Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

चौगुनी-चेकरबोर्ड: ड्रग कॉम्बिनेशन का अध्ययन करने के लिए त्रि-आयामी चेकरबोर्ड का संशोधन

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62311
Automatic Translation
1, 2, 2,3
1Faculty of Medicine and Medical Sciences, University of Balamand, 2Department of Clinical Microbiology, Michigan Health Clinics, 3College of Medicine, Central Michigan University

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि एक ही प्रयोग में चार दवाओं के बीच प्राप्त किए जा सकने वाले सभी संभावित संयोजनों का अध्ययन कैसे किया जाए। यह विधि परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए मानक 96-वेल प्लेट माइक्रो कमजोर पड़ने परख और आंशिक निरोधात्मक सांद्रता (एफआईसी) की गणना पर आधारित है।

Abstract

दवा संयोजन चिकित्सा की अवधारणा मुख्य रूप से दवाओं के प्रतिरोध में भारी वृद्धि के साथ बहुत महत्वपूर्ण होता जा रहा है । चौगुनी चेकरबोर्ड, जिसे क्यू-चेकरबोर्ड भी कहा जाता है, का उद्देश्य संभावित संयोजनों की संख्या को अधिकतम करना है जो अन्य प्रोटोकॉल के साथ समान परिणामों को पूरा करने के लिए आवश्यक समय और काम को कम करने के लिए एक प्रयोग में चार दवाओं के बीच प्राप्त किए जा सकते हैं। यह प्रोटोकॉल सरल माइक्रो कमजोर पड़ने की तकनीक पर आधारित है जहां दवाओं को पतला किया जाता है और कई 96-अच्छी प्लेटों में एक साथ जोड़ा जाता है।

96-वेल प्लेटों के पहले सेट में, मुलर-हिंटन शोरबा को क्रमिक रूप से पतला करने के लिए पहली आवश्यक दवा (जैसे, सेफोटैक्सिम यहां) के बाद जोड़ा जाता है। पहला कदम पूरा होने के बाद, 96-अच्छी प्लेटों का एक और सेट दूसरी दवा (जैसे, अमिकासी) को पतला करने के लिए उपयोग किया जाता है, जिसे दवा 2 की एक विशिष्ट मात्रा को हटाकर स्थानांतरित किया जाएगा और 96-अच्छी प्लेटों के पहले सेट में संबंधित कुओं में डाल दिया जाएगा जिसमें दवा एक होती है। तीसरा चरण दवा 1 और 2 के संयोजन वाले प्रारंभिक सेट में उपयुक्त प्लेटों में तीसरी दवा (जैसे, लेवोफ्लोक्सासिन) की आवश्यक सांद्रता जोड़कर किया जाता है। चौथा चरण पहले सेट में उपयुक्त प्लेटों में चौथी दवा (जैसे, ट्राइमेथोरिम-सल्फामेथॉक्साजोल) की आवश्यक सांद्रता जोड़कर किया जाता है। इसके बाद ई कोलाई ईएसबीएल बैक्टीरियल इनोकुलम तैयार कर जोड़ा जाएगा।

यह विधि सभी संभावित संयोजनों का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है और वीवो परीक्षण में इसके अलावा परीक्षण करने के लिए संभावनाओं की एक व्यापक श्रृंखला है। एक थका तकनीक बहुत ध्यान देने की आवश्यकता होने के बावजूद, परिणाम उल्लेखनीय हैं और समय की बचत होती है जहां एक ही प्रयोग में बहुत सारे संयोजनों का परीक्षण किया जा सकता है।

Introduction

एंटीबायोटिक दवाओं के अति उपयोग और दुरुपयोग के कारण प्रतिरोध में वृद्धि के साथ1,2,बैक्टीरियल संक्रमण के इलाज के लिए नई दवाओं और एजेंटों को विकसित करने की आवश्यकता महत्वपूर्ण हो गई है। इस तरह के नए दवाओं के विकास के रूप में नए दृष्टिकोण प्रतिरोध संकट से उबरने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं । हालांकि, दवा उद्योग नए रोगाणुरोधी एजेंटों को विकसित करने में रुचि नहीं रखता है। इसके अलावा, यदि नई दवाएं विकसित की जाती हैं, तो बैक्टीरिया विकसित होते रहेंगे और इन नई दवाओं के खिलाफ प्रतिरोध विकसित करते रहेंगे3,4। इस प्रकार, प्रतिरोध की समस्या का समाधान नहीं किया जाएगा, जिससे एक और दृष्टिकोण की आवश्यकता होनी चाहिए जिस पर विचार किया जाना चाहिए और बैक्टीरियल प्रतिरोध को दूर करने के लिए अध्ययन किया जाना चाहिए।

जीवाणु संक्रमण के इलाज के लिए औषधि संयोजन एक बहुत ही महत्वपूर्ण अवधारणा है जो मुख्य रूप से मल्टीड्रग प्रतिरोधी रोगजनकों के कारण होते हैं5,6. यह उपचार के पाठ्यक्रम को कम कर देता है, दी गई खुराक को कम करता है; इस प्रकार, दी गई दवा की विषाक्तता को कम करना, प्रतिरोध विकास की दर को कम करने में मदद करता है और, एक तरह से, कोलैटल संवेदनशीलता 5,7,8,9की अवधारणा में वर्णित दी गई दवाओं के लिए बैक्टीरिया को जागरूक करता है ।

