Здесь авторы демонстрируют полезность MULTI-seq для фенотипирования и последующих пар scRNA-seq и scATAC-seq в характеристике профилей доступности транскриптома и хроматина в сетчатке.
Мощные методы секвенирования следующего поколения предлагают надежный и всесторонний анализ для изучения того, как регуляторные сети генов сетчатки функционируют во время развития и в болезненных состояниях. Секвенирование одноклеточной РНК позволяет всесторонне профилировать изменения экспрессии генов, наблюдаемые при развитии и заболевании сетчатки на клеточном уровне, в то время как одноклеточный ATAC-Seq позволяет профилировать анализ доступности хроматина и связывания фактора транскрипции с аналогичным разрешением. Здесь описывается использование этих методов в развивающейся сетчатке и демонстрируется MULTI-Seq, где отдельные образцы маркируются модифицированным олигонуклеотид-липидным комплексом, что позволяет исследователям как увеличить объем отдельных экспериментов, так и существенно снизить затраты.
Понимание того, как гены могут влиять на судьбу клеток, играет ключевую роль в опросе таких процессов, как болезнь и эмбриональное прогрессирование. Сложные взаимосвязи между факторами транскрипции и их генами-мишенями могут быть сгруппированы в генные регуляторные сети. Растущие доказательства помещают эти генные регуляторные сети в центр как болезни, так и развития в эволюционных линиях1. В то время как предыдущие методы, такие как qRT-PCR, были сосредоточены на одном гене или наборе генов, применение технологии высокопроизводительного секвенирования позволяет профилировать полные клеточные транскриптомы.
RNA-seq предлагает взглянуть на крупномасштабную транскриптомику 2,3. Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) дает исследователям возможность не только профилировать транскриптомы, но и связывать конкретные типы клеток с профилями экспрессии генов4. Это достигается биоинформатически путем подачи отдельных профилей клеток в алгоритмы сортировки с использованием известных генных маркеров5. Мультиплексирование с использованием секвенирования индексов с липидными метками (MULTI-seq) предлагает беспрецедентное разнообразие в количестве профилей scRNA-Seq, которые могут быть собраны6. Этот метод на основе липидов отличается от других методов индексации образцов, таких как хеширование клеток, которые полагаются на присутствие поверхностных антигенов и антител с высоким сродством вместо интеграции плазматической мембраны7. Мало того, что теперь можно профилировать профили экспрессии генов по типам клеток, но различные эксперименты могут быть объединены в единую библиотеку секвенирования, что значительно снижает стоимость отдельного эксперимента scRNA-seq6. Стоимость scRNA-seq может показаться непомерно высокой для использования в экспериментах по фенотипированию, где анализируется множество различных генотипов, состояний или образцов пациентов, но мультиплексирование позволяет комбинировать до 96 образцов в одной библиотеке6.
Профилирование экспрессии генов с помощью scRNA-seq было не единственным высокопроизводительным методом секвенирования, который произвел революцию в современном понимании того, как молекулярные механизмы диктуют судьбу клеток. Хотя понимание того, какие транскрипты генов присутствуют в клетке, позволяет идентифицировать тип клетки, не менее важным является понимание того, как геномная организация регулирует развитие и прогрессирование заболевания. Ранние исследования основывались на обнаружении Опосредованного ДНКазой расщепления последовательностей, не связанных с гистонами, с последующим секвенированием полученных фрагментов ДНК для идентификации областей открытого хроматина. Напротив, одноклеточный анализ для транспозонного доступного секвенирования хроматина (scATAC-seq) позволяет исследователям исследовать ДНК с помощью одомашненного транспозона, чтобы легко профилировать открытый хроматин на уровне одного нуклеотида8. Это прошло через масштабирование, аналогичное scRNA-seq, и теперь исследователи могут идентифицировать отдельные типы клеток и фенотипы профиля в тысячах отдельных геномов8.
Сочетание scRNA-seq и scATAC-seq позволило исследователям профилировать тысячи клеток для определения клеточных популяций, геномной организации и регуляторных сетей генов в моделях заболеваний и процессах развития 9,10,11,12. Здесь авторы описывают, как сначала использовать MULTI-seq для конденсации фенотипирования множества животных моделей и использовать парные scRNA-seq и scATAC-seq, чтобы лучше понять ландшафт хроматина и регуляторные сети в этих животных моделях.
Сила MULTI-seq проистекает из бесшовной интеграции данных из нескольких экспериментальных условий или моделей и огромной выгоды с точки зрения стоимости и ограничения пакетных эффектов. Использование MULTI-seq обеспечивает лабораторную беспрецедентную глубину фенотипирования. Негенетичес?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Линду Орзолек из Johns Hopkins Transcriptomics и Deep Sequencing Core за помощь в секвенировании созданных библиотек и Lizhi Jiang за выполнение ex vivo retinal explants.
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
Dissection microscope | Leica | ||
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Dry Ice | |||
EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |