Qui, gli autori mostrano l’utilità di MULTI-seq per la fenotipizzazione e il successivo accoppiato scRNA-seq e scATAC-seq nel caratterizzare i profili di accessibilità trascrittomica e cromatina nella retina.
Potenti tecniche di sequenziamento di nuova generazione offrono un’analisi robusta e completa per studiare come funzionano le reti di regolazione genica retinica durante lo sviluppo e negli stati patologici. Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula ci consente di profilare in modo completo i cambiamenti di espressione genica osservati nello sviluppo retinico e nella malattia a livello cellulare, mentre l’ATAC-Seq a cellula singola consente di profilare l’analisi dell’accessibilità della cromatina e del legame del fattore di trascrizione a risoluzione simile. Qui viene descritto l’uso di queste tecniche nella retina in via di sviluppo e viene dimostrato MULTI-Seq, in cui i singoli campioni sono etichettati con un complesso oligonucleotide-lipidico modificato, consentendo ai ricercatori di aumentare la portata dei singoli esperimenti e ridurre sostanzialmente i costi.
Capire come i geni possono influenzare il destino cellulare gioca un ruolo chiave nell’interrogare processi come la malattia e la progressione embrionale. Le complesse relazioni tra i fattori di trascrizione e i loro geni bersaglio possono essere raggruppate in reti di regolazione genica. Prove crescenti collocano queste reti di regolazione genica al centro sia della malattia che dello sviluppo attraverso i lignaggi evolutivi1. Mentre tecniche precedenti come la qRT-PCR si concentravano su un singolo gene o insieme di geni, l’applicazione della tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento consente la profilazione di trascrittomi cellulari completi.
RNA-seq offre uno sguardo alla trascrittomica su larga scala 2,3. Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) offre ai ricercatori la capacità non solo di profilare i trascrittomi, ma di collegare specifici tipi di cellule con i profili di espressione genica4. Ciò si ottiene bioinformaticamente alimentando i singoli profili cellulari in algoritmi di ordinamento utilizzando marcatori genici noti5. Il multiplexing che utilizza il sequenziamento degli indici con tag lipidi (MULTI-seq) offre una diversità senza precedenti nel numero di profili scRNA-Seq che possono essere raccolti6. Questa tecnica basata sui lipidi differisce da altre tecniche di indicizzazione dei campioni come l’hashing cellulare che si basano sulla presenza di antigeni di superficie e anticorpi ad alta affinità anziché sull’integrazione della membranaplasmatica 7. Non solo è ora possibile profilare i profili di espressione genica in tipi di cellule, ma diversi esperimenti possono essere combinati in un’unica libreria di sequenziamento, riducendo drasticamente il costo di un singolo esperimento scRNA-seq6. Il costo di scRNA-seq può sembrare proibitivo per l’uso in esperimenti di fenotipizzazione in cui vengono analizzati molti genotipi, condizioni o campioni di pazienti diversi, ma il multiplexing consente la combinazione di un massimo di 96 campioni in una singola libreria6.
La profilazione dell’espressione genica tramite scRNA-seq non è stata l’unica tecnica basata sul sequenziamento ad alto rendimento a rivoluzionare l’attuale comprensione di come i meccanismi molecolari dettano il destino cellulare. Mentre capire quali trascritti genici sono presenti in una cellula consente l’identificazione del tipo di cellula, altrettanto importante è capire come l’organizzazione genomica regola lo sviluppo e la progressione della malattia. I primi studi si sono basati sul rilevamento della scissione mediata dalla DNasi di sequenze non legate agli istoni, seguita dal sequenziamento dei frammenti di DNA risultanti per identificare le regioni di cromatina aperta. Al contrario, il test a singola cellula per il sequenziamento della cromatina accessibile al trasposone (scATAC-seq) consente ai ricercatori di sondare il DNA con un trasposone addomesticato per profilare facilmente la cromatina aperta al livello8 del singolo nucleotide. Questo è passato attraverso un ridimensionamento simile a scRNA-seq e ora i ricercatori possono identificare singoli tipi di cellule e fenotipi di profilo su migliaia di singoli genomi8.
L’accoppiamento di scRNA-seq e scATAC-seq ha permesso ai ricercatori di profilare migliaia di cellule per determinare le popolazioni cellulari, l’organizzazione genomica e le reti di regolazione genica nei modelli di malattia e nei processi di sviluppo 9,10,11,12. Qui gli autori delineano come utilizzare prima MULTI-seq per condensare la fenotipizzazione di una miriade di modelli animali e impiegare accoppiati scRNA-seq e scATAC-seq per ottenere una migliore comprensione del panorama della cromatina e delle reti regolatorie in questi modelli animali.
La potenza di MULTI-seq deriva dalla perfetta integrazione dei dati provenienti da più condizioni o modelli sperimentali e dall’enorme vantaggio in termini di costi e limitazione degli effetti batch. L’utilizzo di MULTI-seq offre una profondità di fenotipizzazione senza precedenti in laboratorio. I metodi di multiplexing non genetici come l’hashing cellulare o l’hashing dei nuclei hanno aperto la porta a campioni multiplexati attraverso l’uso di anticorpi con codice a barre <sup class…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Linda Orzolek della Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core per l’aiuto nel sequenziamento delle librerie prodotte e Lizhi Jiang per aver eseguito gli espianti retinici ex vivo .
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
Dissection microscope | Leica | ||
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Dry Ice | |||
EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |