Primer Sıçan Hepatositlerinin Çok Parametreli Perfüzyon Kontrolü ile İzolasyonu
Summary
Bu protokol, özel bir intravenöz kateter, standartlaştırılmış steril tek kullanımlık tüp, gerçek zamanlı izleme ile tamamlanan sıcaklık kontrolü ve izole primer sıçan hepatositlerinin yaşayabilirliği, verimi ve işlevselliğindeki tutarlılığı artırmak için iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü için bir alarm sisteminin kullanımını detaylandırmaktadır.
Abstract
Primer hepatositler, karaciğer hastalıkları üzerine yapılan temel araştırmalarda ve in vitro toksisite testlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Primer hepatosit izolasyonu için iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü, özellikle portal ven kanülasyonunda teknik olarak zordur. Prosedür ayrıca perfüzyon kurulumunun montajı, optimizasyonu veya bakımındaki zorluklar nedeniyle ara sıra kontaminasyona ve perfüzyon koşullarındaki değişikliklere eğilimlidir. Burada, çok parametreli perfüzyon kontrolü ile geliştirilmiş iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Primer sıçan hepatositleri, prosedürün kritik aşamalarında gerekli teknik önlemler alınarak ve özel bir intravenöz kateter, standartlaştırılmış steril tek kullanımlık boru, sıcaklık kontrolü ve gerçek zamanlı izleme ve alarm sisteminin benimsenmesi yoluyla operasyonel zorluğu azaltarak ve perfüzyon parametrelerinin değişkenliğini azaltarak başarılı ve güvenilir bir şekilde izole edildi. İzole primer sıçan hepatositleri sürekli olarak yüksek hücre canlılığı (% 85-% 95), verim (200-300 g sıçan başına 2-5 x 108 hücre) ve işlevsellik (albümin, üre ve CYP aktivitesi) sergiler. Prosedür, aseptik çalışmayı sağlamak için laminer akış davlumbazına kurulabilecek kadar kompakt olan entegre bir perfüzyon sistemi ile tamamlandı.
Introduction
Primer hepatositler, karaciğer ile ilgili temel araştırmalar, hastalık tedavisi ve ilaç testi gibi uygulamalar için önemli araçlardır. Primer hepatosit izolasyonu için mevcut altın standart, Seglen tarafından 1970’lerde tanıtılan iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü 1,2,3’tür 4. Bununla birlikte, bu prosedür teknik olarak zordur ve acemi cerrahlar tarafından yapıldığında yüksek bir başarısızlık oranına sahiptir. Bir perfüzyonun başarılı olduğu düşünülse bile, izolasyonlar arasında hepatosit canlılığında (tipik olarak% 60-95) ve verimde (200-300 g sıçan başına 0.5-5 x 108) ciddi farklılıklar gözlenebilir. Bu, aşağı akış deneylerinin kalitesini ve ölçeğini etkiler. Teknik prosedürün yanı sıra, ticari olarak temin edilebilen veya özel olarak inşa edilen izolasyon için kullanılan perfüzyon kurulumu, katkıda bulunan bir faktördür. Perfüzyon kurulumunun montajına, optimizasyonuna ve bakımına dikkat edilmelidir. Bu protokolün amacı, teknik prosedürün çok parametreli perfüzyon kontrolü ve iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürünün perfüzyon kurulumu yoluyla primer sıçan hepatositlerinin izolasyonları arasındaki başarı oranını ve stabiliteyi arttırmaktır.
Teknik açıdan, prosedürdeki en zor adım portal ven kanülasyonudur. Diğer adımlara gelince, iyi uygulamalara uyulması ve genel önlemler alınması durumunda izolasyonun stabilitesi geliştirilebilir. Bu nedenle, cerrahın işlem sırasında ortaya çıkabilecek çeşitli değişkenlere cevap verebilmesi için her adımın mantığının anlaşılması önemlidir.
