ניתוח מרובב של ביטוי גנים ברשתית ונגישות כרומטין באמצעות scRNA-Seq ו- scATAC-Seq
Summary
כאן, המחברים מציגים את התועלת של MULTI-seq עבור פנוטיפ והצמד הבא scRNA-seq ו- scATAC-seq באפיון פרופילי הנגישות של תעתיק וכרומטין ברשתית.
Abstract
טכניקות ריצוף עוצמתיות של הדור הבא מציעות ניתוח חזק ומקיף כדי לחקור כיצד רשתות ויסות גנים ברשתית מתפקדות במהלך ההתפתחות ובמצבי המחלה. ריצוף RNA חד-תאי מאפשר לנו ליצור פרופיל מקיף של שינויים בביטוי גנים שנצפו בהתפתחות הרשתית ובמחלות ברמה התאית, בעוד ש-ATAC-Seq חד-תאי מאפשר ניתוח של נגישות כרומטין וקשירת גורמי שעתוק ברזולוציה דומה. כאן מתואר השימוש בטכניקות אלה ברשתית המתפתחת, ומדגים MULTI-Seq, שבו דגימות בודדות מסומנות בקומפלקס אוליגונוקלאוטיד-ליפידים שונה, מה שמאפשר לחוקרים להגדיל את היקף הניסויים הבודדים ולהפחית באופן משמעותי את העלויות.
Introduction
הבנת האופן שבו גנים יכולים להשפיע על גורל התאים ממלאת תפקיד מפתח בחקירת תהליכים כמו מחלות והתקדמות עוברית. ניתן לקבץ את היחסים המורכבים בין גורמי שעתוק לבין גני המטרה שלהם ברשתות ויסות גנים. עדויות הולכות וגוברות מציבות את הרשתות הרגולטוריות של הגנים הללו במרכזן של מחלות והתפתחות על פני שושלות אבולוציוניות1. בעוד שטכניקות קודמות כגון qRT-PCR התמקדו בגן יחיד או בקבוצת גנים אחת, היישום של טכנולוגיית ריצוף בתפוקה גבוהה מאפשר פרופיל של תעתיקים תאיים שלמים.
RNA-seq מציע הצצה לתעתיק בקנה מידה גדול 2,3. ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מעניק לחוקרים את היכולת לא רק ליצור פרופילים של תעתיקים אלא גם לקשר בין סוגי תאים ספציפיים לפרופילי ביטוי גנים4. זה מושג באופן ביואינפורמטי על ידי הזנת פרופילי תאים בודדים לאלגוריתמים של מיון באמצעות סמני גנים ידועים5. ריבוב באמצעות ריצוף מדדים המתויגים בשומנים (MULTI-seq) מציע גיוון חסר תקדים במספר פרופילי scRNA-Seq שניתן לאסוף6. טכניקה זו המבוססת על שומנים שונה מטכניקות אחרות של אינדקס דגימות כגון גיבוב תאים המסתמכות על נוכחות של אנטיגנים על פני השטח ונוגדנים בעלי זיקה גבוהה במקום שילוב קרום פלזמה7. לא רק שכיום ניתן ליצור פרופילים של ביטוי גנים לסוגי תאים, אלא שניתן לשלב ניסויים שונים בספריית ריצוף אחת, מה שמוריד באופן דרמטי את העלות של ניסוי scRNA-seq6 בודד. העלות של scRNA-seq עשויה להיראות בלתי אפשרית לשימוש בניסויי פנוטיפ שבהם מנותחים גנוטיפים, מצבים או דגימות מטופלים רבים ושונים, אך ריבוב מאפשר שילוב של עד 96 דגימות בספריה אחת6.
יצירת פרופיל של ביטוי גנים באמצעות scRNA-seq לא הייתה הטכניקה היחידה המבוססת על ריצוף בתפוקה גבוהה שחוללה מהפכה בהבנה הנוכחית של האופן שבו מנגנונים מולקולריים מכתיבים את גורל התא. בעוד שהבנת תעתיקי הגנים הקיימים בתא מאפשרת זיהוי של סוג התא, חשובה לא פחות היא הבנת האופן שבו ארגון גנומי מווסת את ההתפתחות ואת התקדמות המחלה. מחקרים מוקדמים הסתמכו על גילוי ביקוע בתיווך DNase של רצפים שאינם קשורים להיסטונים, ולאחר מכן ריצוף של מקטעי הדנ”א שהתקבלו כדי לזהות אזורים של כרומטין פתוח. לעומת זאת, בדיקה של תא יחיד לריצוף כרומטין נגיש לטרנספוזון (scATAC-seq) מאפשרת לחוקרים לחקור דנ”א עם טרנספוזון מבוית כדי ליצור פרופיל קל של כרומטין פתוח ברמת נוקלאוטיד יחידה8. זה עבר שינוי קנה מידה דומה ל-scRNA-seq וכעת חוקרים יכולים לזהות סוגי תאים בודדים ולתאר פנוטיפים על פני אלפי גנומים בודדים8.
הזיווג של scRNA-seq ו-scATAC-seq אפשר לחוקרים את היכולת ליצור פרופיל של אלפי תאים כדי לקבוע אוכלוסיות תאים, ארגון גנומי ורשתות ויסות גנים במודלים של מחלות ובתהליכים התפתחותיים 9,10,11,12. כאן המחברים מתארים כיצד להשתמש תחילה ב-MULTI-seq כדי לדחוס פנוטיפ של מספר עצום של מודלים של בעלי חיים ולהשתמש בזוגות scRNA-seq ו-scATAC-seq כדי להבין טוב יותר את נוף הכרומטין ואת הרשתות הרגולטוריות במודלים אלה של בעלי חיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
העוצמה של MULTI-seq נובעת משילוב חלק של נתונים ממצבים או מודלים ניסיוניים מרובים ומהתועלת העצומה במונחים של עלות והגבלת השפעות אצווה. שימוש ב- MULTI-seq מציע עומק פנוטיפי חסר תקדים במעבדה. שיטות ריבוב לא גנטיות כגון גיבוב תאים או גיבוב גרעינים פתחו את הדלת לדגימות מרובות באמצעות שימוש בנוגדנים בר?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ללינדה אורזולק מהתעתיק של ג’ונס הופקינס ולליבת הריצוף העמוק על העזרה בריצוף הספריות שהופקו ולליזי ג’יאנג על ביצוע גולשי הרשתית ex vivo .
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Riferimenti
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
- Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
- Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
- Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
- Worthington Biochemical Corporation. . Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
- Agilent. . DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
- ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
- Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
- Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
- Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
- Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
- Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
- METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
- Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).
