Analisi multiplexata dell'espressione genica retinica e dell'accessibilità alla cromatina utilizzando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Summary

Qui, gli autori mostrano l’utilità di MULTI-seq per la fenotipizzazione e il successivo accoppiato scRNA-seq e scATAC-seq nel caratterizzare i profili di accessibilità trascrittomica e cromatina nella retina.

Abstract

Potenti tecniche di sequenziamento di nuova generazione offrono un’analisi robusta e completa per studiare come funzionano le reti di regolazione genica retinica durante lo sviluppo e negli stati patologici. Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula ci consente di profilare in modo completo i cambiamenti di espressione genica osservati nello sviluppo retinico e nella malattia a livello cellulare, mentre l’ATAC-Seq a cellula singola consente di profilare l’analisi dell’accessibilità della cromatina e del legame del fattore di trascrizione a risoluzione simile. Qui viene descritto l’uso di queste tecniche nella retina in via di sviluppo e viene dimostrato MULTI-Seq, in cui i singoli campioni sono etichettati con un complesso oligonucleotide-lipidico modificato, consentendo ai ricercatori di aumentare la portata dei singoli esperimenti e ridurre sostanzialmente i costi.

Introduction

Capire come i geni possono influenzare il destino cellulare gioca un ruolo chiave nell’interrogare processi come la malattia e la progressione embrionale. Le complesse relazioni tra i fattori di trascrizione e i loro geni bersaglio possono essere raggruppate in reti di regolazione genica. Prove crescenti collocano queste reti di regolazione genica al centro sia della malattia che dello sviluppo attraverso i lignaggi evolutivi¹. Mentre tecniche precedenti come la qRT-PCR si concentravano su un singolo gene o insieme di geni, l’applicazione della tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento consente la profilazione di trascrittomi cellulari completi.

RNA-seq offre uno sguardo alla trascrittomica su larga scala ^2,3. Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) offre ai ricercatori la capacità non solo di profilare i trascrittomi, ma di collegare specifici tipi di cellule con i profili di espressione genica⁴. Ciò si ottiene bioinformaticamente alimentando i singoli profili cellulari in algoritmi di ordinamento utilizzando marcatori genici noti⁵. Il multiplexing che utilizza il sequenziamento degli indici con tag lipidi (MULTI-seq) offre una diversità senza precedenti nel numero di profili scRNA-Seq che possono essere raccolti⁶. Questa tecnica basata sui lipidi differisce da altre tecniche di indicizzazione dei campioni come l’hashing cellulare che si basano sulla presenza di antigeni di superficie e anticorpi ad alta affinità anziché sull’integrazione della membrana^{plasmatica 7}. Non solo è ora possibile profilare i profili di espressione genica in tipi di cellule, ma diversi esperimenti possono essere combinati in un’unica libreria di sequenziamento, riducendo drasticamente il costo di un singolo esperimento scRNA-seq⁶. Il costo di scRNA-seq può sembrare proibitivo per l’uso in esperimenti di fenotipizzazione in cui vengono analizzati molti genotipi, condizioni o campioni di pazienti diversi, ma il multiplexing consente la combinazione di un massimo di 96 campioni in una singola libreria⁶.

La profilazione dell’espressione genica tramite scRNA-seq non è stata l’unica tecnica basata sul sequenziamento ad alto rendimento a rivoluzionare l’attuale comprensione di come i meccanismi molecolari dettano il destino cellulare. Mentre capire quali trascritti genici sono presenti in una cellula consente l’identificazione del tipo di cellula, altrettanto importante è capire come l’organizzazione genomica regola lo sviluppo e la progressione della malattia. I primi studi si sono basati sul rilevamento della scissione mediata dalla DNasi di sequenze non legate agli istoni, seguita dal sequenziamento dei frammenti di DNA risultanti per identificare le regioni di cromatina aperta. Al contrario, il test a singola cellula per il sequenziamento della cromatina accessibile al trasposone (scATAC-seq) consente ai ricercatori di sondare il DNA con un trasposone addomesticato per profilare facilmente la cromatina aperta al livello⁸ del singolo nucleotide. Questo è passato attraverso un ridimensionamento simile a scRNA-seq e ora i ricercatori possono identificare singoli tipi di cellule e fenotipi di profilo su migliaia di singoli genomi⁸.

