Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines speziellen intravenösen Katalysators, eines standardisierten sterilen Einwegschlauchs, einer Temperaturregelung, die durch Echtzeitüberwachung ergänzt wird, und eines Alarmsystems für ein zweistufiges Kollagenase-Perfusionsverfahren, um die Konsistenz der Lebensfähigkeit, Ausbeute und Funktionalität isolierter primärer Rattenhepatozyten zu verbessern.
Abstract
Primäre Hepatozyten werden häufig in der Grundlagenforschung zu Lebererkrankungen und für Toxizitätstests in vitro eingesetzt. Das zweistufige Kollagenase-Perfusionsverfahren zur primären Hepatozytenisolierung ist technisch anspruchsvoll, insbesondere bei der Pfortaderkanülierung. Das Verfahren ist auch anfällig für gelegentliche Kontaminationen und Variationen der Perfusionsbedingungen aufgrund von Schwierigkeiten bei der Montage, Optimierung oder Wartung des Perfusionsaufbaus. Hier wird ein detailliertes Protokoll für ein verbessertes zweistufiges Kollagenase-Perfusionsverfahren mit Multiparameter-Perfusionskontrolle vorgestellt. Primäre Rattenhepatozyten wurden erfolgreich und zuverlässig isoliert, indem die notwendigen technischen Vorsichtsmaßnahmen in kritischen Schritten des Verfahrens getroffen und die Betriebsschwierigkeiten verringert und die Variabilität der Perfusionsparameter durch die Einführung eines speziellen intravenösen Katheters, standardisierter steriler Einwegschläuche, Temperaturregelung sowie Echtzeit-Überwachungs- und Alarmsystem gemildert wurden. Die isolierten primären Rattenhepatozyten weisen durchweg eine hohe Zelllebensfähigkeit (85%-95%), Ausbeute (2-5 x 108 Zellen pro 200-300 g Ratte) und Funktionalität (Albumin-, Harnstoff- und CYP-Aktivität) auf. Ergänzt wurde das Verfahren durch ein integriertes Perfusionssystem, das kompakt genug ist, um in der Laminar-Flow-Haube aufgestellt zu werden, um einen aseptischen Betrieb zu gewährleisten.
Introduction
Primäre Hepatozyten sind wichtige Werkzeuge für die leberbezogene Grundlagenforschung, Krankheitsbehandlung und -anwendung wie Drogentests. Der aktuelle Goldstandard für die primäre Hepatozytenisolierung ist das zweistufige Kollagenase-Perfusionsverfahren1,2,3, das von Seglen in den 1970er Jahreneingeführt wurde 4. Dieses Verfahren ist jedoch technisch anspruchsvoll und hat eine hohe Ausfallrate, wenn es von unerfahrenen Chirurgen durchgeführt wird. Selbst wenn eine Perfusion als erfolgreich angesehen wird, können drastische Unterschiede in der Lebensfähigkeit der Hepatozyten (typischerweise 60%-95%) und Ausbeute (0,5-5 x 108 pro 200-300 g Ratte) zwischen den Isolationen beobachtet werden. Dies beeinflusst die Qualität und den Umfang nachgelagerter Experimente. Abgesehen von der technischen Vorgehensweise ist der für die Isolierung verwendete Perfusionsaufbau, entweder kommerziell erhältlich oder kundenspezifisch, ein beitragender Faktor. Der Montage, Optimierung und Wartung des Perfusionsaufbaus muss Aufmerksamkeit geschenkt werden. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Erfolgsrate und Stabilität zwischen den Isolierungen primärer Rattenhepatozyten durch Multiparameter-Perfusionskontrolle des technischen Verfahrens und Perfusionsaufbau des zweistufigen Kollagenase-Perfusionsverfahrens zu verbessern.
Aus technischer Sicht ist der schwierigste Schritt im Verfahren die Pfortadervernarbung. Was die anderen Schritte betrifft, so kann die Stabilität der Isolierung verbessert werden, wenn bewährte Verfahren beachtet und allgemeine Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Daher ist es wichtig, die Argumentation für jeden Schritt zu verstehen, damit der Chirurg auf verschiedene Variablen reagieren kann, die während des Eingriffs auftreten können.