एक दवा के प्रतिरोध विकास के लिए एक एकल उत्परिवर्तन की आवश्यकता होती है; हालांकि, कई रास्तों को लक्षित करने वाली दवाओं के संयोजन के प्रतिरोध विकास के लिए कई स्वतंत्र उत्परिवर्तनों की आवश्यकता होती है जो इस संयोजन से धीमा हो जाते हैं। संयोजन चिकित्सा का उपयोग करते समय प्रतिरोध में कमी लाने का एक उदाहरण माइकोबैक्टीरियम तपेदिक10में रिफाम्पिन के प्रतिरोध की घटी हुई दर है । एक अन्य उदाहरण ग्रिबल एट अल द्वारा किया गया एक अध्ययन है जिसमें रोगियों में प्रतिरोधी उपभेदों के उद्भव की दर को दिखाया गया है जो अकेले पिपरासिलिन ले रहे हैं, जो कार्क्सीपेनिसिलिन और अमीनोगलिकोसाइड10का संयोजन लेने वालों की तुलना में अधिक है। अध्ययनों से पता चला है कि बैक्टीरिया विकसित करने में अमीनोगलिकोसाइड्स के प्रतिरोध विकास ने इन उपभेदों को विभिन्न अन्य दवाओं के प्रति संवेदनशील बना दिया5. बीटा-लैक्टम क्लास ड्रग एमोक्सीसिलिन और लैक्टामेज अवरोधक क्लावुलेनिक एसिड के बीच संयोजन ने प्रतिरोधी जीवाणु उपभेदों के इलाज में सफलता दिखाई8।

उपचार के समय को कम करना दवा संयोजनों के परिणामस्वरूप एक अच्छा लाभ है। उदाहरण के लिए, 2 सप्ताह के लिए जेंटामिसिन के साथ संयुक्त पेनिसिलिन या सेफ्रिक्सोन की एक चिकित्सा 4 सप्ताह11के लिए दिए जाने पर अकेले पेनिसिलिन या सेफ्रिक्सोन द्वारा दी गई एक ही प्रभावकारिता देगी। दवाओं के संयोजन दवाओं के कम खुराकों के उपयोग के लिए अनुमति देता है जो अकेले दिए जाने पर प्रभावी नहीं होते हैं जैसे कि उप-एमआईसी। सल्फोनामाइड्स का उदाहरण दिया जा सकता है जहां ट्रिपल-सल्फोनमाइड्स का उपयोग कम खुराक पर कम होता है, विषाक्तता का उत्पादन किया जाता है जो पूरी खुराक पर अघुलनशील सल्फोनमाइड्स का उपयोग करते समय क्रिस्टलगठनया क्रिस्टलुरिया होता है।

इस प्रकार, दी गई खुराक को कम करना और उपचार का समय अंततः शरीर पर दवाओं की विषाक्तता को कम कर देगा। संयुक्त दवाओं के बीच बातचीत का आकलन करने के तरीकों को विकसित करने का विचार बहुत महत्वपूर्ण है । एक अध्ययन में, परिणामों से पता चला है कि संयोजन चिकित्सा Acinetobacter और पी aeruginosa8की प्रतिरोधी प्रजातियों के उपचार के लिए अधिक प्रभावी है ।

संयोजन में दवाएं देना
विभिन्न तरीके हैं जिनके द्वारा हम चेकरबोर्ड विधि, समय-किल वक्र विधि, और ई-परीक्षण विधि13जैसे दवा संयोजनों का अध्ययन कर सकते हैं। चेकरबोर्ड विधि एक प्रयोग में ही प्रश्न में दो दवाओं के बीच सभी संभव संयोजनों का अध्ययन कर सकती है। इसके अलावा, इसे तीन दवाओं के संयोजन का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था14। अब, हम मुख्य रूप से मल्टीड्रग प्रतिरोधी रोगजनकों के उपचार के लिए चार दवाओं के संयोजन का अध्ययन करने के लिए इसका विस्तार करते हैं।

समय को मारने वक्र परख आमतौर पर एक निश्चित दवा के जीवाणु प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए किया जाता है। इसका उपयोग दवा संयोजनों के प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए भी किया जाता था जहां कई दवाओं को विशिष्ट सांद्रता पर जोड़ा जाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए कई बाँझ ट्यूब या कप की तैयारी की आवश्यकता होती है जहां प्रत्येक कप में हम शोरबा, दवाओं के संयोजन और आवश्यक बैक्टीरियल स्ट्रेन जोड़ते हैं। कई समय बिंदुओं पर ऑप्टिकल घनत्व की इनक्यूबेशन और रिकॉर्डिंग के बाद, परिणामों की तुलना इस्तेमाल किए गए तनाव की सामान्य वृद्धि दर से की जाती है ताकि यह देखा जा सके कि विकास दर में वृद्धि हुई, कमी आई, या13में परिवर्तन नहीं हुआ ।

ई-परीक्षण विधि आमतौर पर न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) के लिए परीक्षण करने के लिए की जाती है जहां प्रश्न में दवा की ढाल एकाग्रता वाली पट्टी को एक टीका प्लेट पर रखा जाता है। इसका उपयोग दो दवाओं के बीच के संयोजन को परखने के लिए भी किया जाता था जहां प्लेट में दो स्ट्रिप्स को उनके एमआईसीएस13में एक लंबवत तरीके से जोड़ा जाता है ।

साहित्य के अनुसार, तालमेल को परिभाषित करने और अध्ययन करने के लिए कोई स्वर्ण मानक नहीं है; इस प्रकार, यह आकलन करना मुश्किल है जो संयोजन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों में से एक बेहतर है और जो एक बेहतर और अधिक विश्वसनीय परिणाम मुख्य रूप से13पैदा करता है . हालांकि, समय-हत्या परख श्रम गहन, समय लेने वाली और महंगी15,16है, जबकि ई-परीक्षण विधि केवल दो दवाओं के बीच एक संयोजन का अध्ययन करने के लिए विकसित की गई है। चेकरबोर्ड परीक्षण की गई दो दवाओं के बीच सभी संभावित संयोजनों का अध्ययन कर सकता है और यही कारण है कि इस तकनीक को विकसित करने के लिए चुना गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. तैयारी के कदम

