redes reguladoras genéticas. A montagem de evidências coloca essas redes reguladoras genéticas no centro de doenças e desenvolvimento através das linhagens evolutivas1. Embora técnicas anteriores como qRT-PCR se concentrem em um único gene ou conjunto de genes, a aplicação da tecnologia de sequenciamento de alto rendimento permite o perfil de transcriptomes celulares completos.
O RNA-seq oferece um vislumbre da transcriptômica em larga escala 2,3. O sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) dá aos pesquisadores a capacidade de não apenas traçar transcrições de perfil, mas vincular tipos de células específicas com perfisde expressão genética 4. Isso é conseguido bioinformática alimentando perfis de células individuais em algoritmos de classificação usando marcadores genéticos conhecidos5. O multiplexing usando sequenciamento de índices marcados por lipídios (MULTI-seq) oferece uma diversidade sem precedentes no número de perfis scRNA-Seq que podem ser coletados6. Esta técnica baseada em lipídio difere de outras técnicas de indexação de amostras, como o hashing celular que dependem da presença de antígenos superficiais e anticorpos de alta afinidade em vez da integração da membrana plasmática7. Não só agora é possível traçar perfis de expressão genética em tipos de células, mas diferentes experimentos podem ser combinados em uma única biblioteca de sequenciamento, reduzindo drasticamente o custo de um experimento individual de scRNA-seq6. O custo do scRNA-seq pode parecer proibitivo para uso em experimentos de fenotipos onde são analisados muitos genótipos, condições ou amostras de pacientes diferentes, mas o multiplexing permite a combinação de até 96 amostras em uma única biblioteca6.
O perfil da expressão genética via scRNA-seq não tem sido a única técnica baseada em sequenciamento de alto rendimento para revolucionar a compreensão atual de como os mecanismos moleculares ditam o destino celular. Embora entender quais transcrições genéticas estão presentes em uma célula permite a identificação do tipo celular, igualmente importante é entender como a organização genômica regula o desenvolvimento e a progressão da doença. Estudos iniciais se basearam na detecção de decote mediado por DNase de sequências não ligadas a histones, seguidos pelo sequenciamento dos fragmentos de DNA resultantes para identificar regiões de cromatina aberta. Em contraste, o ensaio celular único para sequenciamento de cromatina acessível transposon (scATAC-seq) permite que os pesquisadores testem DNA com um transposon domesticado para perfilar facilmente cromatina aberta no nível único de nucleotídeo8. Isso passou por um dimensionamento semelhante ao scRNA-seq e agora os pesquisadores podem identificar tipos de células individuais e perfis de fenótipos em milhares de genomas individuais8.
O emparelhamento de scRNA-seq e scATAC-seq permitiu aos pesquisadores a capacidade de perfilar milhares de células para determinar populações celulares, organização genômica e redes de regulação genética em modelos de doenças e processos de desenvolvimento 9,10,11,12. Aqui, os autores descrevem como primeiro utilizar multi-seq para condensar fenotipagem de uma miríade de modelos animais e empregar scRNA-seq e scATAC-seq emparelhados para obter uma melhor compreensão da paisagem e redes regulatórias de cromatina nesses modelos animais.
O poder do MULTI-seq decorre da integração perfeita de dados de múltiplas condições experimentais ou modelos e do enorme benefício em termos de custo e limitação dos efeitos em lote. Utilizar multi-seq oferece um laboratório sem precedentes fenotipagem de profundidade. Métodos não genéticos de multiplexagem, como hashing celular ou hashing de núcleos, abriram a porta para amostras multiplexadas através do uso de anticorposcom código de barras 7,19,20</su…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Linda Orzolek da Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core por ajudar a sequenciar as bibliotecas produzidas e Lizhi Jiang por realizar as explantas ex vivo retinal.
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
Dissection microscope | Leica | ||
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Dry Ice | |||
EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |