Multiplexerad analys av retinal genuttryck och kromatintillgänglighet med hjälp av scRNA-Seq och scATAC-Seq

Summary

Här visar författarna nyttan av MULTI-seq för fenotypning och efterföljande parade scRNA-seq och scATAC-seq för att karakterisera de transkriptomiska och kromatin tillgänglighetsprofilerna i näthinnan.

Abstract

Kraftfulla nästa generations sekvenseringstekniker erbjuder robust och omfattande analys för att undersöka hur retinala genreglerande nätverk fungerar under utveckling och i sjukdomstillstånd. Encellig RNA-sekvensering gör det möjligt för oss att omfattande profilera genuttrycksförändringar som observerats i retinal utveckling och sjukdom på cellnivå, medan encellig ATAC-Seq gör det möjligt att analysera kromatintillgänglighet och transkriptionsfaktorbindning för att profileras med liknande upplösning. Här beskrivs användningen av dessa tekniker i den utvecklande näthinnan, och MULTI-Seq demonstreras, där enskilda prover är märkta med ett modifierat oligonukleotid-lipidkomplex, vilket gör det möjligt för forskare att både öka omfattningen av enskilda experiment och avsevärt minska kostnaderna.

Introduction

Att förstå hur gener kan påverka cellöden spelar en nyckelroll i förhörsprocesser som sjukdom och embryonal progression. De komplexa sambanden mellan transkriptionsfaktorer och deras målgener kan grupperas i genreglerande nätverk. Ökande bevis placerar dessa genreglerande nätverk i centrum för både sjukdom och utveckling över evolutionära linjer¹. Medan tidigare tekniker som qRT-PCR fokuserade på en enda gen eller uppsättning gener, möjliggör tillämpningen av sekvenseringsteknik med hög genomströmning profilering av kompletta cellulära transkriptom.

RNA-seq ger en inblick i storskalig transkriptomik ^2,3. Encellig RNA-sekvensering (scRNA-seq) ger utredare möjlighet att inte bara profilera transkriptom utan länka specifika celltyper med genuttrycksprofiler⁴. Detta uppnås bioinformatiskt genom att mata in enskilda cellprofiler i sorteringsalgoritmer med hjälp av kända genmarkörer⁵. Multiplexering med lipidtaggad indexsekvensering (MULTI-seq) erbjuder oöverträffad mångfald i antalet scRNA-Seq-profiler som kan samlas in⁶. Denna lipidbaserade teknik skiljer sig från andra provindexeringstekniker såsom cellhashing som förlitar sig på närvaron av ytantigener och antikroppar med hög affinitet istället för plasmamembranintegration⁷. Det är nu inte bara möjligt att profilera genuttrycksprofiler i celltyper utan olika experiment kan kombineras till ett enda sekvenseringsbibliotek, vilket dramatiskt sänker kostnaden för ett individuellt scRNA-seq-experiment⁶. Kostnaden för scRNA-seq kan verka oöverkomlig för användning i fenotypningsexperiment där många olika genotyper, tillstånd eller patientprover analyseras, men multiplexering möjliggör kombination av upp till 96 prover i ett enda bibliotek⁶.

Profilering av genuttryck via scRNA-seq har inte varit den enda sekvenseringsbaserade tekniken med hög genomströmning som revolutionerar den nuvarande förståelsen av hur molekylära mekanismer dikterar cellens öde. Medan förståelse av vilka genutskrifter som finns i en cell möjliggör identifiering av celltyp, är det lika viktigt att förstå hur genomisk organisation reglerar utveckling och sjukdomsprogression. Tidiga studier förlitade sig på att detektera DNase-medierad klyvning av sekvenser som inte är bundna till histoner, följt av sekvensering av de resulterande DNA-fragmenten för att identifiera regioner av öppet kromatin. Däremot tillåter encellsanalys för transposontillgänglig kromatinsekvensering (scATAC-seq) forskare att undersöka DNA med en domesticerad transposon för att enkelt profilera öppet kromatin vid den enda nukleotidnivån⁸. Detta har gått igenom en liknande skalning som scRNA-seq och nu kan utredare identifiera enskilda celltyper och profilfenotyper över tusentals enskilda genom⁸.

