Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية دراسة جميع التركيبات الممكنة التي يمكن الحصول عليها بين أربعة أدوية في تجربة واحدة. وتستند هذه الطريقة على معيار 96 جيدا لوحة الفحص الدقيق تخفيف وحساب تركيزات مثبطة كسور (FICs) لتقييم النتائج.
Abstract
مفهوم العلاج مزيج من الأدوية أصبحت مهمة جدا أساسا مع الزيادة الحادة في مقاومة الأدوية. تهدف لوحة الداما الرباعية، التي تسمى أيضا لوحة الداما Q، إلى تعظيم عدد المجموعات الممكنة التي يمكن الحصول عليها بين أربعة أدوية في تجربة واحدة لتقليل الوقت والعمل اللازمين لتحقيق نفس النتائج مع بروتوكولات أخرى. ويستند هذا البروتوكول على تقنية التخفيف الدقيق البسيط حيث يتم تخفيف الأدوية ودمجها معا في عدة لوحات 96 بئرا.
في المجموعة الأولى من لوحات 96 بئرا ، يضاف مرق Muller-Hinton يليه أول دواء مطلوب (على سبيل المثال ، Cefotaxime هنا) لتخفيفه بشكل متسلسل. بعد الانتهاء من الخطوة الأولى ، يتم استخدام مجموعة أخرى من لوحات 96 بئرا لتمييع الدواء الثاني (على سبيل المثال ، Amikaci) ، والذي سيتم نقله عن طريق إزالة حجم معين من الدواء 2 ووضعه في الآبار المقابلة في المجموعة الأولى من لوحات 96 بئرا تحتوي على الدواء الأول. ويتم تنفيذ الخطوة الثالثة بإضافة التركيزات المطلوبة من الدواء الثالث (مثل ليفوفلوكساسين) إلى الصفائح المناسبة في المجموعة الأولية التي تحتوي على مزيج من الدواء 1 و 2. ويتم تنفيذ الخطوة الرابعة بإضافة التركيزات المطلوبة من الدواء الرابع (مثل تريميثوبريم-سولفاميثوكسيزول) إلى الصفائح المناسبة في المجموعة الأولى. ثم، سيتم إعداد E. القولونية ESBL البكتيرية inoculum وإضافتها.
هذه الطريقة مهمة لتقييم جميع التركيبات الممكنة ولها مجموعة أوسع من الاحتمالات لاختبارها بالإضافة إلى ذلك في اختبار الجسم الحي. على الرغم من كونها تقنية متعبة تتطلب الكثير من التركيز ، فإن النتائج رائعة وتوفير الوقت حيث يمكن اختبار الكثير من التركيبات في تجربة واحدة.
Introduction
مع زيادة المقاومة بسبب الإفراط في استخدام وإساءة استخدام المضادات الحيوية1،2، أصبحت الحاجة إلى تطوير أدوية وعوامل جديدة لعلاج العدوى البكتيرية حاسمة. والنهج الجديدة مثل استحداث عقاقير جديدة هامة جدا للتغلب على أزمة المقاومة. ومع ذلك، فإن صناعة الأدوية ليست مهتمة بتطوير عوامل جديدة مضادة للميكروبات. وعلاوة على ذلك، إذا تم تطوير أدوية جديدة، البكتيريا سوف تبقي على تطور وتطوير المقاومة ضد هذه الأدوية الجديدة3،4. وبالتالي، فإن مشكلة المقاومة لن تحل، مما يجعل الحاجة إلى نهج آخر أمرا لا بد منه ينبغي النظر فيه ودراسة التغلب على المقاومة البكتيرية.
مزيج الدواء هو مفهوم مهم جدا لعلاج العدوى البكتيرية أساسا تلك التي تسببها مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة5،6. أنه يقلل من مسار العلاج, يقلل من الجرعة المعطاة; وبالتالي ، فإن تقليل سمية الدواء المعطى ، يساعد في تقليل معدل تطور المقاومة ، وبطريقة ما ، يتحسس البكتيريا بالأدوية المعطاة كما هو موضح في مفهوم الحساسية الجانبية5و7و8و9.
تطوير المقاومة لدواء واحد يتطلب طفرة واحدة; ومع ذلك ، فإن تطور المقاومة لمزيج من الأدوية التي تستهدف مسارات متعددة يتطلب العديد من الطفرات المستقلة التي تتباطأ بسبب هذا المزيج. مثال على انخفاض المقاومة أثناء استخدام العلاج المركب هو انخفاض معدل مقاومة ريفامبين في الميكوباكتريا السل10. مثال آخر هو دراسة أجراها Gribble وآخرون التي أظهرت معدل ظهور سلالات مقاومة في المرضى الذين يتناولون Piperacillin وحدها لتكون أعلى مما كانت عليه في تلك التي تأخذ مزيجا من carboxypenicillin وأمينوغليكوزيد10. وقد أظهرت الدراسات أن تطور المقاومة ل aminoglycosides في البكتيريا المتطورة جعل هذه السلالات حساسة لمختلف الأدوية الأخرى5. الجمع بين بيتا لاكتام فئة المخدرات أموكسيسيلين وحامض اللاكتاماز المانع clavulanic أظهرت نجاحا في علاج السلالات البكتيرية المقاومة8.
تقليل وقت العلاج هو ميزة جيدة ناتجة عن تركيبات المخدرات. على سبيل المثال، فإن العلاج من البنسلين مجتمعة أو سيفترياكسون مع جنتاميسين لمدة 2 أسابيع تعطي نفس الفعالية التي قدمها البنسلين أو سيفترياكسون وحدها عندما تعطى لمدة 4 أسابيع11. الجمع بين الأدوية يسمح لاستخدام جرعات أقل من الأدوية التي ليست فعالة عندما تعطى وحدها مثل البلدان المتوسطة الدخل الفرعية. ويمكن إعطاء مثال السلفوناميدات حيث استخدام السلفوناميدات الثلاثي يقلل، بجرعات أقل، والسمية المنتجة التي هي تشكيل الكريستال أو تبلور عند استخدام السلفوناميدات غير القابلة للذوبان بجرعات كاملة12.
وبالتالي ، فإن تقليل الجرعة المعطاة ووقت العلاج سيقلن في نهاية المطاف من سمية الأدوية على الجسم. فكرة تطوير طرق لتقييم التفاعل بين الأدوية المشتركة مهمة جدا. في إحدى الدراسات، أظهرت النتائج أن العلاج المركب أكثر فعالية لعلاج الأنواع المقاومة من Acinetobacter و P. aeruginosa8.
إعطاء الأدوية في تركيبة
هناك طرق مختلفة يمكننا من خلالها دراسة تركيبات المخدرات ، مثل طريقة لوحة الداما ، وطريقة منحنى قتل الوقت ، وطريقة الاختبار الإلكتروني13. يمكن لطريقة لوحة الداما دراسة جميع التركيبات الممكنة بين العقارين المعنيين في تجربة واحدة نفسها. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطويره لدراسة مزيج من ثلاثة أدوية14. الآن، ونحن توسيع هذا لدراسة مزيج من أربعة أدوية أساسا لعلاج مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة.
عادة ما يتم إجراء المقايسة منحنى قتل الوقت لاختبار تأثير مبيد للجراثيم من دواء معين. كما تم استخدامه لاختبار تأثير تركيبات المخدرات حيث يتم الجمع بين العديد من الأدوية بتركيزات محددة. يتطلب هذا البروتوكول إعداد العديد من الأنابيب أو الأكواب العقيمة حيث نضيف في كل كوب المرق ، مزيج من الأدوية ، والإجهاد البكتيري المطلوب. بعد احتضان وتسجيل الكثافة البصرية في عدة نقاط زمنية ، تتم مقارنة النتائج مع معدل النمو الطبيعي للسلالة المستخدمة لمعرفة ما إذا كان معدل النمو قد زاد أو انخفض أو لم يتغير13.
عادة ما يتم إجراء طريقة الاختبار الإلكتروني لاختبار الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) حيث يتم وضع شريط يحتوي على تركيز متدرجة من الدواء المعني على لوحة تلقيح. كما تم استخدامه لاختبار الجمع بين اثنين من الأدوية حيث يتم إضافة شريطين إلى لوحة بطريقة عمودية تتقاطع في MICsبهم 13.
ووفقا للأدبيات، لا يوجد معيار ذهبي لتحديد التآزر ودراسةه؛ وبالتالي، فإنه من الصعب تقييم أي من الطرق المستخدمة لدراسة الجمع هو أفضل والتي تنتج واحدة نتائج أفضل وأكثر موثوقية أساسا13. ومع ذلك ، فإن الفحص لقتل الوقت كثيف العمالة ، ويستغرق وقتا طويلا ،ومكلفا 15،16، في حين يتم تطوير طريقة الاختبار الإلكتروني لدراسة مزيج بين عقارين فقط. يمكن للوحة الداما دراسة جميع التركيبات الممكنة بين الدواءين المختبرين وهذا هو السبب في اختيار هذه التقنية لتطويرها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خطوات التحضير
- إعداد مرق مولر-هينتون (MHB) بإضافة 25 غرام من مرق MH إلى 1 لتر من الماء المقطر والمزيج. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. ثم، تخزين الوسائط autoclaved في درجة حرارة الغرفة أو في الثلاجة.
- زراعة البكتيريا الفرعية في السؤال(E. coli ESBL) على وسائل الإعلام أجار باستخدام طريقة streaking أربعة أرباع واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- باستخدام حلقة معقمة، واتخاذ مستعمرة واحدة ونشرها في النصف الأول من لوحة أغار ماكونكي عن طريق القيام الشرائط المتوازية وثيقة.
- باستخدام الحلقة، نشر البكتيريا في الربع الثاني عن طريق streaking من الربع الأول.
- من الربع الثاني، قم بتوسيع الشرائط في الربع الثالث باستخدام خطوط متوازية قريبة.
- نشر البكتيريا في وسط الربع الرابع عن طريق streaking من الربع الثالث.
2. إعداد الفريق
- ضع أربع لوحات من 96 بئرا بجانب بعضها البعض لتشكيل مربع. باستخدام شريط، الشريط أسفل معا.
- كرر هذه الخطوة للحصول على أربع لوحات تحتوي كل منها على 4 لوحات وتسميتها A1 و A2 و A3 و A4.
- أضف 50 ميكرولتر من مرق MH إلى الآبار بين العمود 2 والعمود 11 في لوحات 16 96-well من اللوحات الأربع.
- إضافة 200 ميكرولتر من مرق MH إلى بئر H12 بمثابة السيطرة السلبية بشكل جيد في لوحات 16 96 جيدا من الألواح الأربعة.
- إضافة 150 ميكروغرام من مرق MH إلى الآبار A1 و H1 بمثابة آبار التحكم الإيجابية في لوحات 16 96 جيدا من الألواح الأربعة.
3. المخدرات 1، سيفوتيكسيم، تخفيف المسلسل
- إلى أنبوب مخروطي، أضف 15 مل من dH2O المعقم.
- حساب حجم أن تتم إزالتها من محلول المخزون من المخدرات بعد الصيغة C1V1 = C2V2. وهكذا، V1 = (C2 × 15 مل) / C1.
ملاحظة: في حالتنا، حل الأسهم Cefotaxime هو 105 ميكروغرام / مل وجيم2 هو 256 ميكروغرام / مل. وهكذا، V1 = 38.4 ميكرولتر.
- حساب حجم أن تتم إزالتها من محلول المخزون من المخدرات بعد الصيغة C1V1 = C2V2. وهكذا، V1 = (C2 × 15 مل) / C1.
- إزالة حجم محسوب من 15 مل من dH2O العقيمة، ومن ثم إضافة الدواء.
- ماصة 50 ميكرولتر من محلول الدواء المعد في كل بئر في العمود 11 والعمود 12 باستثناء H12.
- ابدأ التخفيف التسلسلي عن طريق إزالة 50 ميكرولتر من العمود 11 ووضعه في الآبار المقابلة في العمود 10 ، ثم من 10 حتى الوصول إلى العمود 2 حيث سيتم التخلص من 50 ميكرولتر المأخوذة من العمود 2.
- كرر الخطوتين 3.4 و3.5 لجميع لوحات الآبار 96 16 من الألواح الأربعة.
4. المخدرات 2، Amkacin، المخفف المسلسل
- إلى أنبوب مخروطي، أضف 10 مل من dH2O المعقم.
- حساب حجم أن تتم إزالتها من محلول المخزون من المخدرات بعد الصيغة C1V1 = C2V2. وهكذا، V1 = (C2 × 10 مل) / C1.
ملاحظة: في حالتنا، حل مخزون أميكاسين هو 103 ميكروغرام/مل و C2 هو 64 ميكروغرام/مل. وهكذا، V1 = 64 ميكرولتر. - إزالة حجم محسوب من 10 مل من DH2O العقيمة، ومن ثم إضافة الدواء.
- خذ ثماني لوحات منفصلة من 96 بئرا.
- إلى كل لوحة، أضف 100 ميكرولتر من MHB إلى الآبار بين الصفين G و B.
- إضافة 100 ميكرولتر من المخدرات التي أعدت سابقا 2 حل إلى آبار الصف G.
- تمييع تسلسليا من الصف G إلى الصف B عن طريق أخذ 100 ميكرولتر من كل بئر وأخيرا تجاهل 100 ميكرولتر من آبار الصف B.
- كرر الخطوات 4.5 و4.6 و4.7 لإعداد ثمانية أطباق.
5. نقل المخدرات 2 إلى أربعة لوحات
- ماصة 50 ميكرولتر من المخدرات 2 من الآبار بين الصفين G و B في الآبار المقابلة في كل لوحة في الألواح الأربعة. لوحة واحدة أعدت 96 جيدا يحتوي على 100 ميكروغرام من المخدرات 2 التي تكفي لاثنين من لوحات في لوحة واحدة.
6. المخدرات 3، ليفوفلوكساسين، بالإضافة إلى
- إلى أربعة أنابيب مخروطية مختلفة، أضف 14 مل من dH2O العقيم.
- حساب حجم أن تتم إزالتها من محلول المخزون من المخدرات بعد الصيغة C1V1 = C2V2. وهكذا، V1 = (C2 × 14 مل) / C1.
ملاحظة: في حالتنا، يتم إعداد ليفوفلوكساسين في أربعة تركيزات مختلفة من محلول المخزون من 5 × 103 ميكروغرام / مل.
C1 = 2 ميكروغرام/مل، V1 = 5.6 ميكرولتر
C2 = 4 ميكروغرام/مل، V1 = 11.2 ميكرولتر
C3 = 8 ميكروغرام/مل، V1 = 22.4 ميكرولتر
C4 = 16 ميكروغرام/مل، V1 = 44.8 ميكرولتر - إزالة حجم محسوب من 14 مل من DH2O العقيمة من كل أنبوب، ومن ثم إضافة الدواء.
- بعد إعداد التركيزات المطلوبة من الدواء الثالث ، خذ 50 ميكرولتر وأضفها إلى الآبار المقابلة بين الصفين B و G والأعمدة 2 و 12 في اللوحة المقابلة في كل لوحة حيث يتوافق C1 مع لوحات P1 الأربعة في الألواح الأربعة ، يتوافق C2 مع لوحات P2 الأربعة في الألواح الأربعة ، C3 يتوافق مع لوحات P3 الأربعة في الألواح الأربعة، وC4 يتوافق مع لوحات P4 الأربعة في الألواح الأربعة.
7. المخدرات 4، تريميثوبريم-سولفاميثوكسيزول، إضافة إلى ذلك
- إلى أنبوب مخروطي، أضف 14 مل من dH2O المعقم.
- حساب حجم أن تتم إزالتها من محلول المخزون من المخدرات بعد الصيغة C1V1 = C2V2. وهكذا، V1 = (C2 × 14 مل) / C1.
ملاحظة: في حالتنا، يتم إعداد ثلاثي ميثوبريم-سولفاميثوكسيزول في أربعة تركيزات مختلفة من محلول المخزون من 48 × 103 ميكروغرام /مل.
C1 = 512 ميكروغرام/مل، V1 = 149.33 ميكرولتر
C2 = 1024 ميكروغرام/مل، V1 = 298.66 ميكرولتر
C3 = 2048 ميكروغرام/مل، V1 = 597.33 ميكرولتر
C4 = 4096 ميكروغرام/مل، V1 = 1 194.66 ميكرولتر - إزالة حجم محسوب من 14 مل من dH2O العقيمة من كل أنبوب، ومن ثم إضافة الدواء.
- بعد إعداد التركيزات المطلوبة من الدواء الرابع ، خذ 50 ميكرولتر وأضفها إلى الآبار المقابلة بين الصفين B و G والأعمدة 2 و 12 في اللوحات الأربع في اللوحة المقابلة حيث يتوافق C1 مع اللوحة 1 ، C2 يتوافق مع اللوحة 2 ، C3 يتوافق مع اللوحة 3 ، و C4 يتوافق مع اللوحة 4.
8. إعداد وإضافة البكتيريا inoculum E. القولونية ESBL
- باستخدام حلقة معقمة، نقل مستعمرة واحدة من عزل البكتيرية E. coli ESBL سابقا مثقف على طبق من ذهب إلى 2 مل من MHB المعقمة ودوامة.
- تحقق من العكر حيث ينبغي أن يكون 0.5 ماكفارلاند باستخدام عداد الكثافة.
- أضف 80 مل من مرق MH المعقم إلى كوب بول معقم.
- إضافة inoculum البكتيرية من inoculum ماكفارلاند 0.5 إلى كوب البول بعد C1V1 = C2V2, حيث V1 = (106 × 80 مل) / 108 = 800 ميكرولتر.
- ماصة 50 ميكرولتر من محلول inoculum 106 CFU / مل في كل بئر باستثناء H12، وهو التحكم في العقم بشكل جيد.
- احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- بعد الحضانة، إضافة 50 ميكرولتر من Iodotetrazolium لتسجيل النمو في الآبار.
9. بروتوكول قالب FIC (ملف تكميلي)
- اكتب أعلى تركيز للدواء 1 (Cefotaxime) في الخلية الصفراء في اللوحة A.
- اكتب أعلى تركيز للدواء 2 (أميكاسين) في الخلية الصفراء في اللوحة B.
- اكتب أعلى تركيز للدواء 3 (Levofloxacin) في الخلية الصفراء في اللوحة C.
- اكتب أعلى تركيز للدواء 4 (تريميتهوبريم-سولفاميثوكسيزول) في اللوحة D.
- تتبع الخط الأحمر (النمو / لا واجهة النمو) من خلال تسليط الضوء على الآبار وجود نمو باللون الأحمر.
- اكتب هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 1 في جدول المخدرات 1 (ATB1).
- اكتب هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 2 في جدول المخدرات 2 (ATB2).
- اكتب هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 3 في جدول المخدرات 3 (ATB3).
- اكتب هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 4 في جدول المخدرات 4 (ATB4).
- لحساب FIC ل ATB1
- تحديد الآبار على واجهة النمو / لا نمو.
- في الجدول ATB1، انقر نقرا مزدوجا على الخلية المجاورة ل FIC1 واسحب الخلية الصفراء على يسار اللوحة A إلى أول بئر محدد.
- كرر الخطوة 9.10.2 لكل بئر مختارة حيث 1 جيدا يتوافق مع FIC1، حسنا 2 يتوافق مع FIC2، وهلم جرا.