  1. मुलर-हिंटन शोरबा (एमएचबी) को एमएच शोरबा के 25 ग्राम से 1 एल आसुत पानी और मिक्स करके तैयार करें। 2.5 घंटे के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव। फिर, कमरे के तापमान पर या फ्रिज में ऑटोक्लेवेड मीडिया को स्टोर करें।
  2. उपसंस्कृति चार चतुर्भुज लकीर विधि का उपयोग कर आगर मीडिया पर प्रश्न में बैक्टीरिया(ई. कोलाई ESBL) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट ।
    1. बाँझ पाश का उपयोग करके, एक कॉलोनी लें और इसे बंद समानांतर धारियाँ करके मैककोन्की एगर प्लेट के पहले हाफ में फैलाएं।
    2. लूप का उपयोग करके, बैक्टीरिया को पहले चतुर्भुज से लकीर करके दूसरे चतुर्भुज में फैलाएं।
    3. दूसरे चतुर्भुज से, करीब समानांतर धारियाँ का उपयोग करके तीसरे चतुर्भुज में धारियों का विस्तार करें।
    4. बैक्टीरिया को चौथे चतुर्भुज के केंद्र में तीसरे चतुर्भुज से लकीर बनाकर फैलाएं।

2. पैनल की तैयारी

  1. एक वर्ग बनाने के लिए एक दूसरे के बगल में चार ९६-अच्छी तरह से प्लेटें रखें । एक टेप का उपयोग करना, उनके नीचे एक साथ टेप ।
  2. 4 प्लेटों वाले चार पैनलों को प्राप्त करने के लिए इस चरण को दोहराएं और उन्हें A1, A2, A3 और A4 नाम दें।
  3. चार पैनलों की १६ ९६-वेल प्लेटों में कॉलम 2 और कॉलम 11 के बीच कुओं में एमएच शोरबा के ५० μL जोड़ें ।
  4. चार पैनलों की १६ ९६-अच्छी प्लेटों में अच्छी तरह से नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवारत अच्छी तरह से H12 के लिए एमएच शोरबा के २०० μL जोड़ें ।
  5. चार पैनलों की १६ ९६-अच्छी प्लेटों में सकारात्मक नियंत्रण कुओं के रूप में सेवारत कुओं A1 और H1 के लिए एमएच शोरबा के १५० μL जोड़ें ।

3. दवा 1, Cefotaxime, धारावाहिक कमजोर पड़ने

  1. एक शंकु नली में, बाँझ डीएच2ओ के 15 एमएल जोड़ें।
    1. फॉर्मूला सी 1वी 1 = सी 2 वी2केबाददवा के स्टॉक समाधान से निकाले जाने वाले वॉल्यूम की गणना करें । इस प्रकार, V1 = (C2 x15 mL) /
      नोट: हमारे मामले में, Cefotaxime स्टॉक समाधान 105 μg/mL है और सी2 256 μg/mL है; इस प्रकार, वी1 = 38.4 माइक्रोन।
  2. बाँझ डीएच2ओ के 15 एमएल से गणना की गई मात्रा निकालें, और फिर दवा जोड़ें।
  3. पाइपेट 50 तैयार दवा समाधान के कॉलम 11 और कॉलम 12 में एच 12 को छोड़कर प्रत्येक अच्छी तरह से।
  4. कॉलम 11 से 50 माइक्रोन को हटाकर और इसे कॉलम 10 में संबंधित कुओं में डालकर सीरियल कमजोर पड़ना शुरू करें, और फिर 10 से कॉलम 2 तक पहुंचने तक जहां कॉलम 2 से लिया गया 50 माइक्रोन को छोड़ दिया जाएगा।
  5. चार पैनलों के सभी 16 96-अच्छी प्लेटों के लिए चरण 3.4 और 3.5 दोहराएं।

4. दवा 2, Amkacin, धारावाहिक कमजोर पड़

  1. एक शंकु नली में, बाँझ डीएच2ओ के 10 एमएल जोड़ें।
  2. फॉर्मूला सी 1वी 1 = सी 2 वी2केबाददवा के स्टॉक समाधान से निकाले जाने वाले वॉल्यूम की गणना करें । इस प्रकार, V1 = (C2 x 10 mL)/C1।
    नोट: हमारे मामले में, Amikacin स्टॉक समाधान 103 μg/mL है और सी2 64 μg/ इस प्रकार, वी1 = 64 माइक्रोन।
  3. बाँझ डीएच2ओ के 10 एमएल से गणना की गई मात्रा को हटा दें, और फिर दवा जोड़ें।
  4. आठ अलग-अलग 96-वेल प्लेट लें।
  5. प्रत्येक प्लेट में, पंक्तियों जी और बी के बीच कुओं में एमएचबी के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  6. पंक्ति जी के कुओं में पहले से तैयार दवा 2 समाधान के 100 μL जोड़ें।
  7. प्रत्येक कुएं से 100 माइक्रोन लेकर पंक्ति जी से पंक्ति बी तक क्रमिक रूप से पतला करें और अंत में पंक्ति बी के कुओं से 100 माइक्रोन को त्यागें।
  8. आठ प्लेटें तैयार करने के लिए 4.5, 4.6, और 4.7 कदम दोहराएं।

5. चार पैनलों के लिए दवा 2 का स्थानांतरण

  1. चार पैनलों में प्रत्येक प्लेट में इसी कुओं में पंक्तियों जी और बी के बीच कुओं से दवा 2 के पिपेट 50 माइक्रोन। एक तैयार ९६-अच्छी तरह से प्लेट दवा 2 के १०० μL है कि एक पैनल में दो प्लेटों के लिए पर्याप्त है शामिल हैं ।

