Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

Inn Chuan Ng; Li Zhang; Narelle Nichola Yi Ying Shen; Yun Ting Soong; Chan Way Ng; Phoebe Kang Sheing Koh; Yan Zhou; Hanry Yu

doi:10.3791/62289

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Articolo metodologico

Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

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DOI:

10.3791/62289

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5 aprile 2021

Inn Chuan Ng^*¹ , Li Zhang^*² , Narelle Nichola Yi Ying Shen³ , Yun Ting Soong⁴ , Chan Way Ng⁵ , Phoebe Kang Sheing Koh¹ , Yan Zhou³ , Hanry Yu¹^,³^,⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Physiology & The Institute for Digital Medicine (WisDM), National University of Singapore, ²College of Agriculture and Biology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, ³Mechanobiology Institute, National University of Singapore, ⁴Institute of Bioengineering and Nanotechnology, A*STAR, ⁵NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, ⁶CAMP, Singapore-MIT Alliance for Research and Technology

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'uso di uno speciale catetere endovenoso, tubi monouso sterili standardizzati, controllo della temperatura integrato da monitoraggio in tempo reale e un sistema di allarme per la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi per migliorare la coerenza nella vitalità, nella resa e nella funzionalità degli epatociti primari isolati di ratto.

Abstract

Gli epatociti primari sono ampiamente utilizzati nella ricerca di base sulle malattie del fegato e per i test di tossicità in vitro. La procedura di perfusione della collagenasi in due fasi per l'isolamento primario degli epatociti è tecnicamente impegnativa, specialmente nella cannulazione della vena porta. La procedura è anche soggetta a contaminazione occasionale e variazioni nelle condizioni di perfusione a causa di difficoltà nell'assemblaggio, nell'ottimizzazione o nella manutenzione della configurazione della perfusione. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per una migliore procedura di perfusione di collagenasi in due fasi con controllo della perfusione multiparametrica. Gli epatociti primari di ratto sono stati isolati con successo e in modo affidabile adottando le necessarie precauzioni tecniche nelle fasi critiche della procedura e riducendo la difficoltà operativa e mitigando la variabilità dei parametri di perfusione attraverso l'adozione di uno speciale catetere endovenoso, tubi monouso sterili standardizzati, controllo della temperatura e sistema di monitoraggio e allarme in tempo reale. Gli epatociti primari isolati di ratto mostrano costantemente un'elevata vitalità cellulare (85%-95%), resa (2-5 x 10⁸ cellule per 200-300 g di ratto) e funzionalità (albumina, urea e attività del CYP). La procedura è stata completata da un sistema di perfusione integrato, che è abbastanza compatto da essere installato nella cappa a flusso laminare per garantire il funzionamento asettico.

Introduzione

Gli epatociti primari sono strumenti importanti per la ricerca di base correlata al fegato, il trattamento delle malattie e l'applicazione come i test antidroga. L'attuale gold standard per l'isolamento primario degli epatociti è la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi ^1,2,3 introdotta da Seglen nel 1970 4. Tuttavia, questa procedura è tecnicamente impegnativa e ha un alto tasso di fallimento se eseguita da chirurghi alle prime armi. Anche quando una perfusione è considerata di successo, si possono osservare drastiche differenze nella ....