L’accoppiamento di scRNA-seq e scATAC-seq ha permesso ai ricercatori di profilare migliaia di cellule per determinare le popolazioni cellulari, l’organizzazione genomica e le reti di regolazione genica nei modelli di malattia e nei processi di sviluppo 9,10,11,12. Qui gli autori delineano come utilizzare prima MULTI-seq per condensare la fenotipizzazione di una miriade di modelli animali e impiegare accoppiati scRNA-seq e scATAC-seq per ottenere una migliore comprensione del panorama della cromatina e delle reti regolatorie in questi modelli animali.

Protocol

L’uso di animali per questi studi è stato condotto utilizzando protocolli approvati dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, in conformità con le linee guida ARRIVE, e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le normative pertinenti. 1. MULTI-seq Preparazione dei media Preparare ed equilibrare l’inibitore dell’ovomucoide, 10 mg di inibitore dell’ovomucoide e 10 mg di albumina per mL di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS), per…

Representative Results

Questo flusso di lavoro delinea una strategia per lo studio dei fenotipi dello sviluppo e dei processi regolatori utilizzando il sequenziamento a singola cellula. Il multiplexing di campioni MULTI-seq consente un test di fenotipizzazione iniziale a basso costo, mentre la raccolta e la fissazione accoppiate di campioni per scRNA-seq e scATAC-seq consentono un’indagine più approfondita (Figura 1). Il codice a barre MULTI-seq consente il sequenziamento combinato di …

Discussion

La potenza di MULTI-seq deriva dalla perfetta integrazione dei dati provenienti da più condizioni o modelli sperimentali e dall’enorme vantaggio in termini di costi e limitazione degli effetti batch. L’utilizzo di MULTI-seq offre una profondità di fenotipizzazione senza precedenti in laboratorio. I metodi di multiplexing non genetici come l’hashing cellulare o l’hashing dei nuclei hanno aperto la porta a campioni multiplexati attraverso l’uso di anticorpi con codice a barre <sup class…

Materials

10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100 µM Barcode Solution	Request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
100% Ethanol	Millipore Sigma	E7023-500ML
100% Methanol	Millipore Sigma	322415-100ML
10x Chip Holder	10x Genomics	1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit	10x Genomics	PN-120263
15mL Centrifuge Tube	Quality Biological	P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer	Bel-Art	H13680-0040
50 µM Anchor Solution	Sigma or request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
50 µM Co-Anchor Solution	Sigma or request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
5200 Fragment Analyzer system	Agilent	M5310AA
70 um FlowMi cell strainer	Bel-Art	H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge	VWR	BK392302
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Chromium Next GEM Chip G	10x Genomics	PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H	10x Genomics	PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1	10x Genomics	PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000121
Digitonin	Fisher Scientific	BN2006
Dissection microscope	Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan	Tequipment	04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm	Agilent	A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath	Fisher Scientific	15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator	ThermoFisher Scientific	3110
Glycerol 50% Aqueous solution	Ricca Chemical Company	3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq	Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix	HiFi	7958927001
Low TE Buffer	Quality Biological	351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M	Sigma-Aldrich	M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes	Millipore Sigma	20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes	10x Genomics	NC1469069
MULTI-seq Primer	Sigma or IDT	See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge	Benchmark Scientific	C1008
Nonidet P40 Substitute	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free water	Fisher Scientific	AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes	Eppendorf
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
PBS pH 7.4 (1X)	Fisher Scientific	10010-023
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R	Eppendorf	2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2615
RPI primer	Sigma or IDT	See sequence list
Single Index Kit N, Set A	10x Genomics	PN-1000212
Single Index Kit T Set A	10x Genomics	PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M	Sigma-Aldrich	59222C
SPRIselect Reagent Kit	Beckman Coulter	B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip	USA Scientific	1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v)	Corning	25-900-CI
Universal I5 primer	Sigma or IDT	See sequence list
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystems	4375786
Vortex Mixer	VWR	10153-838