6. दवा 3, लेवोफ्लोक्सासिन, इसके अलावा

  1. चार अलग-अलग शंकु नलियों में, बाँझ डीएच2ओ के 14 एमएल जोड़ें।
  2. फॉर्मूला सी 1वी 1 = सी 2 वी2केबाददवा के स्टॉक समाधान से निकाले जाने वाले वॉल्यूम की गणना करें । इस प्रकार, V1 = (C2 x 14 mL)/C1।
    नोट: हमारे मामले में, Levofloxacin 5 x 103 μg/mL के एक शेयर समाधान से चार अलग सांद्रता में तैयार है ।
    C1 = 2 μg/mL, V1 = 5.6 μL
    C2 = 4 μg/mL, V1 = 11.2 μL
    C3 = 8 μg/mL, V1 = 22.4 μL
    C4 = 16 μg/mL, V1 = 44.8 μL
  3. प्रत्येक ट्यूब से बाँझ डीएच2ओ के 14 एमएल से गणना की गई मात्रा निकालें, और फिर दवा जोड़ें।
  4. तीसरी दवा की आवश्यक सांद्रता तैयार करने के बाद, 50 माइक्रोन लें और इसे प्रत्येक पैनल में संबंधित प्लेट में पंक्तियों बी और जी और कॉलम 2 और 12 के बीच संबंधित कुओं में जोड़ें जहां C1 चार पैनलों में चार P1 प्लेटों से मेल खाता है, C2 चार पैनलों में चार P2 प्लेटों से मेल खाता है , C3 चार पैनलों में चार P3 प्लेटों से मेल खाती है, और C4 चार पैनलों में चार P4 प्लेटों से मेल खाती है ।

7. दवा 4, Trimethoprim-sulfamethoxazole, इसके अलावा

  1. एक शंकु नली में, बाँझ डीएच2ओ के 14 एमएल जोड़ें।
  2. फॉर्मूला सी 1वी 1 = सी 2 वी2केबाददवा के स्टॉक समाधान से निकाले जाने वाले वॉल्यूम की गणना करें । इस प्रकार, V1 = (C2 x 14 mL)/C1।
    नोट: हमारे मामले में, trimethoprim-sulfamethoxazole 48 x 103 μg/mL के एक शेयर समाधान से चार अलग सांद्रता में तैयार किया जाता है ।
    C1 = 512 μg/mL, V1 = 149.33 माइक्रोन
    C2 = 1024 μg/mL, V1 = 298.66 μL
    C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597.33 माइक्रोन
    C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194.66 μL
  3. प्रत्येक ट्यूब के बाँझ डीएच2ओ के 14 एमएल से गणना की गई मात्रा निकालें, और फिर दवा जोड़ें।
  4. चौथी दवा की आवश्यक सांद्रता तैयार करने के बाद, 50 माइक्रोन लें और इसे संबंधित पैनल में चार प्लेटों में पंक्तियों बी और जी और कॉलम 2 और 12 के बीच संबंधित कुओं में जोड़ें जहां C1 पैनल 1 से मेल खाता है, C2 पैनल 2 से मेल खाता है, C3 पैनल 3 से मेल खाता है, और C4 पैनल 4 से मेल खाता है।

8. तैयारी और बैक्टीरियल इनोकुलम ई. कोलाई ESBL के अलावा

  1. बाँझ पाश का उपयोग करना, बैक्टीरियल आइसोलेट ई. कोलाई ESBL के एक कॉलोनी को पहले बाँझ एमएचबी और भंवर के 2 एमएल में एक प्लेट पर सुसंस्कृत स्थानांतरित करें।
  2. टर्बिडिटी की जांच करें जहां घनत्व का उपयोग करके 0.5 मैकफार्लैंड होना चाहिए।
  3. बाँझ एमएच शोरबा के 80 एमएल को बाँझ मूत्र कप में जोड़ें।
  4. सी1वी 1 = सी 2 वी2के बाद मूत्र कप में 0.5 मैकफार्लैंड इनोकुलम से बैक्टीरियल इनोकुलमजोड़ें,जहां वी1 = (106 x 80 एमएल) / 108 = 800 μL।
  5. पिपेट 50 μl inoculum समाधान 10 6 सीएलयू/एमएल प्रत्येक कुएं में H12 को छोड़कर, जो बंध्याकरण नियंत्रण अच्छीतरह से है।
  6. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर पैनलों को इनक्यूबेट करें।
  7. इनक्यूबेशन के बाद, कुओं में वृद्धि दर्ज करने के लिए इओडोटेट्राजोलियम के 50 माइक्रोन जोड़ें।

9. एफआईसी टेम्पलेट के लिए प्रोटोकॉल (पूरक फ़ाइल)

  1. पैनल ए में येलो सेल में ड्रग 1 (सेफोटैक्सिम) की उच्चतम एकाग्रता लिखें।
  2. पैनल बी में येलो सेल में ड्रग 2 (अमीकासिन) की सबसे ज्यादा सांद्रता लिखें।
  3. पैनल सी में पीले सेल में दवा 3 (लेवोफ्लोक्सासिन) की उच्चतम एकाग्रता लिखें।
  4. पैनल डी में दवा 4 (ट्राइमेटहोरिम-सल्फामेथॉक्साजोल) की उच्चतम एकाग्रता लिखें।
  5. लाल रंग में वृद्धि वाले कुओं को उजागर करके रेडलाइन (ग्रोथ/नो ग्रोथ इंटरफेस) का पता करें ।
  6. दवा 1 (एटीबी1) की तालिका में दवा 1 की एमआईसी लिखें।
  7. दवा 2 (एटीबी2) की टेबल में ड्रग 2 का एमआईसी लिखें।
  8. दवा 3 (एटीबी3) की टेबल में ड्रग 3 की एमआईसी लिखें।
  9. ड्रग 4 की एमआईसी को ड्रग 4 (एटीबी4) की टेबल में लिखें।
  10. ATB1 के लिए FIC की गणना करने के लिए
    1. विकास/कोई विकास इंटरफेस पर कुओं का निर्धारण करें ।
    2. तालिका ATB1 में, FIC1 के बगल में सेल पर डबल क्लिक करें और पैनल ए के बाईं ओर पीले सेल को पहले चयनित अच्छी तरह से खींचें।
    3. हर चयनित अच्छी तरह से जहां अच्छी तरह से 1 FIC1 से मेल खाती है के लिए कदम 9.10.2 दोहराएं, अच्छी तरह से 2 FIC2 से मेल खाती है, और इतने पर।
  11. ATB2 के लिए FIC की गणना करने के लिए
    1. टेबल ATB2 में, FIC1 के बगल में सेल पर डबल क्लिक करें और पैनल बी के बाईं ओर पीले सेल को पहले पूर्व चयनित अच्छी तरह से खींचें ।
    2. हर पूर्व चयनित अच्छी तरह से के लिए कदम 9.11.1 दोहराएं।
  12. ATB3 के लिए FIC की गणना करने के लिए
    1. टेबल ATB3 में, FIC1 के बगल में सेल पर डबल क्लिक करें और पैनल सी के बाईं ओर पीले सेल को पहले पूर्व चयनित अच्छी तरह से खींचें।
    2. हर पूर्व चयनित अच्छी तरह से के लिए कदम 9.12.1 दोहराएं।
  13. ATB4 के लिए FIC की गणना करने के लिए
    1. तालिका ATB4 में, FIC1 के बगल में सेल पर डबल क्लिक करें और पैनल डी के बाईं ओर पीले सेल को पहले पूर्व चयनित अच्छी तरह से खींचें।
    2. हर पूर्व चयनित अच्छी तरह से के लिए कदम 9.13.1 दोहराएं।
  14. ATB1+ 2 +3 +4 लेबल वाली तालिका में, प्रत्येक एटीबी के FIC1 को स्वचालित रूप से योग करें। अन्य एफआईसी (FIC2, FIC3, और इतने पर) के लिए भी ऐसा ही होगा।
    1. एफआईसी युक्त सेल में और पीले रंग में हाइलाइट किया गया, उस पर डबल क्लिक करें और टेबल ATB1 + 2 + 3 + 4 से अभिव्यक्त ΣFICs का चयन करें।
  15. नौ प्लेटों का प्रतिनिधित्व करने वाली नौ चादरों में से प्रत्येक के लिए इन चरणों को दोहराएं।
    नोट: शीट FIC सभी में, तालिका प्राप्त मूल्य की व्याख्या के साथ अंतिम अभिव्यक्त FIC दिखाएगा ।

