रेटिना जीन अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी का मल्टीप्लेक्स विश्लेषण एससीआरएनए-सीक और एससीएटीएसी-सेक का उपयोग करना
Summary
यहां, लेखक रेटिना में ट्रांसक्रिप्टोमिक और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी प्रोफाइल की विशेषता में फेनोटाइपिंग और बाद में युग्मित एससीआरएनए-सेक और एससीएटीएसी-सेक के लिए मल्टी-सेक की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हैं।
Abstract
शक्तिशाली अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकें यह जांचने के लिए मजबूत और व्यापक विश्लेषण प्रदान करती हैं कि रेटिना जीन नियामक नेटवर्क विकास के दौरान और रोग राज्यों में कैसे कार्य करते हैं। सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण हमें सेलुलर स्तर पर रेटिना विकास और बीमारी में देखे गए जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों को व्यापक रूप से प्रोफाइल करने की अनुमति देता है, जबकि एकल-सेल एटीएसी-सेक क्रोमेटिन पहुंच और प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी के विश्लेषण को समान रिज़ॉल्यूशन पर प्रोफाइल करने की अनुमति देता है। यहां विकासशील रेटिना में इन तकनीकों के उपयोग का वर्णन किया गया है, और मल्टी-सेक का प्रदर्शन किया जाता है, जहां व्यक्तिगत नमूनों को एक संशोधित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-लिपिड कॉम्प्लेक्स के साथ लेबल किया जाता है, जिससे शोधकर्ताओं को व्यक्तिगत प्रयोगों के दायरे को बढ़ाने और लागत को काफी कम करने में सक्षम बनाता है।
Introduction
यह समझना कि जीन कोशिका भाग्य को कैसे प्रभावित कर सकते हैं, रोग और भ्रूण की प्रगति जैसी प्रक्रियाओं से पूछताछ करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। प्रतिलेखन कारकों और उनके लक्ष्य जीन के बीच जटिल संबंधों को जीन नियामक नेटवर्क में वर्गीकृत किया जा सकता है। बढ़ते सबूत इन जीन नियामक नेटवर्क को विकासवादी वंशों में बीमारी और विकास दोनों के केंद्र में रखते हैं1. जबकि क्यूआरटी-पीसीआर जैसी पिछली तकनीकें एक जीन या जीन के सेट पर केंद्रित थीं, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीक का अनुप्रयोग पूर्ण सेलुलर ट्रांसक्रिप्टोम की प्रोफाइलिंग की अनुमति देता है।
आरएनए-सेक बड़े पैमाने पर ट्रांसक्रिप्टोमिक्स 2,3 में एक झलक प्रदान करता है। सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) जांचकर्ताओं को न केवल ट्रांसक्रिप्टोम को प्रोफाइल करने की क्षमता देता है, बल्कि जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ विशिष्ट सेल प्रकारों कोजोड़ता है 4. यह ज्ञात जीन मार्करों का उपयोग करके छँटाई एल्गोरिदम में व्यक्तिगत सेल प्रोफाइल खिलाकर जैव सूचनात्मक रूप से प्राप्त किया जाता है5. लिपिड-टैग किए गए सूचकांक अनुक्रमण (मल्टी-सेक) का उपयोग करके मल्टीप्लेक्सिंग एससीआरएनए-सेक प्रोफाइल की संख्या में अभूतपूर्व विविधता प्रदान करता है जिसे एकत्र किया जा सकता है6. यह लिपिड आधारित तकनीक अन्य नमूना अनुक्रमण तकनीकों जैसे सेल-हैशिंग से भिन्न होती है जो प्लाज्मा झिल्ली एकीकरण7 के बजाय सतह एंटीजन और उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी की उपस्थिति पर निर्भर करती है। न केवल अब सेल प्रकारों में जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को प्रोफाइल करना संभव है, बल्कि विभिन्न प्रयोगों को एक एकल अनुक्रमण पुस्तकालय में जोड़ा जा सकता है, नाटकीय रूप से एक व्यक्तिगत एससीआरएनए-सेक प्रयोग6 की लागत को कम करता है। एससीआरएनए-सेक की लागत फेनोटाइपिंग प्रयोगों में उपयोग के लिए निषेधात्मक लग सकती है जहां कई अलग-अलग जीनोटाइप, स्थितियों या रोगी के नमूनों का विश्लेषण किया जाता है, लेकिन मल्टीप्लेक्सिंग एकही पुस्तकालय 6 में 96 नमूनों के संयोजन की अनुमति देता है।
