scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析
Summary
ここで著者らは、網膜におけるトランスクリプトームおよびクロマチンアクセシビリティプロファイルを特徴付ける際の表現型決定およびその後のscRNA-seqおよびscATAC-seqのペアに対するMULTI-seqの有用性を示す。
Abstract
強力な次世代シーケンシング技術は、網膜遺伝子調節ネットワークが発生中および疾患状態でどのように機能するかを調査するための堅牢で包括的な分析を提供します。単一細胞RNAシーケンシングは、網膜の発達および疾患において観察される遺伝子発現変化を細胞レベルで包括的にプロファイリングすることを可能にし、単一細胞ATAC-Seqは、クロマチンのアクセシビリティおよび転写因子結合の分析を同様の分解能でプロファイリングすることを可能にする。ここでは、発達中の網膜におけるこれらの技術の使用が説明され、個々のサンプルが修飾オリゴヌクレオチド – 脂質複合体で標識されるMULTI-Seqが実証され、研究者は個々の実験の範囲を拡大し、コストを大幅に削減することができます。
Introduction
遺伝子が細胞の運命にどのように影響するかを理解することは、病気や胚の進行などのプロセスを問う上で重要な役割を果たします。転写因子とその標的遺伝子との間の複雑な関係は、遺伝子調節ネットワーク内でグループ化することができる。山積みの証拠は、これらの遺伝子調節ネットワークを進化系統にわたる疾患と発達の両方の中心に置きます1。qRT-PCRなどの以前の技術は単一の遺伝子または遺伝子セットに焦点を当てていましたが、ハイスループットシーケンシング技術の適用により、完全な細胞トランスクリプトームのプロファイリングが可能になります。
RNA-seqは、大規模なトランスクリプトミクス2,3を垣間見ることができます。単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)により、研究者はトランスクリプトームをプロファイリングするだけでなく、特定の細胞型を遺伝子発現プロファイルとリンクさせることができます4。これは、既知の遺伝子マーカー5を用いて個々の細胞プロファイルを選別アルゴリズムに供給することによってバイオインフォマティクス的に達成される。脂質タグ付きインデックスシーケンシング(MULTI-seq)を用いた多重化は、収集可能なscRNA-Seqプロファイルの数に前例のない多様性をもたらします6。この脂質ベースの技術は、原形質膜組み込みの代わりに表面抗原および高親和性抗体の存在に依存する細胞ハッシュなどの他のサンプル索引付け技術とは異なります7。遺伝子発現プロファイルを細胞型にプロファイルできるようになっただけでなく、異なる実験を1つのシーケンシングライブラリにまとめることができ、個々のscRNA-seq実験のコストを大幅に削減できます6。scRNA-seqのコストは、多くの異なる遺伝子型、状態、または患者サンプルが分析される表現型実験での使用には法外に思えるかもしれませんが、多重化により、単一のライブラリ内の最大96サンプルの組み合わせが可能になります6。
scRNA-seqによる遺伝子発現のプロファイリングは、分子メカニズムが細胞の運命をどのように決定するかについての現在の理解に革命をもたらす唯一のハイスループットシーケンシングベースの技術ではありません。どの遺伝子転写産物が細胞内に存在するかを理解することは細胞型の同定を可能にするが、同様に重要なことは、ゲノム組織が発達および疾患進行をどのように調節するかを理解することである。初期の研究は、ヒストンに結合していない配列のDNaseを介した切断を検出し、続いて得られたDNA断片のシーケンシングに依存して、オープンクロマチンの領域を同定した。対照的に、トランスポゾンアクセシブルクロマチンシーケンシング(scATAC-seq)の単一細胞アッセイでは、研究者は家畜化トランスポゾンでDNAをプローブし、一塩基レベルでオープンクロマチンを容易にプロファイリングすることができます8。これはscRNA-seqと同様のスケーリングを経ており、研究者は何千もの個々のゲノムにわたって個々の細胞型を同定し、表現型をプロファイルすることができます8。
scRNA-seqとscATAC-seqの組み合わせにより、研究者は何千もの細胞をプロファイリングして、疾患モデルおよび発生過程における細胞集団、ゲノム組織、および遺伝子調節ネットワークを決定する能力が可能になりました9,10,11,12。ここで著者らは、まずMULTI-seqを利用して無数の動物モデルの表現型を凝縮し、ペアのscRNA-seqとscATAC-seqを使用して、これらの動物モデルにおけるクロマチンランドスケープと調節ネットワークをよりよく理解する方法を概説する。
Protocol
Representative Results
Discussion
MULTI-seqのパワーは、複数の実験条件またはモデルからのデータのシームレスな統合と、コストとバッチ効果の制限の面での莫大な利点に由来します。MULTI-seqを利用することで、実験室で前例のない表現型決定の深さが得られます。細胞ハッシュや核ハッシュなどの非遺伝的多重化方法は、バーコード化された抗体の使用を通じて多重化されたサンプルへの扉を開いた7、<sup c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、作製されたライブラリーのシーケンシングに協力してくれたJohns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing CoreのLinda Orzolek氏と、 ex vivo 網膜外植体を実施したLizhi Jiang氏に感謝します。
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Riferimenti
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
- Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
- Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
- Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
- Worthington Biochemical Corporation. . Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
- Agilent. . DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
- ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
- Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
- Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
- Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
- Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
- Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
- METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
- Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).