10. चार दवाओं के लिए माइक्रोडिल्यूशन परख का उपयोग कर MIC दृढ़ संकल्प

  1. प्रत्येक परीक्षण दवा के संक्षिप्त नाम के साथ चार अलग-अलग पंक्तियों को लेबल करें। उदाहरण के लिए, सेफोटैक्सिम के लिए सीटीएक्स, अमिकासिन के लिए एएमके, लेवोफ्लोक्सासिन के लिए लेवो, और ट्राइमेटहोप्रिम-सल्फामेथॉक्साजोल के लिए एसएक्सटी।
  2. पिपेट 200 μL बाँझ मुलर हिंटन शोरबा अच्छी तरह से नंबर 1 में और अच्छी तरह से संख्या 12 प्रत्येक इस्तेमाल पंक्ति में। अच्छी तरह से संख्या 12 नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से काम करेगा।
  3. प्रत्येक प्रयुक्त पंक्ति में 11 तक 2 कुओं के लिए बाँझ मुलर हिंटन शोरबा के पिपेट 100 माइक्रोन।
  4. फॉर्मूला सी 1वी 1 = सी 2 वी2का उपयोग करके जोड़े जाने वाले प्रत्येक दवा की मात्रा की गणना करें । इस प्रकार, V1 = (C2 x 4 x V2)/ C1. वी2 कुओं में अंतिम मात्रा है जो 200 माइक्रोन है, सी1 स्टॉक समाधान की एकाग्रता है, और सी2 प्रारंभिक एकाग्रता है जो हमें पहले कुएं में होना चाहिए।
    नोट: यहां, हम निम्नलिखित का उपयोग करते हैं:
    Cefotaxime: सी1 = 105 μg/mL, जहां हम इसे 104 μg/mL, सी 2 =256 μg/mL को पतला; इस प्रकार, वी1 = 20.48 माइक्रोल
    Amikacin: सी1 = 103 μg/mL, सी2 = 64 μg/mL; इस प्रकार, V1 = 51.2 माइक्रोन
    लेवोफ्लोक्सेसिन: सी1 = 5 x 103 μg/mL, जहां हम इसे 5 x 102 μg/mL, C2 = 16 μg/mL; इस प्रकार, वी1 = 25.6 माइक्रोल
    Trimethoprim-Sulfamethoxazole: सी1 = 48 x 103 μg/mL, सी2 = 4096 μg/mL; इस प्रकार, V1 = 68.26 μL
  5. दवा के अलावा 200 माइक्रोन शोरबा से एक ही मात्रा को हटाने के बाद इसी पंक्ति के पहले कुएं में प्रत्येक दवा के लिए आवश्यक मात्रा पिपेट।
  6. अच्छी तरह से 1 से अच्छी तरह से 1 में 100 μL को हटाकर क्रमिक रूप से पतला और इतने पर अच्छी तरह से 10 तक पहुंचने तक जहां अच्छी तरह से 10 से हटा दिया गया 10 μL खारिज कर दिया जाएगा। ध्यान दें कि अच्छी तरह से 11 सकारात्मक नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से कार्य करता है ।
  7. पिपेट 10 6 के μL प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक अच्छीतरह से तैयार जीवाणु इनोकुलम अच्छी तरह से संख्या 12 नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवारत के अलावा ।
  8. रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 2 ए लेवोफ्लोक्सासिन और ट्राइमेथोरिम-सल्फामेथॉक्साजोल की विशिष्ट सांद्रता के साथ सेफोटैक्सिम और अमिकासिन के संयोजन से प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है। हम आकृति के बाएं हिस्से में चार प्लेटें देख सकते हैं जो आकृति के दाहिने हिस्से में दवाओं की सांद्रता के साथ योजनाबद्ध ढंग से प्रस्तुत की जाती हैं। तीर विकास/कोई विकास इंटरफेस पर कुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । रंगीन कुएं वे कुएं हैं जिनमें विकास होता है। हम देखते हैं कि चौथी प्लेट में संयोजन युक्त चतुर्भुज में वृद्धि नहीं होती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि इस प्लेट में हमारे पास लेवोफ्लोक्सासिन का एमआईसी है जो विकास को बाधित करेगा। इस आंकड़े में हम देख सकते हैं कि सेफोटैक्सिम का एमआईसी वेल ए8 में प्राप्त किया जाता है, जो 32 माइक्रोग्राम/एमएल के बराबर है। अमिकसिन का एमआईसी वेल ई1 में प्राप्त किया जाता है, जो 16 माइक्रोग्राम/एमएल के बराबर होता है। ट्राइमेटहोरिम-सल्फामेथॉक्साजोल के 1/8 एमआईसी के अलावा सेफोटैक्सिम और लेवोफ्लोक्सासिन के कई उप-इसके अलावा एमिकासिन (पंक्ति डी) के 1/2 एमआईसी युक्त पंक्ति में अवरोध प्रभाव देखा जाता है। सबमिक सांद्रता युक्त कुओं में जीवाणु विकास का यह अवरोध चार दवाओं की इन सांद्रता के बीच तालमेल का एक रूप हो सकता है ।

