בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית
Summary
פרוטוקול זה מפרט את השימוש בצנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה בתוספת ניטור בזמן אמת, ומערכת אזעקה להליך זלוף קולגןאז דו-שלבי כדי לשפר את העקביות בכדאיות, בתפוקה ובפונקציונליות של הפטוציטים של חולדה ראשונית מבודדת.
Abstract
הפטוציטים ראשוניים נמצאים בשימוש נרחב במחקר בסיסי על מחלות כבד ועל בדיקות רעילות במבחנה. הליך זלוף הקולגאז הדו-שלבי לבידוד הפטוציטים ראשוני הוא מאתגר מבחינה טכנית, במיוחד בתותח ורידים פורטליים. ההליך גם נוטה לזיהום מזדמן ולשינויים בתנאי הזלוף עקב קשיים בהרכבה, אופטימיזציה או תחזוקה של מערך הזלוף. כאן מוצג פרוטוקול מפורט להליך משופר של פיזור קולגן בשני שלבים עם בקרת זלוף מולטיפארמטר. הפטוציטים ראשוניים של חולדות בודדו בהצלחה ובאמינות על ידי נקיטת אמצעי הזהירות הטכניים הדרושים בשלבים קריטיים של ההליך, ועל ידי הפחתת הקושי התפעולי והפחתת השונות של פרמטרי הזלוף באמצעות אימוץ צנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה ומערכת ניטור ואזעקה בזמן אמת. הפטוציטים של החולדה הראשונית המבודדת מפגינים באופן עקבי כדאיות גבוהה של התאים (85%-95%), תפוקה (2-5 x 108 תאים לכל חולדה של 200-300 גרם) ופונקציונליות (פעילות אלבומין, אוריאה ו-CYP). ההליך הושלם על ידי מערכת פרפוזיה משולבת, שהיא קומפקטית מספיק כדי להיות מוגדרת במכסה הזרימה הלמינרי כדי להבטיח פעולה אספטית.
Introduction
הפטוציטים ראשוניים הם כלים חשובים למחקר בסיסי הקשור לכבד, לטיפול במחלות וליישום כגון בדיקות תרופות. תקן הזהב הנוכחי לבידוד הפטוציטים ראשוני הוא הליך פיזור הקולג’נאז הדו-שלבי 1,2,3 שהוצג על ידי Seglen בשנות ה-704. עם זאת, הליך זה הוא מאתגר מבחינה טכנית ויש לו שיעור כישלון גבוה כאשר הוא מבוצע על ידי מנתחים מתחילים. גם כאשר פרפוזיה נחשבת מוצלחת, ניתן להבחין בהבדלים דרסטיים בכדאיות הפטוציטים (בדרך כלל 60%-95%) ובתפוקה (0.5-5 x 108 לכל 200-300 גרם חולדה) בין בידודים. זה משפיע על האיכות וההיקף של ניסויים במורד הזרם. מלבד ההליך הטכני, מערך הזלוף המשמש לבידוד, זמין מסחרית או בנוי בהתאמה אישית, הוא גורם תורם. יש לתת תשומת לב להרכבה, אופטימיזציה ותחזוקה של הגדרת הזלוף. מטרת פרוטוקול זה היא לשפר את שיעור ההצלחה והיציבות בין בידודים של הפטוציטים ראשוניים של חולדה באמצעות בקרת פרפוזיה מרובת-פרמטרים של ההליך הטכני והתקנת זלוף של הליך פיזור קולגןאז דו-שלבי.
מההיבט הטכני, השלב הקשה ביותר בהליך הוא תותח ורידי הפורטל. באשר לצעדים האחרים, אם נצפה תרגול טוב וננקטים אמצעי זהירות כלליים, ניתן לשפר את יציבות הבידוד. לכן, הבנת ההנמקה לכל שלב חשובה כדי שהמנתח יוכל להגיב למשתנים שונים שעלולים להתרחש במהלך ההליך.
