تحليل متعدد الإرسال للتعبير الجيني للشبكية وإمكانية الوصول إلى الكروماتين باستخدام scRNA-Seq و scATAC-Seq
Summary
هنا ، يعرض المؤلفون فائدة MULTI-seq للتنميط الظاهري وما تلاه من scRNA-seq و scATAC-seq في توصيف ملفات تعريف إمكانية الوصول إلى النسخ والكروماتين في شبكية العين.
Abstract
توفر تقنيات تسلسل الجيل التالي القوية تحليلا قويا وشاملا للتحقيق في كيفية عمل الشبكات التنظيمية لجينات الشبكية أثناء التطور وفي الحالات المرضية. يسمح لنا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية بتحديد ملامح شاملة لتغيرات التعبير الجيني التي لوحظت في تطور الشبكية والمرض على المستوى الخلوي ، في حين يسمح ATAC-Seq أحادي الخلية بتحليل إمكانية الوصول إلى الكروماتين وربط عامل النسخ ليتم توصيفه بدقة مماثلة. هنا يتم وصف استخدام هذه التقنيات في شبكية العين النامية ، ويتم توضيح MULTI-Seq ، حيث يتم تصنيف العينات الفردية بمركب أوليغونوكليوتيد دهني معدل ، مما يمكن الباحثين من زيادة نطاق التجارب الفردية وتقليل التكاليف بشكل كبير.
Introduction
يلعب فهم كيف يمكن للجينات التأثير على مصير الخلية دورا رئيسيا في استجواب العمليات مثل المرض والتطور الجنيني. يمكن تجميع العلاقات المعقدة بين عوامل النسخ والجينات المستهدفة في شبكات تنظيم الجينات. تضع الأدلة المتزايدة هذه الشبكات التنظيمية الجينية في مركز كل من المرض والتطور عبر السلالات التطورية1. في حين أن التقنيات السابقة مثل qRT-PCR ركزت على جين واحد أو مجموعة من الجينات ، فإن تطبيق تقنية التسلسل عالية الإنتاجية يسمح بتنميط النسخ الخلوي الكامل.
يقدم RNA-seq لمحة عن النسخ على نطاق واسع 2,3. يمنح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) الباحثين القدرة ليس فقط على تحديد خصائص النسخ ولكن أيضا ربط أنواع معينة من الخلايا بملفات تعريف التعبير الجيني4. يتم تحقيق ذلك من الناحية المعلوماتية الحيوية عن طريق تغذية ملفات تعريف الخلايا الفردية في خوارزميات الفرز باستخدام علامات الجينات المعروفة5. يوفر الإرسال المتعدد باستخدام تسلسل المؤشرات الموسومة بالدهون (MULTI-seq) تنوعا غير مسبوق في عدد ملفات تعريف scRNA-Seq التي يمكن جمعها6. تختلف هذه التقنية القائمة على الدهون عن تقنيات فهرسة العينات الأخرى مثل تجزئة الخلايا التي تعتمد على وجود مستضدات سطحية وأجسام مضادة عالية التقارب بدلا من تكامل غشاء البلازما7. ليس فقط من الممكن الآن تحديد ملامح التعبير الجيني في أنواع الخلايا ولكن يمكن دمج تجارب مختلفة في مكتبة تسلسل واحدة ، مما يقلل بشكل كبير من تكلفة تجربة scRNA-seq الفردية6. قد تبدو تكلفة scRNA-seq باهظة للاستخدام في تجارب التنميط الظاهري حيث يتم تحليل العديد من الأنماط الجينية أو الظروف أو عينات المرضى المختلفة ، ولكن تعدد الإرسال يسمح بالجمع بين ما يصل إلى 96 عينة في مكتبة واحدة6.
لم يكن تنميط التعبير الجيني عبر scRNA-seq هو التقنية الوحيدة القائمة على التسلسل عالي الإنتاجية لإحداث ثورة في الفهم الحالي لكيفية إملاء الآليات الجزيئية مصير الخلية. في حين أن فهم النصوص الجينية الموجودة في الخلية يمكن من تحديد نوع الخلية ، إلا أنه من المهم بنفس القدر فهم كيفية تنظيم الجينوم الذي ينظم التطور وتطور المرض. اعتمدت الدراسات المبكرة على الكشف عن الانقسام بوساطة الحمض النووي للتسلسلات غير المرتبطة بالهيستونات، تليها تسلسل شظايا الحمض النووي الناتجة لتحديد مناطق الكروماتين المفتوح. وعلى النقيض من ذلك، فإن فحص الخلية الواحدة لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه من قبل الترانسبوزون (scATAC-seq) يسمح للباحثين بفحص الحمض النووي باستخدام ترانسبوزون مستأنس لتحديد ملامح الكروماتين المفتوح بسهولة على مستوى النيوكليوتيد الواحد8. وقد مر هذا من خلال تحجيم مماثل ل scRNA-seq والآن يمكن للباحثين تحديد أنواع الخلايا الفردية والأنماط الظاهرية الشخصية عبر الآلاف من الجينومات الفردية8.
وقد سمح الاقتران بين scRNA-seq و scATAC-seq للباحثين بالقدرة على تحديد ملامح الآلاف من الخلايا لتحديد مجموعات الخلايا والتنظيم الجيني والشبكات التنظيمية الجينية في نماذج الأمراض والعمليات التنموية9،10،11،12. هنا يحدد المؤلفون كيفية استخدام MULTI-seq لأول مرة لتكثيف التنميط الظاهري لعدد لا يحصى من النماذج الحيوانية واستخدام scRNA-seq و scATAC-seq المقترنين للحصول على فهم أفضل لمشهد الكروماتين والشبكات التنظيمية في هذه النماذج الحيوانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تنبع قوة MULTI-seq من التكامل السلس للبيانات من ظروف أو نماذج تجريبية متعددة والفائدة الهائلة من حيث التكلفة والحد من تأثيرات الدفعات. يوفر استخدام MULTI-seq عمقا غير مسبوق للتنميط الظاهري في المختبر. طرق الإرسال المتعدد غير الجينية مثل تجزئة الخلايا أو تجزئة النوى فتحت الباب أمام عينات متعددة ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ليندا أورزوليك من مركز جونز هوبكنز للنسخ و Deep Sequencing Core للمساعدة في تسلسل المكتبات المنتجة و Lizhi Jiang على أداء عمليات استئصال الشبكية خارج الجسم الحي .
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Riferimenti
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
- Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
- Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
- Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
- Worthington Biochemical Corporation. . Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
- Agilent. . DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
- ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
- Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
- Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
- Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
- Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
- Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
- METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
- Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).