- لحساب FIC ل ATB2
- في الجدول ATB2، انقر نقرا مزدوجا على الخلية المجاورة لFIC1 واسحب الخلية الصفراء على يسار اللوحة B إلى أول بئر تم تحديده مسبقا.
- كرر الخطوة 9.11.1 لكل بئر تم اختياره مسبقا.
- لحساب FIC ل ATB3
- في الجدول ATB3، انقر نقرا مزدوجا على الخلية المجاورة لFIC1 واسحب الخلية الصفراء على يسار اللوحة C إلى أول بئر تم تحديده مسبقا.
- كرر الخطوة 9.12.1 لكل بئر تم اختياره مسبقا.
- لحساب FIC ل ATB4
- في الجدول ATB4، انقر نقرا مزدوجا على الخلية المجاورة ل FIC1 واسحب الخلية الصفراء على يسار اللوحة D إلى أول بئر تم تحديده مسبقا.
- كرر الخطوة 9.13.1 لكل بئر تم اختياره مسبقا.
- في الجدول المسمى ATB1 +2+3+4، قم بتلخيص FIC1 لكل ATB تلقائيا. نفس سيحدث ل FICs الأخرى (FIC2 FIC3 وهكذا).
- في الخلية التي تحتوي على FIC وأبرز باللون الأصفر، انقر مرتين على ذلك وحدد ΣFICs summed من الجدول ATB1 +2+3+4.
- كرر هذه الخطوات لكل ورقة من الأوراق التسعة التي تمثل اللوحات التسعة.
ملاحظة: في الورقة FIC كافة، سيعرض الجدول FIC النهائي summed مع تفسير القيمة التي تم الحصول عليها.
10. تحديد هيئة التصنيع العسكري باستخدام المقايسة microdilution للأدوية الأربعة
- تسمية أربعة صفوف مختلفة مع اختصار كل دواء اختبارها. على سبيل المثال، CTX لCefotaxime، AMK لأميكاسين، ليفو لليفوفلوكساسين، وSXT لTrimethoprim-sulfamethoxazole.
- ماصة 200 ميكرولتر من مرق مولر هينتون العقيم إلى رقم جيد 1 ورقم جيد 12 في كل صف المستخدمة. حسنا رقم 12 سيكون بمثابة السيطرة السلبية بشكل جيد.
- ماصة 100 ميكرولتر من مرق مولر هينتون العقيم إلى الآبار 2 حتى 11 في كل صف مستخدم.
- حساب حجم كل دواء تضاف باستخدام الصيغة C1V1 = C2V2. وهكذا، V1 = (C2 × 4 × V2) / C1. V2 هو الحجم النهائي في الآبار وهو 200 ميكرولتر، C1 هو تركيز محلول المخزون، وC2 هو التركيز الأولي الذي نحتاج إلى أن يكون في البئر الأول.
ملاحظة: هنا، نستخدم ما يلي:
سيفوتيسيم: C1 = 105 ميكروغرام/مل، حيث نقوم بتخفيفه إلى 104 ميكروغرام/مل، C2 = 256 ميكروغرام/مل؛ وبالتالي، V1 = 20.48 ميكرولتر
أميكاسين: C1 = 103 ميكروغرام/مل، C2 = 64 ميكروغرام/مل؛ وبالتالي، V1 = 51.2 ميكرولتر
ليفوفلوكساسين: C1 = 5 × 103 ميكروغرام / مل، حيث تمييعه إلى 5 × 102 ميكروغرام / مل، C2 = 16 ميكروغرام / مل؛ وبالتالي، V1 = 25.6 ميكرولتر
تريميثوبريم-سولفاميثوكسيزول: C1 = 48 × 103 ميكروغرام/مل، C2 = 4096 ميكروغرام/مل؛ وبالتالي، V1 = 68.26 ميكرولتر - ماصة الحجم المطلوب لكل دواء في البئر الأول من الصف المقابل بعد إزالة نفس الحجم من مرق 200 ميكرولتر للحصول على حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر بعد إضافة الدواء.
- تمييع تسلسلي عن طريق إزالة 100 ميكرولتر من البئر 1 إلى بئر 2 وهلم جرا حتى الوصول إلى بئر 10 حيث سيتم التخلص من 100 ميكرولتر إزالتها من البئر 10. لاحظ أن جيدا 11 بمثابة السيطرة الإيجابية بشكل جيد.
- ماصة 100 ميكرولتر من 106 أعدت inoculum البكتيرية في كل بئر في كل صف المستخدمة باستثناء عدد جيد 12 بمثابة السيطرة السلبية.