פרוטוקולים שונים לבידוד של הפטוציטים ותאים שאינם פרנכימליים בכבד מחולדה ועכבר פורסמו 1,2,5,6,7,8,9. להגדרות הזלוף ששימשו בפרוטוקולים אלה היו מספר חסרונות, הכוללים שימוש חוזר בצינורות פרפוזיה, בעיות בבקרת טמפרטורה, צורך באופטימיזציה שגרתית של פרמטרי פרפוזיה ו/או שימוש בסוג לא מתאים של צנתר תוך ורידי (IV) עבור תותח ורידי פורטלי. שימוש חוזר בצינורות זלעפות יגדיל את הסיכוי לזיהום, במיוחד אם הצינורות לא נוקו וחוטאו כראוי. שימוש חוזר בצינורות ללא החלפה שגרתית יחשוף גם את מערך הזלוף לבעיות כגון צינורות או מחברים דולפים, מלכודת בועות סתומה וצינורות מכווצים, כל אלה יפחיתו באופן משמעותי את הלחץ וקצב הזרימה של התפשטות, ובכך ישפיעו על יעילות העיכול בכבד. ללא מקור חום קבוע בתצורות מסוימות לבקרת טמפרטורה, מאגרים שחוממו מראש יתקררו עם הזמן, מה שיוביל לפעילות ועיכול נמוכים של קולגן. אף על פי שתצורות אחרות משתמשות במעבה זכוכית מעיל המחובר למפיץ מים כדי לחמם את החיץ, הן מגושמות ודורשות ניקוי קפדני. יש למדוד ולייעל את הטמפרטורה, הלחץ וקצב הזרימה של החיץ היוצא מהקטטר לפני תחילת הבידוד כדי להבטיח מצב זלוף יציב. גם לאחר האופטימיזציה, הפרמטרים עדיין יכולים להשתנות באמצע הדרך במהלך הבידוד עקב פעולות המפעיל, ובכך להוביל לזלוף ועיכול לא אופטימליים. רוב הסוגים של קטטר IV אינם מתאימים לקנלולציה של ורידים בפורטל מכיוון שהם אינם מאפשרים זלוף רציף במהלך תותח. הם אינם מסוגלים להודיע מיד למנתח כאשר התותח מצליח. יתר על כן, זה מאתגר לאבטח את וריד הפורטל על הצנתר הרך מבלי לעוות אותו.
כאן אנו מטפלים בבעיות אלה באמצעות צינורות סטריליים חד פעמיים סטנדרטיים, ז’קט מחמם סיליקון לבקרת טמפרטורה מדויקת ויציבה, מערכת ניטור ואזעקה בזמן אמת עם אחסון וניהול נתונים ושימוש בצנתר IV מיוחד, המאפשר זלוף רציף תוך ניקוב וריד הפורטל במהלך התותח. למיטב ידיעתנו, אנו הקבוצה הראשונה המשלבת את כל התכונות הללו למערכת פרפוזיה משולבת (IPS) קומפקטית, מה שהופך אותה לניידת מאוד ומסוגלת להתאים למכסה מנוע זרימה למינרי כדי להבטיח פעולה אספטית.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנן מספר נקודות שחשוב במיוחד לבחון עבור הליך זלוף קולגן דו-שלבי באופן כללי. ראשית, יש לתת טיפול מיוחד בעת כריתת הכבד. יש לוודא כי מערכת העיכול אינה ניזוקה שכן דליפה של התוכן תגרום לזיהום חיידקי. בנוסף, הימנעו מפגיעה בקפסולת גליסון, המכסה את פני השטח של הכבד במהלך ההליך החייתי. אם הקרע גדול מ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); מענק זרעי חדשנות של NUHS 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); המכון למכנוביולוגיה של סינגפור (R-714-106-004-135); והמכון לביו-הנדסה וננו-טכנולוגיה, המועצה למחקר ביו-רפואי, הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר (A*STAR) (מספרי פרויקטים IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 ו-MedCaP-LOA-18-02) מימון להנרי יו. נג צ’אן וויי הוא חוקר של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור. ברצוננו להודות ליחידת המיקרוסקופיה הקונפוקלית וליחידת הציטומטריה של זרימה של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור על עזרה וייעוץ בניתוח טוהר הפטוציטים.
Materials
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
Riferimenti
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).
