Análise multiplexada da expressão genética da retina e acessibilidade da Chromatina usando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Summary

Aqui, os autores apresentam a utilidade de MULTI-seq para fenotipagem e posterior emparelhamento scRNA-seq e scATAC-seq na caracterização dos perfis de acessibilidade transcriptômica e cromatina na retina.

Abstract

Poderosas técnicas de sequenciamento de próxima geração oferecem análises robustas e abrangentes para investigar como as redes reguladoras de genes da retina funcionam durante o desenvolvimento e nos estados de doenças. O sequenciamento de RNA unicelular nos permite traçar alterações abrangentes de expressão genética observadas no desenvolvimento da retina e na doença a nível celular, enquanto o ATAC-Seq unicelular permite que a análise da acessibilidade e do fator de transcrição de cromatina sejam perfilada em resolução semelhante. Aqui, descreve-se o uso dessas técnicas na retina em desenvolvimento, e multi-Seq é demonstrado, onde amostras individuais são rotuladas com um complexo oligonucleotídeo-lipídio modificado, permitindo aos pesquisadores aumentar o escopo de experimentos individuais e reduzir substancialmente os custos.

Introduction

Entender como os genes podem influenciar o destino celular desempenha um papel fundamental na interrogação de processos como doenças e progressão embrionária. As complexas relações entre fatores de transcrição e seus genes-alvo podem ser agrupadas em redes reguladoras genéticas. A montagem de evidências coloca essas redes reguladoras genéticas no centro de doenças e desenvolvimento através das linhagens evolutivas¹. Embora técnicas anteriores como qRT-PCR se concentrem em um único gene ou conjunto de genes, a aplicação da tecnologia de sequenciamento de alto rendimento permite o perfil de transcriptomes celulares completos.

O RNA-seq oferece um vislumbre da transcriptômica em larga escala ^2,3. O sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) dá aos pesquisadores a capacidade de não apenas traçar transcrições de perfil, mas vincular tipos de células específicas com perfis^{de expressão genética 4}. Isso é conseguido bioinformática alimentando perfis de células individuais em algoritmos de classificação usando marcadores genéticos conhecidos⁵. O multiplexing usando sequenciamento de índices marcados por lipídios (MULTI-seq) oferece uma diversidade sem precedentes no número de perfis scRNA-Seq que podem ser coletados⁶. Esta técnica baseada em lipídio difere de outras técnicas de indexação de amostras, como o hashing celular que dependem da presença de antígenos superficiais e anticorpos de alta afinidade em vez da integração da membrana plasmática⁷. Não só agora é possível traçar perfis de expressão genética em tipos de células, mas diferentes experimentos podem ser combinados em uma única biblioteca de sequenciamento, reduzindo drasticamente o custo de um experimento individual de scRNA-seq⁶. O custo do scRNA-seq pode parecer proibitivo para uso em experimentos de fenotipos onde são analisados muitos genótipos, condições ou amostras de pacientes diferentes, mas o multiplexing permite a combinação de até 96 amostras em uma única biblioteca⁶.

O perfil da expressão genética via scRNA-seq não tem sido a única técnica baseada em sequenciamento de alto rendimento para revolucionar a compreensão atual de como os mecanismos moleculares ditam o destino celular. Embora entender quais transcrições genéticas estão presentes em uma célula permite a identificação do tipo celular, igualmente importante é entender como a organização genômica regula o desenvolvimento e a progressão da doença. Estudos iniciais se basearam na detecção de decote mediado por DNase de sequências não ligadas a histones, seguidos pelo sequenciamento dos fragmentos de DNA resultantes para identificar regiões de cromatina aberta. Em contraste, o ensaio celular único para sequenciamento de cromatina acessível transposon (scATAC-seq) permite que os pesquisadores testem DNA com um transposon domesticado para perfilar facilmente cromatina aberta no nível único de nucleotídeo⁸. Isso passou por um dimensionamento semelhante ao scRNA-seq e agora os pesquisadores podem identificar tipos de células individuais e perfis de fenótipos em milhares de genomas individuais⁸.