Parningen av scRNA-seq och scATAC-seq har gjort det möjligt för forskare att profilera tusentals celler för att bestämma cellpopulationer, genomisk organisation och genreglerande nätverk i sjukdomsmodeller och utvecklingsprocesser 9,10,11,12. Här beskriver författarna hur man först kan använda MULTI-seq för att kondensera fenotypning av en myriad av djurmodeller och använda parade scRNA-seq och scATAC-seq för att få en bättre förståelse för kromatinlandskapet och reglerande nätverk i dessa djurmodeller.

Protocol

Användningen av djur för dessa studier genomfördes med hjälp av protokoll som godkänts av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, i enlighet med ARRIVE-riktlinjerna, och utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter. 1. FLERA seq Förberedelse av media Förbered och balansera ovomucoidhämmare, 10 mg ovomucoidhämmare och 10 mg albumin per ml Earles balanserade saltlösning (EBSS), i 30 minuter före användning1…

Representative Results

Detta arbetsflöde innehåller en strategi för undersökning av utvecklingsfenotyper och regleringsprocesser med hjälp av encellssekvensering. MULTI-seq-provmultiplexering möjliggör en initial lågkostnads fenotypningsanalys medan parad insamling och fixering av prover för scRNA-seq och scATAC-seq möjliggör mer djupgående undersökning (figur 1). MULTI-seq-streckkodning möjliggör kombinerad sekvensering av flera prover och deras efterföljande beräkning…

Discussion

Kraften i MULTI-seq härrör från sömlös integration av data från flera experimentella förhållanden eller modeller och den enorma fördelen när det gäller kostnad och begränsande batcheffekter. Att använda MULTI-seq erbjuder ett laboratorium utan motstycke fenotypningsdjup. Icke-genetiska multiplexeringsmetoder som cellhashing eller kärnhashing öppnade dörren för multiplexerade prover genom användning av streckkodade antikroppar ^7,19,20<…

Materials

10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100 µM Barcode Solution	Request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
100% Ethanol	Millipore Sigma	E7023-500ML
100% Methanol	Millipore Sigma	322415-100ML
10x Chip Holder	10x Genomics	1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit	10x Genomics	PN-120263
15mL Centrifuge Tube	Quality Biological	P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer	Bel-Art	H13680-0040
50 µM Anchor Solution	Sigma or request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
50 µM Co-Anchor Solution	Sigma or request from Gartner lab	https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true
5200 Fragment Analyzer system	Agilent	M5310AA
70 um FlowMi cell strainer	Bel-Art	H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge	VWR	BK392302
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Chromium Next GEM Chip G	10x Genomics	PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H	10x Genomics	PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1	10x Genomics	PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000121
Digitonin	Fisher Scientific	BN2006
Dissection microscope	Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan	Tequipment	04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm	Agilent	A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath	Fisher Scientific	15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator	ThermoFisher Scientific	3110
Glycerol 50% Aqueous solution	Ricca Chemical Company	3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq	Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix	HiFi	7958927001
Low TE Buffer	Quality Biological	351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M	Sigma-Aldrich	M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes	Millipore Sigma	20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes	10x Genomics	NC1469069
MULTI-seq Primer	Sigma or IDT	See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge	Benchmark Scientific	C1008
Nonidet P40 Substitute	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free water	Fisher Scientific	AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes	Eppendorf
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
PBS pH 7.4 (1X)	Fisher Scientific	10010-023
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R	Eppendorf	2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2615
RPI primer	Sigma or IDT	See sequence list
Single Index Kit N, Set A	10x Genomics	PN-1000212
Single Index Kit T Set A	10x Genomics	PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M	Sigma-Aldrich	59222C
SPRIselect Reagent Kit	Beckman Coulter	B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip	USA Scientific	1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v)	Corning	25-900-CI
Universal I5 primer	Sigma or IDT	See sequence list
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystems	4375786
Vortex Mixer	VWR	10153-838