Verschiedene Protokolle zur Isolierung von Hepatozyten und nicht-parenchymalen Leberzellen aus Ratte und Maus wurden veröffentlicht 1,2,5,6,7,8,9. Die in diesen Protokollen verwendeten Perfusionsaufbauten hatten mehrere Nachteile, darunter die Wiederverwendung von Perfusionsschläuchen, Probleme bei der Temperaturregelung, die Notwendigkeit einer routinemäßigen Optimierung der Perfusionsparameter und / oder die Verwendung eines ungeeigneten Typs von intravenösem (IV) Katheter für die Pfortaderkanülierung. Die Wiederverwendung von Perfusionsschläuchen erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination, insbesondere wenn der Schlauch nicht ordnungsgemäß gereinigt und desinfiziert wurde. Die Wiederverwendung von Schläuchen ohne routinemäßigen Austausch setzt das Perfusionssetup auch Problemen wie undichten Schläuchen oder Anschlüssen, verstopften Blasenfallen und verengten Schläuchen aus, die den Perfusatdruck und die Durchflussrate erheblich reduzieren und somit die Effizienz der Leberverdauung beeinträchtigen. Ohne eine konstante Wärmequelle in einigen Setups zur Temperaturregelung kühlen vorgewärmte Puffer im Laufe der Zeit ab, was zu einer geringen Kollagenaseaktivität und Verdauung führt. Obwohl andere Setups einen ummantelten Glaskondensator verwenden, der an einen Wasserthermostat angeschlossen ist, um den Puffer zu erwärmen, sind sie sperrig und erfordern eine sorgfältige Reinigung. Temperatur, Druck und Durchflussrate des Puffers, der den Katheter verlässt, müssen vor Beginn der Isolierung gemessen und optimiert werden, um einen stabilen Perfusionszustand zu gewährleisten. Selbst nach der Optimierung könnten sich die Parameter während der Isolierung aufgrund der Aktionen des Bedieners noch halbwegs ändern, was zu einer suboptimalen Perfusion und Verdauung führt. Die meisten Arten von IV-Kathetern sind nicht für die Pfortaderverhornung geeignet, da sie während der Kanülierung keine kontinuierliche Perfusion ermöglichen. Sie sind nicht in der Lage, den Chirurgen sofort zu informieren, wenn die Kanülierung erfolgreich ist. Darüber hinaus ist es eine Herausforderung, die Pfortader am weichen Katheter zu befestigen, ohne ihn zu verformen.
Hier adressieren wir diese Probleme mit standardisierten sterilen Einwegschläuchen, einem Silikonheizmantel für eine präzise und stabile Temperaturregelung, Echtzeit-Überwachungs- und Alarmsystem mit Datenspeicherung und -verwaltung sowie der Verwendung eines speziellen IV-Katheters, der eine kontinuierliche Durchblutung während der Punktion der Pfortader während der Kanülierung ermöglicht. Nach unserem besten Wissen sind wir die erste Gruppe, die all diese Eigenschaften in einem integrierten Perfusionssystem (IPS) kombiniert, das kompakt ist, es sehr portabel macht und in eine laminare Durchflusshaube passt, um einen aseptischen Betrieb zu gewährleisten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt einige Punkte, die für das zweistufige Kollagenase-Perfusionsverfahren im Allgemeinen besonders wichtig sind. Erstens muss bei der Resezierung der Leber besondere Vorsicht geboten werden. Stellen Sie sicher, dass der Magen-Darm-Trakt nicht beschädigt wird, da das Austreten des Inhalts zu einer bakteriellen Kontamination führt. Vermeiden Sie außerdem eine Beschädigung der Glisson-Kapsel, die während des Tiereingriffs die Oberfläche der Leber bedeckt. Wenn der Riss groß genug ist, kann dies eine vorzeitige …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird zum Teil von MOE ARC (MOE2017-T2-1-149) unterstützt; NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mechanobiology Institute of Singapore (R-714-106-004-135); und Institute of Bioengineering and Nanotechnology, Biomedical Research Council, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Projektnummern IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 und MedCaP-LOA-18-02) an Hanry Yu. Ng Chan Way ist wissenschaftlicher Mitarbeiter der National University of Singapore. Wir danken der Confocal Microscopy Unit & Flow Cytometry Unit der National University of Singapore für die Hilfe und Beratung bei der Hepatozytenreinheitsanalyse.
Materials
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
Riferimenti
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