चित्रा 2B लेवोफ्लोक्सासिन और ट्राइमेथोरिम-सल्फामेथॉक्साजोल की विशिष्ट सांद्रता के साथ सेफोटैक्सिम और अमिकासिन के संयोजन से प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है। हम आकृति के बाएं हिस्से में चार प्लेटें देख सकते हैं जो आकृति के दाहिने हिस्से में दवाओं की सांद्रता के साथ योजनाबद्ध ढंग से प्रस्तुत की जाती हैं। तीर विकास/कोई विकास इंटरफेस पर कुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । रंगीन कुएं वे कुएं हैं जिनमें विकास होता है। चौथी थाली के लिए एक ही व्याख्या का पालन करें । इस आंकड़े द्वारा प्रतिनिधित्व पैनल में, हम देख सकते हैं कि बैक्टीरियल विकास का अवरोध पैटर्न पंक्ति डी में भी हुआ, जहां कुओं में सेफोटैक्सिम और लेवोफ्लोक्सेसिन के उपमिक्स, अमिकासिन के 1/2 एमआईसी और ट्राइमेटहोप्रिम-सल्फामेथॉक्सकोल के 1/4 एमआईसी शामिल हैं ।

चित्रा 2C लेवोफ्लोक्सासिन और ट्राइमेथोप्रिम-सल्फामेथॉक्साजोल की विशिष्ट सांद्रता के साथ सेफोटैक्सिम और अमिकासिन के संयोजन से प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है। हम आकृति के बाएं हिस्से में चार प्लेटें देख सकते हैं जो आकृति के दाहिने हिस्से में दवाओं की सांद्रता के साथ योजनाबद्ध ढंग से प्रस्तुत की जाती हैं। तीर विकास/कोई विकास इंटरफेस पर कुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । रंगीन कुएं वे कुएं हैं जिनमें विकास होता है। चौथी थाली के लिए एक ही व्याख्या का पालन करें । इस पैनल में अवरोध पैटर्न के लिए के रूप में, हम देख सकते है कि पंक्तियों में सी और डी विकास नहीं देखा जाता है । इसका मतलब यह है कि कुओं में ट्राइमेटहोप्रिम-सल्फामेथोक्साजोल के 1/2 एमआईसी और 1/4 एमआईसी और अमिकासिन के 1/2 एमआईसी के अलावा सेफोटैक्सिम और लेवोफ्लोक्सिन के कई सबमिक्स होते हैं ।

चित्रा 2D लेवोफ्लोक्सासिन और ट्राइमेथोप्रिम-सल्फामेथॉक्साजोल की विशिष्ट सांद्रता के साथ सेफोटैक्सिम और अमिकासिन के संयोजन से प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है। हम आकृति के बाएं हिस्से में चार प्लेटें देख सकते हैं जो आकृति के दाहिने हिस्से में दवाओं की सांद्रता के साथ योजनाबद्ध ढंग से प्रस्तुत की जाती हैं। तीर विकास/कोई विकास इंटरफेस पर कुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । चौथी थाली के लिए एक ही व्याख्या का पालन करें । हम देख सकते हैं कि केवल पंक्ति ए और कॉलम 1 में हमारे पास रंगीन कुओं का अर्थ है विकास। ऐसा इसलिए है क्योंकि इस पैनल में हमारे पास ट्राइमेथोप्रिम-सल्फेमेथोक्साजोल का एमआईसी है जो विकास को पूरी तरह से बाधित करेगा।

Figure 1
चित्रा 1:क्यू-चेकरबोर्ड सेटअप और पैनलों का योजनाबद्ध और दवाओं को कैसे जोड़ा जाता है इसका एक नक्शा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:परीक्षण में प्राप्त प्रायोगिक परिणाम 1 कुछ संयोजनों के लिए परीक्षण किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

चौगुनी चेकरबोर्ड विधि चेकरबोर्ड और इसके प्रोटोकॉल में तीन आयामी चेकरबोर्ड जैसा दिखता है। हालांकि, प्रयोग के दौरान त्रुटियों से बचने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम ों को ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले परीक्षण किए गए अलग-थलग के खिलाफ प्रत्येक दवा के एमआईसी के लिए परीक्षण करना सुनिश्चित करें कि दवा 1 और दवा 2 के लिए कमजोर करने के लिए आवश्यक सांद्रता क्या है जिन्हें प्लेटों में क्रमिक रूप से पतला करने की आवश्यकता है। दवा 3 और दवा 4 के संबंध में, एमआईसी को परीक्षण के लिए आवश्यक सांद्रता की गणना करने के लिए भी जाना चाहिए (1/8 एमआईसी, 1/4 एमआईसी, 1/2 एमआईसी, और एमआईसी)। एमआईसी निर्धारित करने के लिए बहुत सारे तरीके हैं, फिर भी सबसे अच्छा माइक्रोडिल्यूशन तकनीक के साथ इसे निर्धारित करना है क्योंकि क्यू-चेकरबोर्ड प्रोटोकॉल सीरियल कमजोर पड़ने के लिए माइक्रोडिल्यूशन परख का भी उपयोग करता है।

