Multiplekset analyse av retinal genuttrykk og kromatin tilgjengelighet ved hjelp av scRNA-Seq og scATAC-Seq

Summary

Her viser forfatterne nytten av MULTI-seq for fenotyping og påfølgende parret scRNA-seq og scATAC-seq ved karakterisering av transkriptomiske og kromatin tilgjengelighetsprofiler i netthinnen.

Abstract

Kraftige neste generasjons sekvenseringsteknikker tilbyr robust og omfattende analyse for å undersøke hvordan retinale genregulerende nettverk fungerer under utvikling og i sykdomstilstander. Enkeltcellet RNA-sekvensering gjør det mulig for oss å profilere genuttrykksendringer observert i retinal utvikling og sykdom på mobilnivå, mens enkeltcellet ATAC-Seq tillater analyse av kromatintilgjengelighet og transkripsjonsfaktorbinding som skal profileres ved lignende oppløsning. Her beskrives bruken av disse teknikkene i den utviklende netthinnen, og MULTI-Seq demonstreres, hvor individuelle prøver er merket med et modifisert oligonukleotid-lipidkompleks, slik at forskere både kan øke omfanget av individuelle eksperimenter og redusere kostnadene betydelig.

Introduction

Å forstå hvordan gener kan påvirke celle skjebne spiller en nøkkelrolle i å undersøke prosesser som sykdom og embryonal progresjon. De komplekse forholdene mellom transkripsjonsfaktorer og deres målgener kan grupperes i genregulerende nettverk. Montering av bevis plasserer disse genregulerende nettverkene i sentrum av både sykdom og utvikling på tvers av evolusjonære linjer¹. Mens tidligere teknikker som qRT-PCR fokuserte på et enkelt gen eller sett med gener, tillater anvendelsen av sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning profilering av komplette cellulære transkriptomer.

RNA-seq gir et glimt inn i storskala transkriptomikk ^2,3. Enkeltcellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) gir etterforskere muligheten til ikke bare å profilere transkriptomer, men koble spesifikke celletyper med genuttrykksprofiler⁴. Dette oppnås bioinformatisk ved å mate individuelle celleprofiler inn i sorteringsalgoritmer ved hjelp av kjente genmarkører⁵. Multipleksing ved hjelp av lipidmerkede indekser sekvensering (MULTI-seq) gir enestående mangfold i antall scRNA-Seq profiler som kan samles⁶. Denne lipidbaserte teknikken skiller seg fra andre prøveindekseringsteknikker som celle-hashing som er avhengig av tilstedeværelsen av overflateantigener og antistoffer med høy affinitet i stedet for plasmamembranintegrasjon⁷. Ikke bare er det nå mulig å profilere genuttrykksprofiler i celletyper, men forskjellige eksperimenter kan kombineres til et enkelt sekvenseringsbibliotek, noe som dramatisk reduserer kostnadene for et individuelt scRNA-seq-eksperiment⁶. Kostnaden for scRNA-seq kan virke uoverkommelig for bruk i fenotypingseksperimenter der mange forskjellige genotyper, tilstander eller pasientprøver analyseres, men multipleksing tillater kombinasjon av opptil 96 prøver i et enkelt bibliotek⁶.

Profilering av genuttrykk via scRNA-seq har ikke vært den eneste sekvenseringsbaserte teknikken med høy gjennomstrømning for å revolusjonere den nåværende forståelsen av hvordan molekylære mekanismer dikterer celleskjebne. Mens forståelse av hvilke gentransskripter som er tilstede i en celle, gjør det mulig å identifisere celletype, er like viktig å forstå hvordan genomisk organisasjon regulerer utvikling og sykdomsprogresjon. Tidlige studier baserte seg på å oppdage DNase-mediert spaltning av sekvenser som ikke var bundet til histoner, etterfulgt av sekvensering av de resulterende DNA-fragmentene for å identifisere regioner med åpen kromatin. I motsetning til dette tillater enkeltcelleanalyse for transposontilgjengelig kromatinsekvensering (scATAC-seq) forskere å undersøke DNA med et domestisert transposon for lett å profilere åpent kromatin på enkeltnukleotidnivå⁸. Dette har gått gjennom en lignende skalering til scRNA-seq, og nå kan etterforskere identifisere individuelle celletyper og profilere fenotyper på tvers av tusenvis av individuelle genomer⁸.