- حضانة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمثل الشكل 2A النتائج التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين سيفوتاكسيم وأميكاسين مع تركيزات محددة من ليفوفلوكساسين وتريمثوبريم-سولفاميثوكسيزول. يمكننا أن نرى في الجزء الأيسر من الشكل لوحات الأربعة التي يتم تقديمها تخطيطيا مع تركيزات المخدرات في الجزء الأيمن من الشكل. تمثل الأسهم الآبار على واجهة النمو /عدم النمو. الآبار الملونة هي الآبار التي تحتوي على النمو. نلاحظ أن اللوحة الرابعة لا تحتوي على نمو في الربع الذي يحتوي على التركيبة. وذلك لأن في هذه اللوحة لدينا هيئة التصنيع العسكري من ليفوفلوكساسين من شأنها أن تمنع النمو. في هذا الرقم، يمكننا أن نرى أن يتم الحصول على هيئة التصنيع العسكري من Cefotaxime في A8 البئر، وهو ما يعادل 32 ميكروغرام / مل. يتم الحصول على هيئة التصنيع العسكري من أميكاسين في البئر E1، وهو ما يعادل 16 ميكروغرام / مل. وينظر إلى تأثير تثبيط في الصف الذي يحتوي على 1/2 هيئة التصنيع العسكري من أميكاسين (الصف دال) بالإضافة إلى العديد من subMICs من سيفوتاكزيم ويفوفلوكساسين بالإضافة إلى 1/8 هيئة التصنيع العسكري من تريميثوبريم-سولفاميثوكسيزول. هذا التثبيط للنمو البكتيري في الآبار التي تحتوي على تركيزات subMIC قد يكون شكلا من أشكال التآزر بين هذه التركيزات من الأدوية الأربعة.
يمثل الشكل 2B النتائج التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين سيفوتوكسيم وأميكاسين مع تركيزات محددة من ليفوفلوكساسين وتريمثوبريم-سولفاميثوكسيزول. يمكننا أن نرى في الجزء الأيسر من الشكل لوحات الأربعة التي يتم تقديمها تخطيطيا مع تركيزات المخدرات في الجزء الأيمن من الشكل. تمثل الأسهم الآبار على واجهة النمو /عدم النمو. الآبار الملونة هي الآبار التي تحتوي على النمو. اتبع نفس التفسير للوح الرابع. في الفريق الذي يمثله هذا الرقم، يمكننا أن نرى أن نمط تثبيط النمو البكتيري حدث في الصف دال أيضا، حيث تحتوي الآبار subMICs من سيفوتاكسيم وليفوفلوكساسين، 1/2 هيئة التصنيع العسكري من أميكاسين و 1/4 هيئة التصنيع العسكري من تريميثوبريم-سلفاميثوكسيزول.
يمثل الشكل 2C النتائج التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين سيفوتوكزيم وأميكاسين مع تركيزات محددة من ليفوفلوكساسين وتريميثوبريم-سولفاميثوكسيزول. يمكننا أن نرى في الجزء الأيسر من الشكل لوحات الأربعة التي يتم تقديمها تخطيطيا مع تركيزات المخدرات في الجزء الأيمن من الشكل. تمثل الأسهم الآبار على واجهة النمو /عدم النمو. الآبار الملونة هي الآبار التي تحتوي على النمو. اتبع نفس التفسير للوح الرابع. أما بالنسبة لنمط تثبيط في هذه اللوحة، يمكننا أن نرى أن في الصفين C و D النمو لا ينظر إليه. وهذا يعني أن في الآبار تحتوي على العديد من subMICs من سيفوتوكسيم وليفوفلوكساسين بالإضافة إلى 1/2 هيئة التصنيع العسكري من تريميثوبريم-سولفاميثوكسيزول و 1/4 هيئة التصنيع العسكري و 1/2 هيئة التصنيع العسكري من أميكاسين.
يمثل الشكل 2D النتائج التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين سيفوتوكسيم وأميكاسين مع تركيزات محددة من ليفوفلوكساسين وتريميثوبريم-سولفاميثوكسيزول. يمكننا أن نرى في الجزء الأيسر من الشكل لوحات الأربعة التي يتم تقديمها تخطيطيا مع تركيزات المخدرات في الجزء الأيمن من الشكل. تمثل الأسهم الآبار على واجهة النمو /عدم النمو. اتبع نفس التفسير للوح الرابع. يمكننا أن نرى أنه فقط في الصف A والعمود 1 لدينا آبار ملونة معنى النمو. وذلك لأن لدينا في هذه اللوحة هيئة التصنيع العسكري من تريميثوبريم-sulfamethoxazole التي من شأنها أن تمنع تماما النمو.
الشكل 1: تخطيطي لإعداد لوحة الداما Q ولوحات وخريطة لكيفية إضافة الأدوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها في التجربة 1 لتركيبات معينة تم اختبارها.
ملف تكميلي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يشبه أسلوب "لوحة الداما رباعية" لوحة الداما ولوحة الداما ثلاثي الأبعاد في بروتوكولها. ومع ذلك، ينبغي أخذ بعض الخطوات الحاسمة في الاعتبار لتجنب الأخطاء أثناء التجربة.
