Multiplexe Analyse der retinalen Genexpression und der Chromatinzugänglichkeit mittels scRNA-seq und scATAC-seq
Summary
Hier zeigen die Autoren den Nutzen von MULTI-seq für die Phänotypisierung und nachfolgende gepaarte scRNA-seq und scATAC-seq bei der Charakterisierung der transkriptomischen und chromatinischen Zugänglichkeitsprofile in der Netzhaut.
Abstract
Leistungsstarke Next-Generation-Sequenzierungstechniken bieten robuste und umfassende Analysen, um zu untersuchen, wie retinale genregulatorische Netzwerke während der Entwicklung und in Krankheitszuständen funktionieren. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ermöglicht es uns, Genexpressionsänderungen, die bei der Entwicklung und Erkrankung der Netzhaut auf zellulärer Ebene beobachtet wurden, umfassend zu profilieren, während Einzelzell-ATAC-Seq die Analyse der Chromatin-Zugänglichkeit und der Transkriptionsfaktorbindung mit ähnlicher Auflösung ermöglicht. Hier wird der Einsatz dieser Techniken in der sich entwickelnden Netzhaut beschrieben und MULTI-Seq demonstriert, bei dem einzelne Proben mit einem modifizierten Oligonukleotid-Lipid-Komplex markiert werden, der es den Forschern ermöglicht, sowohl den Umfang einzelner Experimente zu erhöhen als auch die Kosten erheblich zu senken.
Introduction
Zu verstehen, wie Gene das Zellschicksal beeinflussen können, spielt eine Schlüsselrolle bei der Befragung von Prozessen wie Krankheit und embryonalem Verlauf. Die komplexen Beziehungen zwischen Transkriptionsfaktoren und ihren Zielgenen können in genregulatorischen Netzwerken gruppiert werden. Immer mehr Beweise stellen diese genregulatorischen Netzwerke in den Mittelpunkt sowohl der Krankheit als auch der Entwicklung über evolutionäre Linien hinweg1. Während sich frühere Techniken wie die qRT-PCR auf ein einzelnes Gen oder einen Satz von Genen konzentrierten, ermöglicht die Anwendung der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie die Profilierung vollständiger zellulärer Transkriptome.
RNA-seq bietet einen Einblick in die großflächige Transkriptomik 2,3. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) gibt Forschern die Möglichkeit, nicht nur Transkriptome zu profilieren, sondern auch bestimmte Zelltypen mit Genexpressionsprofilenzu verknüpfen 4. Dies wird bioinformatisch erreicht, indem einzelne Zellprofile unter Verwendung bekannter Genmarker in Sortieralgorithmen eingespeistwerden 5. Das Multiplexing mittels lipid-tagged indices sequencing (MULTI-seq) bietet eine beispiellose Vielfalt in der Anzahl der scRNA-Seq-Profile, die gesammelt werden können6. Diese lipidbasierte Technik unterscheidet sich von anderen Probenindizierungstechniken wie dem Zell-Hashing, die auf dem Vorhandensein von Oberflächenantigenen und hochaffinen Antikörpern anstelle der Plasmamembranintegrationberuhen 7. Es ist jetzt nicht nur möglich, Genexpressionsprofile in Zelltypen zu profilieren, sondern verschiedene Experimente können auch in einer einzigen Sequenzierungsbibliothek kombiniert werden, wodurch die Kosten eines einzelnen scRNA-seq-Experiments drastisch gesenktwerden 6. Die Kosten für scRNA-seq mögen für den Einsatz in Phänotypisierungsexperimenten, bei denen viele verschiedene Genotypen, Bedingungen oder Patientenproben analysiert werden, unerschwinglich erscheinen, aber Multiplexing ermöglicht die Kombination von bis zu 96 Proben in einer einzigen Bibliothek6.
Die Profilierung der Genexpression über scRNA-seq war nicht die einzige auf Hochdurchsatz-Sequenzierung basierende Technik, die das derzeitige Verständnis dessen, wie molekulare Mechanismen das Zellschicksal bestimmen, revolutioniert. Während das Verständnis, welche Gentranskripte in einer Zelle vorhanden sind, die Identifizierung des Zelltyps ermöglicht, ist es ebenso wichtig zu verstehen, wie die genomische Organisation die Entwicklung und das Fortschreiten der Krankheit reguliert. Frühe Studien stützten sich auf den Nachweis einer DNase-vermittelten Spaltung von Sequenzen, die nicht an Histone gebunden sind, gefolgt von der Sequenzierung der resultierenden DNA-Fragmente, um Regionen mit offenem Chromatin zu identifizieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht der Einzelzellassay für die transposonzugängliche Chromatinsequenzierung (scATAC-seq) den Forschern, DNA mit einem domestizierten Transposon zu untersuchen, um offenes Chromatin auf der Einzelnukleotidebene8 leicht zu profilieren. Dies hat eine ähnliche Skalierung wie scRNA-seq durchlaufen und jetzt können Forscher einzelne Zelltypen identifizieren und Phänotypen über Tausende von einzelnen Genomen hinwegprofilieren 8.
Die Paarung von scRNA-seq und scATAC-seq hat es Forschern ermöglicht, Tausende von Zellen zu profilieren, um Zellpopulationen, genomische Organisation und genregulatorische Netzwerke in Krankheitsmodellen und Entwicklungsprozessen zu bestimmen 9,10,11,12. Hier skizzieren die Autoren, wie man MULTI-seq zuerst nutzt, um die Phänotypisierung einer Vielzahl von Tiermodellen zu kondensieren, und paarweise scRNA-seq und scATAC-seq einsetzt, um ein besseres Verständnis der Chromatinlandschaft und der regulatorischen Netzwerke in diesen Tiermodellen zu erlangen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Leistungsfähigkeit von MULTI-seq ergibt sich aus der nahtlosen Integration von Daten aus mehreren experimentellen Bedingungen oder Modellen und dem enormen Nutzen in Bezug auf Kosten und Begrenzung der Chargeneffekte. Die Verwendung von MULTI-seq bietet eine beispiellose Phänotypisierungstiefe im Labor. Nicht-genetische Multiplexing-Methoden wie Zell-Hashing oder Nuclei-Hashing öffneten die Tür zu gemultiplexten Proben durch die Verwendung von barcodierten Antikörpern 7,19,20<s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Linda Orzolek von der Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core für die Hilfe bei der Sequenzierung der produzierten Bibliotheken und Lizhi Jiang für die Durchführung der Ex-vivo-Netzhautexplantate .
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Riferimenti
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
- Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
- Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
- Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
- Worthington Biochemical Corporation. . Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
- Agilent. . DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
- ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
- Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
- Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
- Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
- Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
- Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
- METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
- Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).