Hepatositlerin ve karaciğer parankimal olmayan hücrelerin sıçan ve fareden izole edilmesi için çeşitli protokoller yayınlanmıştır 1,2,5,6,7,8,9. Bu protokollerde kullanılan perfüzyon kurulumlarının, perfüzyon borularının yeniden kullanımı, sıcaklık kontrolü ile ilgili problemler, perfüzyon parametrelerinin rutin optimizasyonuna duyulan ihtiyaç ve / veya portal ven kanülasyonu için uygun olmayan intravenöz (IV) kateter tipinin kullanılması gibi çeşitli dezavantajları vardı. Perfüzyon borularının yeniden kullanılması, özellikle boru uygun şekilde temizlenmemiş ve dezenfekte edilmemişse, kontaminasyon olasılığını artıracaktır. Boruların rutin olarak değiştirilmeden yeniden kullanılması, perfüzyon kurulumunu sızdıran boru veya konektörler, tıkanmış kabarcık tuzağı ve daralmış boru gibi sorunlara da maruz bırakacak ve bunların hepsi perfüzyon basıncını ve akış hızını önemli ölçüde azaltacak ve böylece karaciğer sindirim verimliliğini etkileyecektir. Sıcaklık kontrolü için bazı kurulumlarda sabit bir ısı kaynağı olmadan, önceden ısıtılmış tamponlar zamanla soğur ve bu da düşük kollajenaz aktivitesine ve sindirime yol açar. Diğer kurulumlar, tamponu ısıtmak için bir su sirkülatörüne bağlı ceketli bir cam kondenser kullansa da, hacimlidir ve dikkatli temizlik gerektirir. Kateterden çıkan tamponun sıcaklığı, basıncı ve akış hızı, stabil perfüzyon durumunu sağlamak için izolasyon başlamadan önce ölçülmeli ve optimize edilmelidir. Optimizasyondan sonra bile, parametreler operatörün eylemleri nedeniyle izolasyon sırasında yarı yolda değişebilir, böylece yetersiz perfüzyon ve sindirime yol açabilir. Çoğu IV kateter tipi portal ven kanülasyonu için uygun değildir, çünkü kanülasyon sırasında sürekli perfüzyona izin vermezler. Kanülasyon başarılı olduğunda cerrahı hemen bilgilendiremezler. Ayrıca, portal veni yumuşak kateter üzerinde deforme etmeden sabitlemek zordur.
Burada, standartlaştırılmış tek kullanımlık steril boru, hassas ve kararlı sıcaklık kontrolü için silikon ısıtıcı ceket, veri depolama ve yönetimi ile gerçek zamanlı izleme ve alarm sistemi ve kanülasyon sırasında portal damarı delerken sürekli perfüzyona izin veren özel bir IV kateterin kullanımı ile bu sorunları ele alıyoruz. Bildiğimiz kadarıyla, tüm bu özellikleri kompakt bir entegre perfüzyon sisteminde (IPS) birleştiren ilk grubuz, bu da onu son derece taşınabilir hale getiriyor ve aseptik çalışmayı sağlamak için laminer bir akış davlumbazına sığdırılabiliyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genel olarak iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü için özellikle dikkat edilmesi gereken birkaç nokta vardır. İlk olarak, karaciğeri rezeke ederken özel dikkat gösterilmelidir. İçeriğin sızması bakteriyel kontaminasyona neden olacağından gastrointestinal sistemin zarar görmediğinden emin olun. Ek olarak, hayvan prosedürü sırasında karaciğerin yüzeyini kaplayan Glisson kapsülüne zarar vermekten kaçının. Yırtık yeterince büyükse, ilişkisiz hepatositlerin kollajenaz tamponuna erke…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen MOE ARC (MOE2017-T2-1-149) tarafından desteklenmektedir; NUHS İnovasyon Tohum Hibe 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Singapur Mekanobiyoloji Enstitüsü (R-714-106-004-135); ve Biyomühendislik ve Nanoteknoloji Enstitüsü, Biyomedikal Araştırma Konseyi, Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı (A * STAR) (Proje Numaraları IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 ve MedCaP-LOA-18-02) Hanry Yu’ya fon sağladı. Ng Chan Way, Singapur Ulusal Üniversitesi’nde araştırma görevlisidir. Singapur Ulusal Üniversitesi Konfokal Mikroskopi Ünitesi ve Akış Sitometri Ünitesi’ne hepatosit saflık analizinde yardım ve tavsiyeler için teşekkür ederiz.
Materials
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
Riferimenti
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).