تأكد من اختبار لهيئة التصنيع العسكري من كل دواء ضد عزل اختبارها قبل البدء في البروتوكول لمعرفة ما هي التركيزات اللازمة لبدء التخفيف مع للدواء 1 والمخدرات 2 التي تحتاج إلى تخفيف تسلسلي في لوحات. وفيما يتعلق بالمخدرات 3 والمخدرات 4، ينبغي أيضا أن يعرف هيئة التصنيع العسكري لحساب التركيزات اللازمة لاختبار (1/8 هيئة التصنيع العسكري، 1/4 هيئة التصنيع العسكري، 1/2 هيئة التصنيع العسكري، وهيئة التصنيع العسكري). هناك الكثير من الطرق لتحديد هيئة التصنيع العسكري، ولكن الأفضل هو تحديد ذلك مع تقنية microdilution منذ بروتوكول Q-checkerboard يستخدم أيضا المقايسة microdilution لتخفيف المسلسل.
في الخطوة الأولى، أثناء تسجيل الألواح، تأكد من أن المقعد نظيف وغطي الصفائح بأغطية معقمة لتجنب التلوث. من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول يمكن القيام به باستخدام أربع لوحات 96 بئر تمثل الألواح الأربعة ، حيث يتم تقسيم كل لوحة إلى أربعة أرباع أصغر. ومع ذلك ، سيتم تقليل عدد التخفيفات للدواء الأول والثاني. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أيضا استخدام لوحات عميقة جيدا 384 بئرا بدلا من تسجيل أربع لوحات معا. ومع ذلك ، لم تكن متاحة عندما قمنا بالتجارب. لاحظ أنه عند اختيار اللوحة التي سيتم استخدامها، تأكد من التحقق من قدرة كل بئر لأن الحجم النهائي في البئر سيكون 250 ميكرولتر.
وعلاوة على ذلك، فإن عدد لوحات في كل لوحة وعدد لوحات يعتمد على عدد من التخفيفات المطلوبة للدواء الثالث والرابع. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، كانت هناك حاجة إلى أربعة مخففات من الدواء الثالث وأربعة مخففات من الدواء الرابع (1/8 MIC ، 1/4 MIC ، 1/2 MIC ، و MIC) ؛ وهكذا، كان لدينا أربع لوحات في كل لوحة وأربع لوحات.
تخفيف الدواء الأول يحدث في لوحات من لوحات وفقا للأعمدة. ومع ذلك ، فإن تخفيف الدواء الثاني يحدث في لوحات منفصلة وفقا للصفوف. أما العقاران الثالث والرابع فلا يتم تخفيفها بشكل متسلسل. ومع ذلك، يتم إعداد كل تركيز يستخدم في أنبوب منفصل ويضاف إلى كل بئر في حجم معين. ومن المهم ملاحظة أن الآبار التي تحتوي على الأدوية الأربعة موجودة في الربع بين الصفين G و B والأعمدة 2 و 12 فقط. لم يتم تصوير لوحة الداما وبروتوكولات لوحة الداما ثلاثية الأبعاد أو كتابتها في هذه المخطوطة لأنها بروتوكولات معروفة والغرض من هذه المخطوطة هو التحدث عن بروتوكول لوحة الداما Q. في تقنية لوحة الداما، يحتوي الصف A على الدواء 1 فقط؛ وهكذا، تظهر هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 1. يحتوي العمود 1 على المخدرات 2 فقط; وهكذا، تظهر هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 2.
يتم الاحتفاظ بهذا المفهوم في بروتوكول Q-Checkerboard حيث لا يزال يظهر MIC من الدواء 1 في الصف A و MIC من الدواء 2 لا يزال يظهر في العمود 1. بالإضافة إلى ذلك ، فإن اثنين من الأدوية المضافة تقديم هيئة التصنيع العسكري في التجربة. المخدرات 3 لديه لوحة P4 في كل لوحة حيث يتم إضافة هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 3 لجميع الآبار لذلك لا ينبغي لنا أن نلاحظ النمو في هذه اللوحة. وبالمثل، المخدرات 4 لديه لوحة A4 حيث يتم إضافة هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 4 إلى جميع الآبار في جميع لوحات في لوحة 4 لذلك لا ينبغي أن يلاحظ أي نمو في هذه اللوحة.
يتم تسجيل النمو في لوحات على أساس العكر في الآبار، حيث تعتبر الآبار العكرة أن يكون النمو. بالإضافة إلى العكر، يتم إضافة 50 ميكرولتر من Iodotetrazolium وتترك لبضع دقائق. تغيير اللون إلى اللون الوردي يعني أن هناك نمو.
هذا الأسلوب له بعض القيود. وهو يتطلب عملا شاقا وتركيزا. يمكن أن تحدث أخطاء بايبتينغ منذ تستند هذه التقنية بشكل رئيسي على pipetting. تعتبر حسابات FIC قيدا في هذه الحالة لأننا نتعامل مع أربع قيم وليس اثنين أو ثلاثة. إضافة قيمة سوف تزيد من قيمة FIC في البئر؛ وبالتالي، يجب إعادة النظر في قيم FIC التي تحدد التآزر واللامبالاة والعداء.
