Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq
Summary
Hier tonen de auteurs het nut van MULTI-seq voor fenotypering en daaropvolgende gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq bij het karakteriseren van de transcriptomische en chromatinetoegankelijkheidsprofielen in retina.
Abstract
Krachtige sequencingtechnieken van de volgende generatie bieden robuuste en uitgebreide analyse om te onderzoeken hoe retinale genregulerende netwerken functioneren tijdens de ontwikkeling en in ziektetoestanden. Single-cell RNA sequencing stelt ons in staat om genexpressieveranderingen waargenomen in retinale ontwikkeling en ziekte op cellulair niveau uitgebreid te profileren, terwijl eencellige ATAC-Seq het mogelijk maakt om analyse van chromatinetoegankelijkheid en transcriptiefactorbinding te profileren met een vergelijkbare resolutie. Hier wordt het gebruik van deze technieken in het zich ontwikkelende netvlies beschreven en MULTI-Seq gedemonstreerd, waarbij individuele monsters worden gelabeld met een gemodificeerd oligonucleotide-lipidencomplex, waardoor onderzoekers zowel de reikwijdte van individuele experimenten kunnen vergroten als de kosten aanzienlijk kunnen verlagen.
Introduction
Begrijpen hoe genen het lot van cellen kunnen beïnvloeden, speelt een sleutelrol bij het ondervragen van processen zoals ziekte en embryonale progressie. De complexe relaties tussen transcriptiefactoren en hun doelgenen kunnen worden gegroepeerd in genregulerende netwerken. Toenemend bewijs plaatst deze genregulerende netwerken in het centrum van zowel ziekte als ontwikkeling in evolutionaire afstammingslijnen1. Terwijl eerdere technieken zoals qRT-PCR zich richtten op een enkel gen of een set genen, maakt de toepassing van high-throughput sequencing-technologie de profilering van volledige cellulaire transcriptomen mogelijk.
RNA-seq biedt een inkijkje in grootschalige transcriptomics 2,3. Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) geeft onderzoekers de mogelijkheid om niet alleen transcriptomen te profileren, maar ook specifieke celtypen te koppelen aan genexpressieprofielen4. Dit wordt bioinformatisch bereikt door individuele celprofielen in te voeren in sorteeralgoritmen met behulp van bekende genmarkers5. Multiplexing met behulp van lipid-tagged indices sequencing (MULTI-seq) biedt ongekende diversiteit in het aantal scRNA-Seq profielen dat kan worden verzameld6. Deze op lipiden gebaseerde techniek verschilt van andere monsterindexeringstechnieken zoals cel-hashing die afhankelijk zijn van de aanwezigheid van oppervlakteantigenen en antilichamen met hoge affiniteit in plaats van plasmamembraanintegratie7. Niet alleen is het nu mogelijk om genexpressieprofielen in celtypen te profileren, maar verschillende experimenten kunnen worden gecombineerd in een enkele sequencingbibliotheek, waardoor de kosten van een individueel scRNA-seq-experiment drastisch worden verlaagd6. De kosten van scRNA-seq lijken misschien onbetaalbaar voor gebruik in fenotyperingsexperimenten waarbij veel verschillende genotypen, aandoeningen of patiëntmonsters worden geanalyseerd, maar multiplexing maakt de combinatie van maximaal 96 monsters in een enkele bibliotheek mogelijk6.
Profilering van genexpressie via scRNA-seq is niet de enige high-throughput sequencing-gebaseerde techniek geweest om een revolutie teweeg te brengen in het huidige begrip van hoe moleculaire mechanismen het lot van cellen dicteren. Hoewel het begrijpen van welke gentranscripten in een cel de identificatie van het celtype mogelijk maakt, is het net zo belangrijk om te begrijpen hoe genomische organisatie de ontwikkeling en ziekteprogressie reguleert. Vroege studies waren gebaseerd op het detecteren van DNase-gemedieerde splitsing van sequenties die niet gebonden zijn aan histonen, gevolgd door sequencing van de resulterende DNA-fragmenten om gebieden van open chromatine te identificeren. Daarentegen stelt eencellige assay voor transposon toegankelijke chromatine sequencing (scATAC-seq) onderzoekers in staat om DNA te onderzoeken met een gedomesticeerd transposon om gemakkelijk open chromatine te profileren op het enkele nucleotideniveau8. Dit is door een vergelijkbare schaal gegaan als scRNA-seq en nu kunnen onderzoekers individuele celtypen en profielfenotypen identificeren in duizenden individuele genomen8.
De koppeling van scRNA-seq en scATAC-seq heeft onderzoekers de mogelijkheid gegeven om duizenden cellen te profileren om celpopulaties, genomische organisatie en genregulerende netwerken in ziektemodellen en ontwikkelingsprocessen te bepalen 9,10,11,12. Hier schetsen de auteurs hoe ze eerst MULTI-seq kunnen gebruiken om fenotypering van een groot aantal diermodellen te condenseren en gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq te gebruiken om een beter begrip te krijgen van het chromatinelandschap en regulerende netwerken in deze diermodellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kracht van MULTI-seq komt voort uit de naadloze integratie van gegevens uit meerdere experimentele omstandigheden of modellen en het enorme voordeel in termen van kosten en het beperken van batcheffecten. Het gebruik van MULTI-seq biedt een laboratorium ongekende fenotyperingsdiepte. Niet-genetische multiplexingmethoden zoals cell hashing of nuclei hashing openden de deur naar multiplexed samples door het gebruik van barcode-antilichamen 7,19,20<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Linda Orzolek van de Johns Hopkins Transcriptomics en Deep Sequencing Core voor hulp bij het sequentiëren van de geproduceerde bibliotheken en Lizhi Jiang voor het uitvoeren van de ex vivo retinale explantaten.
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Riferimenti
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
- Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
- Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
- Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
- Worthington Biochemical Corporation. . Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
- Agilent. . DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
- ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
- Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
- Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
- Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
- Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
- Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
- METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
- Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).