पहले चरण में, प्लेटों को टेप करते समय, सुनिश्चित करें कि बेंच साफ है और प्रदूषण से बचने के लिए बाँझ कवर के साथ प्लेटों को कवर करें। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल को चार पैनलों का प्रतिनिधित्व करने वाली चार 96-अच्छी प्लेटों का उपयोग करके किया जा सकता है, जहां प्रत्येक प्लेट को चार छोटे क्वाड्रंट में विभाजित किया जाता है। हालांकि, पहली और दूसरी दवा के लिए कमजोर पड़ने की संख्या को कम किया जाएगा। इसके अलावा, कोई भी चार प्लेटों को एक साथ टेप करने के बजाय गहरे कुएं की ३८४-अच्छी प्लेटों का उपयोग कर सकता है । हालांकि, जब हमने प्रयोग किए तो यह उपलब्ध नहीं था । ध्यान दें कि उपयोग की जाने वाली प्लेट को चुनते समय, प्रत्येक की क्षमता की जांच करना सुनिश्चित करें क्योंकि अच्छी तरह से अंतिम मात्रा 250 माइक्रोल होगी।

इसके अलावा, प्रत्येक पैनल में प्लेटों की संख्या और पैनलों की संख्या तीसरी और चौथी दवा के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने की संख्या पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, इस प्रयोग में, तीसरी दवा के चार कमजोर पड़ने और चौथी दवा के चार कमजोर पड़ने की आवश्यकता थी (1/8 एमआईसी, 1/4 एमआईसी, 1/2 एमआईसी, और एमआईसी); इस प्रकार, हमारे पास प्रत्येक पैनल में चार प्लेटें थीं और चार पैनल थे।

पहली दवा का कमजोर पड़ने कॉलम के अनुसार पैनलों की प्लेटों में होता है। हालांकि, दूसरी दवा का कमजोर पड़ने पंक्तियों के अनुसार अलग प्लेटों में होता है। तीसरी और चौथी दवाओं को क्रमिक रूप से पतला नहीं किया जाता है। हालांकि, उपयोग की जाने वाली प्रत्येक एकाग्रता एक अलग ट्यूब में तैयार की जाती है और प्रत्येक को एक विशिष्ट मात्रा में अच्छी तरह से जोड़ा जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि चार दवाओं वाले कुएं पंक्तियों जी और बी और कॉलम 2 और 12 के बीच ही चतुर्भुज में मौजूद हैं। चेकरबोर्ड और त्रि-आयामी चेकरबोर्ड प्रोटोकॉल को इस पांडुलिपि में फिल्माया या लिखा नहीं गया था क्योंकि वे प्रोटोकॉल ज्ञात हैं और इस पांडुलिपि का उद्देश्य क्यू-चेकरबोर्ड प्रोटोकॉल के बारे में बात करना है। चेकरबोर्ड तकनीक में, पंक्ति ए में केवल दवा 1 शामिल है; इस प्रकार, दवा 1 के एमआईसी दिखा रहा है। कॉलम 1 में केवल दवा 2 शामिल है; इस प्रकार, दवा 2 के एमआईसी दिखा रहा है।

इस अवधारणा को क्यू-चेकरबोर्ड प्रोटोकॉल में रखा गया है जहां दवा 1 का एमआईसी अभी भी पंक्ति ए में दिखाया गया है और दवा 2 की एमआईसी अभी भी कॉलम 1 में दिखाई गई है। इसके अलावा, दोनों जोड़ा दवाओं प्रयोग में अपने MIC मौजूद हैं । दवा 3 प्रत्येक पैनल में P4 प्लेट है जहां दवा 3 के MIC सभी कुओं में जोड़ा जाता है तो हम इस थाली में विकास का पालन नहीं करना चाहिए । इसी तरह, ड्रग 4 में ए4 पैनल है जहां ड्रग 4 की एमआईसी पैनल 4 में सभी प्लेटों में सभी कुओं में जोड़ा जाता है इसलिए इस पैनल में कोई वृद्धि नहीं देखी जानी चाहिए।

प्लेटों में वृद्धि कुओं में टर्बिडिटी के आधार पर दर्ज की जाती है, जहां टर्बिड कुओं में वृद्धि मानी जाती है। टर्बिडिटी के अलावा, इओडोटेट्राज़लियम के 50 माइक्रोन जोड़े जाते हैं और कुछ मिनटों के लिए छोड़ दिया जाता है। गुलाबी रंग में बदलाव का मतलब है कि विकास होता है।

इस विधि की कुछ सीमाएं हैं। इसके लिए कड़ी मेहनत और फोकस की जरूरत होती है। पाइपिंग त्रुटियां हो सकती हैं क्योंकि यह तकनीक मुख्य रूप से पिपटिंग पर आधारित है। FIC गणना इस मामले में एक सीमा माना जाता है क्योंकि हम चार मूल्यों के साथ काम कर रहे है दो या तीन नहीं । एक मूल्य जोड़ने से एफआईसी के मूल्य में अच्छी तरह से वृद्धि होगी; इस प्रकार, एफआईसी के मूल्यों पर पुनर्विचार किया जाना चाहिए जो तालमेल, उदासीनता और विरोध को निर्धारित करते हैं।

एफआईसी मूल्य उन मानकों से संबंधित कई संदर्भों के बीच बदल सकते हैं जिनके द्वारा सहक्रियावाद, विरोध और उदासीनता को परिभाषित किया गया है। कुछ संदर्भों में कहा गया है कि 0.5 और उससे कम का एफआईसी को तालमेल13माना जाता है , जबकि अन्य में कहा गया है कि 0.8 से कम एफआईसी को सहक्रियावाद माना जाता है16. एक अन्य संदर्भ में कहा गया है कि 1 से कम एफआईसी को तालमेल माना जाता है17. अस्थिरता और सहक्रियता के एक एकीकृत मानक FIC को परिभाषित करने में संघर्ष के कारण, हम 1 हमारे संदर्भ माना जाता है ।