يمكن أن تتغير قيم FIC بين العديد من المراجع المتعلقة بالمعايير التي يتم من خلالها تعريف التآزر والعداء واللامبالاة. تشير بعض المراجع إلى أن FIC من 0.5 وأقل يعتبر التآزر13، في حين أن البعض الآخر يذكر أن FIC أقل من 0.8 يعتبر التآزر16. 11- تشير إشارة أخرى إلى أن FIC أقل من 1 يعتبر تآزرا17. نظرا لعدم الاستقرار والصراع في تحديد معيار موحد FIC من التآزر، اعتبرنا 1 لتكون مرجعنا.
يتم حساب FIC النهائي بإضافة قيم FIC لكل لوحة (9 FICs) وتقسيمها على عدد اللوحات التي هي 9. من المهم ملاحظة أن الفريق 4 لا ينظر في النتائج لأنه يحتوي على هيئة التصنيع العسكري من الدواء الرابع لذلك فإن تثبيط يكون عمل دواء واحد. بالإضافة إلى ذلك، لوحة 4 في كل لوحة هو أيضا لا يعتبر لأنه يحتوي على هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 3 حيث تثبيط في هذه اللوحة سيكون فعل المخدرات 3 وحدها. وهكذا، ونحن في نهاية المطاف مع 9 لوحات (16 - (4 + 3)).
لكل لوحة، يتم حساب FICs للآبار على النمو / لا واجهة النمو وفقا للصيغة التالية: (هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 1 في تركيبة / هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 1 وحدها) + (هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 2 في تركيبة / هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 2 في تركيبة / هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 2 وحدها). ثم يتم تقسيم الرقم الذي تم الحصول عليه على 4. يتم تنفيذ هذه الصيغة لكل بئر على واجهة النمو/عدم النمو في نفس اللوحة. ثم، يتم تلخيص جميع FICs من نفس اللوحة معا للحصول على FIC من هذه اللوحة. وأخيرا، وكما ذكر من قبل، تضاف وحدات الاستخبارات المالية النهائية ال 9 لكل لوحة وتقسم على 9 للحصول على FIC النهائي الذي سيتم تفسيره.
يعتبر FIC أقل من 1 تآزرا حيث يكون لديه درجة معينة من التآزر: فهو إما تآزري قليلا (قريب من واحد) أو أكثر تآزرا (عندما يتحرك نحو 0.5 وأقل). يتم هذا الحساب والتفسير ببساطة باستخدام قالب FIC الذي قمنا بتطويره. نحن فقط ندخل التركيزات، واختيار الآبار على واجهة النمو / لا النمو لحساب FICs، وسوف نحصل على FIC النهائي الذي يتم تفسيره وفقا للمعايير المذكورة.
تسمح هذه الطريقة باختبار جميع التركيبات الممكنة التي يمكن القيام بها باستخدام أربعة أدوية في تجربة واحدة والتي يمكن إجراؤها في يوم واحد. يتم الحصول على النتائج في اليوم التالي. في حين أنه بحلول الوقت الذي يتم فيه اختبار منحنى القتل ، هناك حاجة إلى مزيد من الوقت ومواد العمل والعاملين في المختبر لاختبار نفس العدد من التركيبات ، حيث يتم اختبار كل مجموعة من المجموعات وحدها في أنبوب واحد أو كوب مما يجعلها تستغرق وقتا طويلا. يمكن استخدام هذه الطريقة ليس فقط لاختبار تركيبات الأدوية المضادة للبكتيريا ، ولكن لاختبار جميع أنواع الأدوية المستخدمة لعلاج الأمراض وتحتاج إلى اختبارها في تركيبة. ويمكن استخدامه أيضا لاختبار مزيج من المخدرات ومستخلصات نباتية أو حتى مزيج من المستخلصات النباتية فقط. النقطة هي أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لاختبار ليس فقط أدوية محددة، ولكن كل ما يمكن الجمع بينهما.
العديد من القيود المصاحبة لهذه الطريقة. مهارات Pipetting مهمة جدا أثناء تنفيذ هذا الفحص وأي خطأ قد يحدث أثناء pipetting والتخفيف التسلسلي يمكن أن تؤثر سلبا على النتائج، ويمكن أن يؤدي إلى نتائج إيجابية سلبية أو كاذبة كاذبة. وبالتالي ، فإن أي تقدم تكنولوجي فيما يتعلق آلات الأنابيب والروبوتات تكون عونا كبيرا في أداء هذا المقايسة. تتطلب هذه الطريقة الكثير من الحسابات والتخفيفات لذلك قد يغير أي خطأ واحد نتيجة النتائج. توفر هذه التقنية رؤى حول تأثير التثبيط فقط وليس تأثير القتل. هذه التقنية تدرس تثبيط في نقطة زمنية واحدة وليس مع مرور الوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
اي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
References
- Ibezim, E.
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
- Nathan, C.
- Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
- Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
- Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
- Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
- Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
- Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
- Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S.
- Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
- Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
- Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
- Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
- Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