O emparelhamento de scRNA-seq e scATAC-seq permitiu aos pesquisadores a capacidade de perfilar milhares de células para determinar populações celulares, organização genômica e redes de regulação genética em modelos de doenças e processos de desenvolvimento 9,10,11,12. Aqui, os autores descrevem como primeiro utilizar multi-seq para condensar fenotipagem de uma miríade de modelos animais e empregar scRNA-seq e scATAC-seq emparelhados para obter uma melhor compreensão da paisagem e redes regulatórias de cromatina nesses modelos animais.

Protocol

O uso de animais para esses estudos foi realizado por meio de protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais johns Hopkins, em conformidade com as diretrizes do ARRIVE, e foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes. 1. MULTI-seq Preparação da mídia Prepare e equilibre o inibidor de ovomucoid, 10 mg de inibidor de ovomucoid e 10 mg de albumina por mL da Solução de Sal Balanceado (EBSS) de Earle, por 30 minutos a…

Representative Results

Este fluxo de trabalho estabelece uma estratégia de investigação de fenótipos de desenvolvimento e processos regulatórios usando sequenciamento de célula única. O multiplexing de amostra multi-seq permite um ensaio inicial de fenotipagem de baixo custo, enquanto a coleta e fixação emparelhadas de amostras para scRNA-seq e scATAC-seq permite uma investigação mais aprofundada (Figura 1). A codificação multi-seq permite o sequenciamento combinado de múl…

Discussion

O poder do MULTI-seq decorre da integração perfeita de dados de múltiplas condições experimentais ou modelos e do enorme benefício em termos de custo e limitação dos efeitos em lote. Utilizar multi-seq oferece um laboratório sem precedentes fenotipagem de profundidade. Métodos não genéticos de multiplexagem, como hashing celular ou hashing de núcleos, abriram a porta para amostras multiplexadas através do uso de anticorpos^com código de barras ^{7,19,20</su…}

Materials

10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100 µM Barcode Solution	Request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
100% Ethanol	Millipore Sigma	E7023-500ML
100% Methanol	Millipore Sigma	322415-100ML
10x Chip Holder	10x Genomics	1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit	10x Genomics	PN-120263
15mL Centrifuge Tube	Quality Biological	P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer	Bel-Art	H13680-0040
50 µM Anchor Solution	Sigma or request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
50 µM Co-Anchor Solution	Sigma or request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
5200 Fragment Analyzer system	Agilent	M5310AA
70 um FlowMi cell strainer	Bel-Art	H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge	VWR	BK392302
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Chromium Next GEM Chip G	10x Genomics	PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H	10x Genomics	PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1	10x Genomics	PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000121
Digitonin	Fisher Scientific	BN2006
Dissection microscope	Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan	Tequipment	04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm	Agilent	A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath	Fisher Scientific	15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator	ThermoFisher Scientific	3110
Glycerol 50% Aqueous solution	Ricca Chemical Company	3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq	Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix	HiFi	7958927001
Low TE Buffer	Quality Biological	351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M	Sigma-Aldrich	M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes	Millipore Sigma	20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes	10x Genomics	NC1469069
MULTI-seq Primer	Sigma or IDT	See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge	Benchmark Scientific	C1008
Nonidet P40 Substitute	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free water	Fisher Scientific	AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes	Eppendorf
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
PBS pH 7.4 (1X)	Fisher Scientific	10010-023
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R	Eppendorf	2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2615
RPI primer	Sigma or IDT	See sequence list
Single Index Kit N, Set A	10x Genomics	PN-1000212
Single Index Kit T Set A	10x Genomics	PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M	Sigma-Aldrich	59222C
SPRIselect Reagent Kit	Beckman Coulter	B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip	USA Scientific	1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v)	Corning	25-900-CI
Universal I5 primer	Sigma or IDT	See sequence list
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystems	4375786
Vortex Mixer	VWR	10153-838