Multiplekset analyse af retinal genekspression og kromatintilgængelighed ved hjælp af scRNA-Seq og scATAC-Seq
Summary
Her viser forfatterne nytten af MULTI-seq til phenotyping og efterfølgende parret scRNA-seq og scATAC-seq til karakterisering af transkriptomiske og kromatin tilgængelighedsprofiler i nethinden.
Abstract
Kraftfulde næste generations sekventeringsteknikker tilbyder robust og omfattende analyse for at undersøge, hvordan retinale genregulerende netværk fungerer under udvikling og i sygdomstilstande. Enkeltcelle RNA-sekventering giver os mulighed for omfattende at profilere genekspressionsændringer observeret i retinal udvikling og sygdom på celleniveau, mens enkeltcellet ATAC-Seq gør det muligt at profilere analyse af kromatintilgængelighed og transkriptionsfaktorbinding ved lignende opløsning. Her beskrives brugen af disse teknikker i nethinden, og MULTI-Seq demonstreres, hvor individuelle prøver mærkes med et modificeret oligonukleotid-lipidkompleks, hvilket gør det muligt for forskere både at øge omfanget af individuelle eksperimenter og reducere omkostningerne væsentligt.
Introduction
At forstå, hvordan gener kan påvirke celleskæbne, spiller en central rolle i forhørsprocesser som sygdom og embryonal progression. De komplekse forhold mellem transkriptionsfaktorer og deres målgener kan grupperes i genregulerende netværk. Stigende beviser placerer disse genregulerende netværk i centrum for både sygdom og udvikling på tværs af evolutionære slægter1. Mens tidligere teknikker såsom qRT-PCR fokuserede på et enkelt gen eller et sæt gener, giver anvendelsen af high-throughput sekventeringsteknologi mulighed for profilering af komplette cellulære transkriptomer.
RNA-seq giver et indblik i transkriptomik i stor skala 2,3. Enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) giver efterforskere mulighed for ikke kun at profilere transkriptomer, men forbinde specifikke celletyper med genekspressionsprofiler4. Dette opnås bioinformatisk ved at fodre individuelle celleprofiler i sorteringsalgoritmer ved hjælp af kendte genmarkører5. Multiplexing ved hjælp af lipidmærkede indekssekventering (MULTI-seq) tilbyder hidtil uset mangfoldighed i antallet af scRNA-Seq-profiler, der kan indsamles6. Denne lipidbaserede teknik adskiller sig fra andre prøveindekseringsteknikker såsom cellehashing, der er afhængige af tilstedeværelsen af overfladeantigener og antistoffer med høj affinitet i stedet for plasmamembranintegration7. Ikke alene er det nu muligt at profilere genekspressionsprofiler i celletyper, men forskellige eksperimenter kan kombineres til et enkelt sekventeringsbibliotek, hvilket dramatisk sænker omkostningerne ved et individuelt scRNA-seq-eksperiment6. Omkostningerne ved scRNA-seq kan virke uoverkommelige til brug i fænotypeforsøg, hvor mange forskellige genotyper, tilstande eller patientprøver analyseres, men multiplexing tillader kombinationen af op til 96 prøver i et enkelt bibliotek6.
Profilering af genekspression via scRNA-seq har ikke været den eneste high-throughput sekventeringsbaserede teknik til at revolutionere den nuværende forståelse af, hvordan molekylære mekanismer dikterer celle skæbne. Mens forståelse af, hvilke gen transkripter der er til stede i en celle, muliggør identifikation af celletype, er det lige så vigtigt at forstå, hvordan genomisk organisation regulerer udvikling og sygdomsprogression. Tidlige undersøgelser var afhængige af at detektere DNase-medieret spaltning af sekvenser, der ikke var bundet til histoner, efterfulgt af sekventering af de resulterende DNA-fragmenter for at identificere regioner med åbent kromatin. I modsætning hertil giver enkeltcelleassay til transposon tilgængelig kromatinsekventering (scATAC-seq) forskere mulighed for at undersøge DNA med en domesticeret transposon for let at profilere åbent kromatin på enkeltnukleotidniveau8. Dette har gennemgået en lignende skalering som scRNA-seq, og nu kan efterforskere identificere individuelle celletyper og profilfænotyper på tværs af tusindvis af individuelle genomer8.
Parringen af scRNA-seq og scATAC-seq har gjort det muligt for forskere at profilere tusindvis af celler til at bestemme cellepopulationer, genomisk organisation og genregulerende netværk i sygdomsmodeller og udviklingsprocesser 9,10,11,12. Her skitserer forfatterne, hvordan man først kan bruge MULTI-seq til at kondensere fænotypning af et utal af dyremodeller og anvende parret scRNA-seq og scATAC-seq for at få en bedre forståelse af kromatinlandskabet og regulatoriske netværk i disse dyremodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kraften i MULTI-seq stammer fra problemfri integration af data fra flere eksperimentelle forhold eller modeller og den enorme fordel med hensyn til omkostninger og begrænsning af batcheffekter. Brug af MULTI-seq tilbyder en laboratorie hidtil uset fænotypningsdybde. Ikke-genetiske multiplexingmetoder såsom cellehashing eller kerner hashing åbnede døren til multipleksede prøver ved brug af stregkodede antistoffer 7,19,20. D…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Linda Orzolek fra Johns Hopkins Transcriptomics og Deep Sequencing Core for hjælp til sekventering af de producerede biblioteker og Lizhi Jiang for at udføre ex vivo retinal explants.
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Riferimenti
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
- Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
- Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
- Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
- Worthington Biochemical Corporation. . Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
- Agilent. . DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
- ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
- Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
- Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
- Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
- Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
- Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
- METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
- Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).