एससीआरएनए-सेक के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा एकमात्र उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण-आधारित तकनीक नहीं है जो वर्तमान समझ में क्रांतिकारी बदलाव करती है कि आणविक तंत्र सेल भाग्य को कैसे निर्देशित करते हैं। यह समझने के दौरान कि कोशिका में कौन से जीन टेप मौजूद हैं, सेल प्रकार की पहचान करने में सक्षम बनाता है, उतना ही महत्वपूर्ण यह समझना है कि जीनोमिक संगठन विकास और रोग प्रगति को कैसे नियंत्रित करता है। प्रारंभिक अध्ययन हिस्टोन से बंधे नहीं अनुक्रमों के डीएनए-मध्यस्थता दरार का पता लगाने पर निर्भर थे, इसके बाद खुले क्रोमैटिन के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए परिणामस्वरूप डीएनए टुकड़ों का अनुक्रमण किया गया था। इसके विपरीत, ट्रांसपोसन सुलभ क्रोमैटिन अनुक्रमण (एससीएटीएसी-सेक) के लिए एकल कोशिका परख शोधकर्ताओं को एकल न्यूक्लियोटाइड स्तर 8 पर खुले क्रोमैटिन को आसानी से प्रोफाइल करने के लिए एक पालतू ट्रांसपोसन के साथ डीएनए की जांच करने की अनुमतिदेती है। यह एससीआरएनए-सेक के समान स्केलिंग के माध्यम से चला गया है और अब जांचकर्ता हजारों व्यक्तिगत जीनोम8 में व्यक्तिगत सेल प्रकार और प्रोफाइल फेनोटाइप की पहचान कर सकते हैं।
एससीआरएनए-सेक और एससीएटीएसी-सीक्यू की जोड़ी ने शोधकर्ताओं को रोग मॉडल और विकास प्रक्रियाओं 9,10,11,12 में सेल आबादी, जीनोमिक संगठन और जीन नियामक नेटवर्क निर्धारित करनेके लिए हजारों कोशिकाओं को प्रोफाइल करने की क्षमता की अनुमति दी है। यहां लेखकों ने रेखांकित किया है कि पशु मॉडल के असंख्य फेनोटाइपिंग को संघनित करने के लिए पहले मल्टी-सेक का उपयोग कैसे करें और इन पशु मॉडलों में क्रोमैटिन परिदृश्य और नियामक नेटवर्क की बेहतर समझ हासिल करने के लिए युग्मित एससीआरएनए-सेक और एससीएटीएसी-सेक को नियोजित करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
मल्टी-सेक की शक्ति कई प्रयोगात्मक स्थितियों या मॉडलों से डेटा के निर्बाध एकीकरण और लागत और सीमित बैच प्रभावों के संदर्भ में भारी लाभ से उपजी है। मल्टी-सेक का उपयोग एक प्रयोगशाला अभूतपूर्व फेनोटाइपिं?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उत्पादित पुस्तकालयों को अनुक्रमित करने में मदद के लिए जॉन्स हॉपकिन्स ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और डीप सीक्वेंसिंग कोर से लिंडा ओर्ज़ोलेक और पूर्व विवो रेटिना एक्सप्लांट्स करने के लिए लिज़ी जियांग का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Riferimenti
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
- Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
- Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
- Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
- Worthington Biochemical Corporation. . Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
- Agilent. . DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
- ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
- Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
- Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
- Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
- Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
- Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
- METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
- Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).