Sammenkoblingen av scRNA-seq og scATAC-seq har gitt forskere muligheten til å profilere tusenvis av celler for å bestemme cellepopulasjoner, genomisk organisasjon og genregulerende nettverk i sykdomsmodeller og utviklingsprosesser 9,10,11,12. Her skisserer forfatterne hvordan man først kan bruke MULTI-seq til å kondensere fenotyping av et mylder av dyremodeller og bruke parret scRNA-seq og scATAC-seq for å få en bedre forståelse av kromatinlandskapet og regulatoriske nettverk i disse dyremodellene.

Protocol

Bruken av dyr til disse studiene ble utført ved hjelp av protokoller godkjent av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, i samsvar med ARRIVE-retningslinjene, og ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter. 1. Multi-seq Media forberedelse Klargjør og likevekt ovomucoidhemmer, 10 mg ovomucoidhemmer og 10 mg albumin per ml Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS), i 30 minutter før bruk13. Likevekt med 95% O<s…

Representative Results

Denne arbeidsflyten legger ut en strategi for undersøkelse av utviklingsfenotyper og regulatoriske prosesser ved hjelp av enkeltcellesekvensering. MULTI-seq prøvemultipleksing muliggjør en innledende lavkost fenotypingsanalyse, mens parret innsamling og fiksering av prøver for scRNA-seq og scATAC-seq gir mulighet for mer grundig undersøkelse (figur 1). MULTI-seq-strekkoding muliggjør kombinert sekvensering av flere prøver og deres påfølgende beregningsmes…

Discussion

Kraften til MULTI-seq stammer fra sømløs integrering av data fra flere eksperimentelle forhold eller modeller og den enorme fordelen når det gjelder kostnader og begrensende batcheffekter. Utnytte MULTI-seq tilbyr et laboratorium enestående fenotyping dybde. Ikke-genetiske multipleksingsmetoder som cellehasjing eller kjernehasjing åpnet døren for multipleksede prøver ved bruk av strekkodede antistoffer ^7,19,20. Dette er i…

Materials

10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100 µM Barcode Solution	Request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
100% Ethanol	Millipore Sigma	E7023-500ML
100% Methanol	Millipore Sigma	322415-100ML
10x Chip Holder	10x Genomics	1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit	10x Genomics	PN-120263
15mL Centrifuge Tube	Quality Biological	P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer	Bel-Art	H13680-0040
50 µM Anchor Solution	Sigma or request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
50 µM Co-Anchor Solution	Sigma or request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
5200 Fragment Analyzer system	Agilent	M5310AA
70 um FlowMi cell strainer	Bel-Art	H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge	VWR	BK392302
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Chromium Next GEM Chip G	10x Genomics	PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H	10x Genomics	PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1	10x Genomics	PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000121
Digitonin	Fisher Scientific	BN2006
Dissection microscope	Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan	Tequipment	04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm	Agilent	A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath	Fisher Scientific	15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator	ThermoFisher Scientific	3110
Glycerol 50% Aqueous solution	Ricca Chemical Company	3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq	Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix	HiFi	7958927001
Low TE Buffer	Quality Biological	351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M	Sigma-Aldrich	M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes	Millipore Sigma	20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes	10x Genomics	NC1469069
MULTI-seq Primer	Sigma or IDT	See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge	Benchmark Scientific	C1008
Nonidet P40 Substitute	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free water	Fisher Scientific	AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes	Eppendorf
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
PBS pH 7.4 (1X)	Fisher Scientific	10010-023
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R	Eppendorf	2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2615
RPI primer	Sigma or IDT	See sequence list
Single Index Kit N, Set A	10x Genomics	PN-1000212
Single Index Kit T Set A	10x Genomics	PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M	Sigma-Aldrich	59222C
SPRIselect Reagent Kit	Beckman Coulter	B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip	USA Scientific	1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v)	Corning	25-900-CI
Universal I5 primer	Sigma or IDT	See sequence list
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystems	4375786
Vortex Mixer	VWR	10153-838