Выделение первичных гепатоцитов крыс с помощью многопараметрического перфузионного контроля
Summary
Этот протокол подробно описывает использование специального внутривенного катетера, стандартизированной стерильной одноразовой трубки, контроля температуры, дополненного мониторингом в режиме реального времени, и системы сигнализации для двухэтапной процедуры перфузии коллагеназы для улучшения согласованности жизнеспособности, выхода и функциональности изолированных первичных гепатоцитов крыс.
Abstract
Первичные гепатоциты широко используются в фундаментальных исследованиях заболеваний печени и для тестирования токсичности in vitro. Двухэтапная процедура перфузии коллагеназы для первичной изоляции гепатоцитов технически сложна, особенно при канюляции воротных вен. Процедура также подвержена случайным загрязнениям и изменениям условий перфузии из-за трудностей в сборке, оптимизации или обслуживании перфузионной установки. Здесь представлен подробный протокол улучшенной двухэтапной процедуры перфузии коллагеназы с многопараметрическим перфузионным контролем. Первичные гепатоциты крыс были успешно и надежно выделены путем принятия необходимых технических мер предосторожности на критических этапах процедуры, а также путем снижения эксплуатационных трудностей и смягчения изменчивости параметров перфузии путем принятия специального внутривенного катетера, стандартизированной стерильной одноразовой трубки, контроля температуры, а также системы мониторинга и сигнализации в режиме реального времени. Изолированные первичные гепатоциты крысы последовательно демонстрируют высокую жизнеспособность клеток (85%-95%), выход (2-5 х 108 клеток на 200-300 г крысы) и функциональность (альбумин, мочевина и активность CYP). Процедура была дополнена интегрированной перфузионной системой, которая достаточно компактна, чтобы быть установленной в ламинарной вытяжке для обеспечения асептической работы.
Introduction
Первичные гепатоциты являются важными инструментами для фундаментальных исследований, связанных с печенью, лечения заболеваний и применения, таких как тестирование на наркотики. В настоящее время золотым стандартом первичной изоляции гепатоцитов является двухэтапная процедура перфузии коллагеназы 1,2,3, введенная Сегленом в 1970-хгодах 4. Тем не менее, эта процедура является технически сложной и имеет высокий уровень неудач при выполнении начинающими хирургами. Даже когда перфузия считается успешной, между выделениями могут наблюдаться резкие различия в жизнеспособности гепатоцитов (обычно 60-95%) и выходе (0,5-5 х 108 на 200-300 г крысы). Это влияет на качество и масштаб последующих экспериментов. Помимо технической процедуры, перфузионная установка, используемая для изоляции, либо коммерчески доступная, либо изготовленная на заказ, является способствующим фактором. Необходимо уделить внимание сборке, оптимизации и обслуживанию перфузионной установки. Целью данного протокола является повышение успешности и стабильности между выделениями первичных гепатоцитов крыс посредством многопараметрического перфузионного контроля технической процедуры и перфузионной установки двухэтапной процедуры перфузии коллагеназы.
С технической точки зрения самым сложным этапом процедуры является канюляция воротной вены. Что касается других шагов, то при соблюдении надлежащей практики и принятии общих мер предосторожности стабильность изоляции может быть улучшена. Поэтому понимание причин для каждого шага важно, чтобы хирург мог реагировать на различные переменные, которые могут возникнуть во время процедуры.
Различные протоколы выделения гепатоцитов и непаренхиматозных клеток печени у крыс и мышей были опубликованы 1,2,5,6,7,8,9. Перфузионные установки, используемые в этих протоколах, имели несколько недостатков, которые включают повторное использование перфузионных трубок, проблемы с контролем температуры, необходимость рутинной оптимизации параметров перфузии и / или использование неподходящего типа внутривенного (IV) катетера для канюляции портальных вен. Повторное использование перфузионных трубок увеличит вероятность загрязнения, особенно если трубки не были очищены и продезинфицированы должным образом. Повторное использование трубок без рутинной замены также подвергнет перфузионную установку таким проблемам, как протекающие трубки или соединители, засорение пузырьковой ловушки и суженные трубки, все из которых значительно снизят давление перфусата и скорость потока, тем самым влияя на эффективность пищеварения печени. Без постоянного источника тепла в некоторых установках для контроля температуры предварительно нагретые буферы со временем будут охлаждаться, что приводит к низкой активности коллагеназы и пищеварению. Хотя в других установках используется стеклянный конденсатор с рубашкой, подключенный к циркуляции воды для нагрева буфера, они громоздкие и требуют тщательной очистки. Температура, давление и расход буфера, выходящего из катетера, должны быть измерены и оптимизированы до начала изоляции, чтобы обеспечить стабильное состояние перфузии. Даже после оптимизации параметры все равно могли меняться на полпути во время изоляции из-за действий оператора, что приводило к неоптимальной перфузии и пищеварению. Большинство типов внутривенных катетеров не подходят для канюляции воротных вен, поскольку не допускают непрерывной перфузии во время канюляции. Они не могут немедленно сообщить хирургу, когда канюляция успешна. Кроме того, трудно закрепить воротную вену на мягком катетере, не деформируя ее.
Здесь мы решаем эти проблемы с помощью стандартизированной одноразовой стерильной трубки, силиконовой рубашки нагревателя для точного и стабильного контроля температуры, системы мониторинга и сигнализации в режиме реального времени с хранением и управлением данными и использованием специального катетера IV, который позволяет непрерывную перфузию при прокалывании воротной вены во время канюляции. Насколько нам известно, мы являемся первой группой, которая объединила все эти функции в компактную интегрированную перфузионную систему (IPS), что делает ее очень портативной и способной помещаться в ламинарный проточный капот для обеспечения асептической работы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько моментов, которые особенно важно соблюдать для двухэтапной процедуры перфузии коллагеназы в целом. Во-первых, необходимо соблюдать особую осторожность при резецировании печени. Убедитесь, что желудочно-кишечный тракт не поврежден, так как утечка содержимого приведет к …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддерживается MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); Грант NUHS innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Институт механобиологии Сингапура (R-714-106-004-135); и Институт биоинженерии и нанотехнологий, Совет по биомедицинским исследованиям, Агентство по науке, технологиям и исследованиям (A*STAR) (номера проектов IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 и MedCaP-LOA-18-02) финансируют Hanry Yu. Нг Чан Уэй является научным сотрудником Национального университета Сингапура. Мы хотели бы поблагодарить Confocal Microscopy Unit & Flow Cytometry Unit Национального университета Сингапура за помощь и советы в анализе чистоты гепатоцитов.
Materials
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
Riferimenti
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).
