scRNA-Seq ve scATAC-Seq Kullanarak Retinal Gen Ekspresyonu ve Kromatin Erişilebilirliğinin Multipleks Analizi
Summary
Burada, yazarlar fenotipleme için MULTI-seq’in ve daha sonra retinadaki transkriptomik ve kromatin erişilebilirlik profillerini karakterize etmede eşleştirilmiş scRNA-seq ve scATAC-seq’in faydasını göstermektedir.
Abstract
Güçlü yeni nesil dizileme teknikleri, retinal gen düzenleyici ağların gelişim sırasında ve hastalık durumlarında nasıl çalıştığını araştırmak için sağlam ve kapsamlı analizler sunar. Tek hücreli RNA dizilimi, retina gelişiminde ve hastalığında gözlenen gen ekspresyon değişikliklerini hücresel düzeyde kapsamlı bir şekilde profillememize izin verirken, tek hücreli ATAC-Seq, kromatin erişilebilirliğinin ve transkripsiyon faktörü bağlanmasının analizinin benzer çözünürlükte profillenmesini sağlar. Burada, bu tekniklerin gelişmekte olan retinada kullanımı tanımlanmıştır ve bireysel örneklerin modifiye edilmiş bir oligonükleotid-lipit kompleksi ile etiketlendiği ve araştırmacıların hem bireysel deneylerin kapsamını artırmalarını hem de maliyetleri önemli ölçüde azaltmalarını sağlayan MULTI-Seq gösterilmiştir.
Introduction
Genlerin hücre kaderini nasıl etkileyebileceğini anlamak, hastalık ve embriyonik progresyon gibi süreçleri sorgulamada önemli bir rol oynar. Transkripsiyon faktörleri ve hedef genleri arasındaki karmaşık ilişkiler, gen düzenleyici ağlarda gruplandırılabilir. Artan kanıtlar, bu gen düzenleyici ağları, evrimsel soylar boyunca hem hastalığın hem de gelişimin merkezine yerleştirir1. qRT-PCR gibi önceki teknikler tek bir gen veya gen kümesine odaklanırken, yüksek verimli dizileme teknolojisinin uygulanması, tam hücresel transkriptomların profillenmesine izin verir.
RNA-seq, büyük ölçekli transkriptomik 2,3’e bir bakış sunar. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), araştırmacılara sadece transkriptomların profilini çıkarma değil, aynı zamanda spesifik hücre tiplerini gen ekspresyon profilleri ile bağlama yeteneği verir4. Bu, bilinen gen belirteçleri5 kullanılarak bireysel hücre profillerinin sıralama algoritmalarına beslenmesiyle biyoinformatik olarak elde edilir. Lipid etiketli indeks dizilimi (MULTI-seq) kullanılarak çoklama, toplanabilen scRNA-Seq profillerinin sayısında benzeri görülmemiş bir çeşitlilik sunar6. Bu lipit bazlı teknik, plazma membran entegrasyonu7 yerine yüzey antijenlerinin ve yüksek afiniteli antikorların varlığına dayanan hücre karması gibi diğer numune indeksleme tekniklerinden farklıdır. Artık sadece gen ekspresyon profillerini hücre tiplerine profillemek mümkün değil, aynı zamanda farklı deneyler tek bir dizileme kütüphanesinde birleştirilebilir ve bu da bireysel bir scRNA-seq deneyinin maliyetini önemli ölçüde düşürür6. ScRNA-seq’in maliyeti, birçok farklı genotipin, durumun veya hasta örneğinin analiz edildiği fenotipleme deneylerinde kullanım için yasaklayıcı görünebilir, ancak çoklama, tek bir kütüphanede 96’ya kadar numunenin kombinasyonuna izin verir6.
ScRNA-seq yoluyla gen ekspresyonunun profillenmesi, moleküler mekanizmaların hücre kaderini nasıl belirlediğine dair mevcut anlayışta devrim yaratan tek yüksek verimli dizileme tabanlı teknik olmamıştır. Bir hücrede hangi gen transkriptlerinin bulunduğunu anlamak, hücre tipinin tanımlanmasını sağlarken, aynı derecede önemli olan, genomik organizasyonun gelişimi ve hastalığın ilerlemesini nasıl düzenlediğini anlamaktır. Erken çalışmalar, histonlara bağlı olmayan dizilerin DNaz aracılı bölünmesini tespit etmeye, ardından açık kromatin bölgelerini tanımlamak için ortaya çıkan DNA fragmanlarının dizilenmesine dayanıyordu. Buna karşılık, transpozon erişilebilir kromatin dizilimi (scATAC-seq) için tek hücreli tahlil, araştırmacıların tek nükleotid seviyesi8’de açık kromatinin profilini kolayca çıkarmak için evcilleştirilmiş bir transpozon ile DNA’yı araştırmalarını sağlar. Bu, scRNA-seq’e benzer bir ölçeklemeden geçti ve şimdi araştırmacılar binlerce bireysel genomda bireysel hücre tiplerini tanımlayabilir ve fenotiplerin profilini çıkarabilir8.
ScRNA-seq ve scATAC-seq eşleşmesi, araştırmacıların hastalık modellerinde ve gelişimsel süreçlerde hücre popülasyonlarını, genomik organizasyonu ve gen düzenleyici ağları belirlemek için binlerce hücrenin profilini çıkarma yeteneğini sağlamıştır 9,10,11,12. Burada yazarlar, sayısız hayvan modelinin fenotiplemesini yoğunlaştırmak için ilk önce MULTI-seq’in nasıl kullanılacağını ve bu hayvan modellerindeki kromatin manzarasını ve düzenleyici ağları daha iyi anlamak için eşleştirilmiş scRNA-seq ve scATAC-seq’i nasıl kullanacaklarını özetlemektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
MULTI-seq’in gücü, birden fazla deneysel koşuldan veya modelden gelen verilerin sorunsuz entegrasyonundan ve maliyet ve parti etkilerini sınırlama açısından muazzam faydadan kaynaklanmaktadır. MULTI-seq’in kullanılması, laboratuvara benzeri görülmemiş bir fenotipleme derinliği sunar. Hücre karması veya çekirdek karması gibi genetik olmayan çoklama yöntemleri, barkodlu antikorların kullanımı yoluyla çoklanmış örneklere kapı açtı 7,19,20</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Johns Hopkins Transkriptomik ve Derin Sıralama Çekirdeği’nden Linda Orzolek’e, üretilen kütüphanelerin sıralanmasına yardımcı olduğu için ve Lizhi Jiang’a ex vivo retinal eksplantları gerçekleştirdiği için teşekkür ederiz.
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Riferimenti
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
- Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
- Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
- Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
- Worthington Biochemical Corporation. . Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
- Agilent. . DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
- ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
- Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
- Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
- Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
- Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
- Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
- METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
- Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).