अंतिम एफआईसी की गणना प्रत्येक प्लेट (9 एफआईसी) के एफआईसी मूल्यों को जोड़कर और इसे प्लेटों की संख्या से विभाजित करके की जाती है जो 9 है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पैनल 4 को परिणामों में नहीं माना जाता है क्योंकि इसमें चौथी दवा का एमआईसी होता है इसलिए अवरोध एक ही दवा का काम होगा। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक पैनल में प्लेट 4 पर भी विचार नहीं किया जाता है क्योंकि इसमें दवा 3 का एमआईसी होता है जहां इस प्लेट में अवरोध अकेले दवा 3 का कार्य होगा। इस प्रकार, हम 9 प्लेटों (16 - (4 + 3)) के साथ समाप्त होते हैं।

प्रत्येक प्लेट के लिए, एफआईसी की गणना निम्नलिखित सूत्र के अनुसार विकास/नो ग्रोथ इंटरफेस पर कुओं के लिए की जाती है: (दवा के एमआईसी 1 संयोजन में/ इसके बाद प्राप्त संख्या को 4 से विभाजित किया जाता है। यह फार्मूला एक ही प्लेट में विकास/कोई विकास इंटरफेस पर प्रत्येक अच्छी तरह से किया जाता है । फिर, एक ही प्लेट के सभी FICs को इस प्लेट के एफआईसी प्राप्त करने के लिए एक साथ अभिव्यक्त किया जाता है। अंत में, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, प्रत्येक प्लेट के 9 अंतिम एफआईसी को अंतिम एफआईसी प्राप्त करने के लिए 9 से जोड़ा और विभाजित किया जाता है जिसकी व्याख्या की जाएगी।

1 से कम एफआईसी को सहक्रियात्मक माना जाता है जहां इसमें कुछ हद तक तालमेल होता है: यह या तो थोड़ा सहक्रियात्मक (एक के करीब) या अधिक सहक्रियात्मक है (जब यह 0.5 और उससे कम की ओर बढ़ता है)। यह गणना और व्याख्या केवल एक एफआईसी टेम्पलेट का उपयोग करके की जाती है जिसे हमने विकसित किया है। हम सिर्फ सांद्रता दर्ज करते हैं, एफआईसी की गणना करने के लिए विकास/कोई विकास इंटरफेस पर कुओं को चुनते हैं, और हम अंतिम एफआईसी प्राप्त करेंगे जिसकी व्याख्या उल्लिखित मानदंडों के अनुसार की जाती है ।

यह विधि सभी संभावित संयोजनों के परीक्षण की अनुमति देती है जो एक प्रयोग में चार दवाओं का उपयोग करके किया जा सकता है जो एक दिन में किया जा सकता है। परिणाम अगले दिन प्राप्त कर रहे हैं। जबकि, समय तक वक्र परख को मारने, अधिक समय, काम सामग्री, और प्रयोगशाला श्रमिकों के संयोजन की एक ही संख्या का परीक्षण करने की जरूरत है, के बाद से संयोजन के प्रत्येक सेट एक ही ट्यूब या कप में अकेले परीक्षण किया जाता है यह समय लेने वाला बना । इस विधि का उपयोग न केवल जीवाणुरोधी दवा संयोजनों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि बीमारियों के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली सभी प्रकार की दवाओं का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है और संयोजन में परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। इसका उपयोग दवाओं और पौधे के अर्क या यहां तक कि केवल पौधे के अर्क के संयोजन का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है। मुद्दा यह है कि इस विधि का उपयोग न केवल विशिष्ट दवाओं का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि वह सब कुछ जो संयुक्त किया जा सकता है।

कई सीमाएं इस विधि के साथ हैं। इस परख और धारावाहिक कमजोर पड़ने के दौरान होने वाली किसी भी त्रुटि को करने के दौरान पिपटिंग कौशल बहुत महत्वपूर्ण हैं, परिणामों को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं और झूठे नकारात्मक या झूठे सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं। इस प्रकार, पाइपिंग मशीनों और रोबोटों के बारे में कोई भी तकनीकी प्रगति इस परख को करने में बहुत मदद करेगी। इस विधि के लिए बहुत सारी गणनाओं और कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है ताकि कोई भी त्रुटि परिणामों के परिणाम को बदल सके। यह तकनीक केवल निषेध प्रभाव पर अंतर्दृष्टि प्रदान करती है न कि हत्या प्रभाव। यह तकनीक एक ही समय बिंदु पर अवरोध का अध्ययन करती है न कि समय के साथ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 µL tips Citotest 4330000402
200 µL tips Citotest 4330-0013-17
50 mL centrifuge tube corning 430828 For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube Falcon 352058 For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes JRZ Plastilab As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates corning 3596 For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France 10177403 Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime) PHARCO Pharmaceuticals 24750/2006 Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar BIO-RAD 64169508 For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) HIKMA Pharmaceuticals 2BXMIA56N-AEF Drug 2
Muller-Hinton Broth BIO-RAD 69444 For making bacterial media
Multichannel Pipette Thermo Scientific GJ54761 For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes Thermo Scientific OH19855 HH40868 For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) sanofi aventis 221937/2009 Drug 3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
  2. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
  3. Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
  4. Nathan, C. Antibiotics at the crossroads. Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).
  5. Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
  6. Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
  7. Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
  8. Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
  9. Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
  10. Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
  11. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  12. Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
  13. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  14. Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
  15. Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
  16. Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
  17. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).

Tags

जीव विज्ञान अंक 173 एंटीबायोटिक संयोजन चेकरबोर्ड चार दवाओं बातचीत
चौगुनी-चेकरबोर्ड: ड्रग कॉम्बिनेशन का अध्ययन करने के लिए त्रि-आयामी चेकरबोर्ड का संशोधन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Isber, C., Stockman, D. L., Daoud,… More

Isber, C., Stockman, D. L., Daoud, Z. Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations. J. Vis. Exp. (173), e62311, doi:10.3791/62311 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter