Summary
Ett protokoll presenteras för att extrahera det totala lipidinnehållet i cellväggen i ett brett spektrum av mykobakterier. Dessutom visas extraktions- och analysprotokoll för de olika typerna av mykolicsyror. Ett kromatografiskt protokoll i tunt lager för att övervaka dessa mykobakteriella föreningar tillhandahålls också.
Abstract
Mykobakterier kan skilja sig från varandra i tillväxthastighet, närvaro av pigmentering, kolonimorfologin som visas på fasta medier, liksom andra fenotypiska egenskaper. Men de har alla gemensamt den mest relevanta karaktären av mykobakterier: dess unika och mycket hydrofobiska cellvägg. Mykobakterier innehåller ett membrankovalent länkat komplex som innehåller arabinogalactan, peptidoglykan och långa kedjor av mykolicsyror med typer som skiljer sig mellan mykobakterier. Dessutom kan mykobakterier också producera lipider som är belägna, icke-kovalent kopplade, på deras cellytor, såsom fothiocerol dimycocerosates (PDIM), fenollykolpolider (PGL), glykopeptidolipids (GPL), akryltrehaloser (AT) eller fosfatidil-inositol mannosides (PIM), bland andra. Vissa av dem anses vara virulensfaktorer i patogena mykobakterier, eller kritiska antigena lipider i värd-mycobacteria interaktion. Av dessa skäl finns det ett betydande intresse för studier av mykobakteriella lipider på grund av deras tillämpning inom flera områden, från att förstå deras roll i patogeniciteten av mykobakteriinfektioner, till en möjlig implikation som immunmodulerande medel för behandling av infektionssjukdomar och andra patologier som cancer. Här presenteras ett enkelt tillvägagångssätt för att extrahera och analysera det totala lipidinnehållet och mykolicsyrasammansättningen av mykobaktericeller som odlas i ett fast medium med blandningar av organiska lösningsmedel. När lipidextrakten har erhållits utförs tunnskiktskromatografi (TLC) för att övervaka de extraherade föreningarna. Exempelexperimentet utförs med fyra olika mykobakterier: den miljösnabba Mycolicibacterium brumae och Mycolicibacterium fortuitum, den försvagade långsamt växande Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) och den opportunistiska patogenen snabbväxande Mycobacterium abscessus, vilket visar att metoder som visas i detta protokoll kan användas till ett brett spektrum av mykobakterier.
Introduction
Mycobacterium är ett släkte som består av patogena och icke-patogena arter, kännetecknad av att ha en mycket hydrofobisk och ogenomtränglig cellvägg som bildas av deras säregna lipider. Specifikt innehåller mykobakteriella cellväggen mykolicsyror, α-alkyl- och β hydroxifettsyror, där α-grenen är konstant i alla mykolicsyror (med undantag för längden) och β-kedjan, kallad meromycolatekedjan, är en lång alifatisk kedja som kan innehålla olika funktionella kemiska grupper som beskrivs tillsammans med litteraturen (α-, α'-, metoxi-, κ-, epoxi-, karboxyr- och ω-1-methoxy- mykolater), vilket producerar sju typer av mykolicsyror (I-VII)1. Dessutom finns andra lipider med obestridlig betydelse också i cellväggen hos mykobakterier. Patogena arter som Mycobacterium tuberculosis, orsaksmedlet för tuberkulos2 producera specifika lipidbaserade virulensfaktorer såsom phthiocerol dimycocerosates (PDIMs), fenolisk glykolpid (PGL), di-, tri- och penta-acyltrehaloser (DAT, TAT och PAT), eller sulfolipids, bland andra3. Deras närvaro på mykobakteriella ytan har associerats med förmågan att modifiera värdens immunsvar och därför utvecklingen och persistensen av mykobakteriet inuti värden4. Förekomsten av triacylglyceroler (TAG) har till exempel associerats med den hypervirulenta fenotypen av härstamning 2-Peking-under härstamning av M. tuberculosis, möjligen på grund av dess förmåga att dämpa värdens immunsvar5,6. Andra relevanta lipider är lipooligosackarider (LOSs) som förekommer i tuberkulös och icke-skrupelfri mykobakterier. När det gäller Mycobacterium marinum, är närvaron av LOSs i sin cellvägg relaterad till glidande motilitet och förmågan att bilda biofilmer och stör igenkänning av makrofagmönsterigenkänningsreceptorer, vilket påverkar upptag och eliminering av bakterierna genom värdfostcyter7,8. Dessutom tillåter frånvaron eller närvaron av vissa lipider medlemmar av samma art att klassificeras i olika morfotyper med virulenta eller dämpa profiler när de interagerar med värdceller. Till exempel frånvaron av glykopeptidolipids (GPL) i den grova morfotypen av Mycobacterium abscessus har associerats med förmågan att inducera intraphagosomal försurning, och följaktligen cell apoptos9, till skillnad från den släta morfotypen som har GPLs i deras yta. Dessutom är lipidinnehållet i mykobakteriella cellväggen relaterat till förmågan att modifiera immunsvaret i värden. Detta är relevant i samband med att använda vissa mykobakterier för att utlösa en skyddande immunprofil mot olika patologier10,11,12,13. Det har till exempel visats att Mycolicibacterium vaccae, visar ett saprofytiskt mykobakterie, som för närvarande är i kliniska fas III-studier som ett immunoterapeutiskt vaccin mot tuberkulos, två koloniala morfotyper. Medan den släta fenotypen, som innehåller en polyester i ytan, utlöser ett Th2-svar, kan den grova fenotypen utan polyester inducera en Th1-profil när den interagerar med värd immunceller14. Repertoaren av lipider som finns i mykobakteriella cellen beror inte bara på mykobakterier, men också på villkoren för mykobakteriella kulturer: inkubationstid15,16 kulturmediets sammansättning eller sammansättning17,18. I själva verket påverkar förändringar i kulturens medelsammansättning antitumör- och immunstimulatorisk aktivitet hos M. bovis BCG och Mycolicibacterium brumae in vitro17. Dessutom kan den skyddande immunprofil som utlöses av M. bovis BCG mot M. tuberculosis utmaning i mössmodeller beror också på de kulturmedier där M. bovis BCG växer17. Dessa kan sedan relateras till lipidsammansättningen av mykobakterier i varje odlingsförhållande. Av alla dessa skäl är studien av lipidinnehållet i mykobakterier relevant. En visuell procedur för att extrahera och analysera lipid sammansättningen av mycobacterial cell väggen presenteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Extraktion av de totala icke-kovalskopplade lipiderna från mykobakterier (figur 1)
- Repa 0,2 g mykobakterier från ett fast medium och lägg till ett glasrör med en polytetrafluoreten (PTFE) liner skruvlock. Tillsätt en lösning bestående av 5 ml kloroform och 10 ml metanol (kloroform:metanol, 1:2).
OBS: När organiska lösningsmedel används ska endast glasmottagare användas. Inga plastbehållare är tillåtna. Dessutom behövs PTFE liner skruvkorkar för flaskor.
VARNING: Kloroform är ett potentiellt giftigt och extremt farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
VARNING: Metanol är ett potentiellt giftigt och extremt farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar). - Lämna röret i konstant omrörning över natten för att extrahera icke-kovalskopplade lipider från mykobakteriella cellytan.
OBS: Om en omloppsskakningsplattform inte är tillgänglig kan konstant omrörning ersättas med periodisk manuell omrörning så ofta som möjligt. - Täck en glastratt med ett filterpapper, filtrera de organiska lösningsmedjorna och samla dem i ett glasrör.
- Använd ett kvävegasflöde för att avdunsta vätskefasen i röret. Fyll röret med kvävegas, täck och förvara det vid 4 °C.
OBS: Anslut en pastörpipett i glas till kvävegasströmmen för att specifikt avdunsta önskat rör. Håll dessutom röret inuti en torr blockvärmare för rör vid 37 °C. När lösningsmedlet avdunstar fyller du röret med kvävegas innan du stänger det. - Tillsätt 15 ml av en lösning av kloroform:metanol (2:1) till cellavfallet. Lämna röret i konstant omrörning över natten för att extrahera icke-kovalskopplade lipider från mykobakteriella cellytan.
OBS: Om en omloppsskakningsplattform inte är tillgänglig kan konstant omrörning ersättas med periodisk manuell omrörning så ofta som möjligt. - Låt blandningen vila i 1 timme. Med en Pasteur-pipett, återvinn de organiska lösningsmedren. Täck en glastratt med ett filterpapper och filtrera de organiska lösningsmedjorna och samla dem i samma glasrör som tidigare användes i steg 1.3. Använd ett kvävegasflöde för att avdunsta vätskefasen i röret. Fyll röret med kvävegas, stäng det och förvara det igen vid 4 °C.
2. Mykolicsyraextraktion genom sur metanol (Figur 2A)
- Tillsätt 2-5 ml förestningslösning i ett hermetiskt glasrör med ett PTFE-linneskruvlock. Tillsätt 0,2 g mykobakteribiomassa i glasröret.
OBS: Esterifierande lösning bildas genom blandning av 30 ml metanol, 15 ml toluen och 1 ml svavelsyra. Mykobaktericeller kan tas från fasta kulturer eller, även från delipiderade celler efter att ha utfört extraktion av totala icke-kovalskopplade lipider från mykobakterier (återstående celler efter filtrering i steg 1. 6).
VARNING: Toluen är ett brandfarligt och extremt farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
VARNING: Svavelsyra är ett frätande och farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar). - Blanda innehållet genom att virvla. Låt blandningen stå inuti ett torrt bad vid 80 °C över natten.
- Låt röret svalna tills det når rumstemperaturen och tillsätt sedan 2 ml n-hexan till röret. Blanda innehållet genom att virvla i 30 s och låt röret sätta sig tills två klara faser visas.
VARNING: n-hexan är ett potentiellt brandfarligt, irriterande, miljöskadligt och extremt farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar). - Återställ den övre fasen som motsvarar n-hexanfasen. Överför det till ett nytt rör.
- Upprepa steg 2.3. Återställ den övre fasen igen och överför den till samma rör som används i steg 2.4.
- Avdunsta innehållet i röret med hjälp av ett kvävegasflöde. Fyll röret med kvävegas, stäng det och förvara det vid 4 °C.
3. Mykolicsyraextraktion genom förtvålning och metylering (Figur 2B)
- Skrapa 0,2 g mykobakterier från ett fast medium och lägg till ett glasrör med ett PTFE-skruvlock.
- Tillsätt 2 ml metanolbensenlösning (80:20) innehållande 5% kaliumhydroxid. Blanda innehållet genom att virvla. Värm blandningen i 3 timmar vid 100 °C.
VARNING: Bensen är ett brandfarligt, cancerframkallande och farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar). - Låt röret svalna till rumstemperatur. Tillsätt 20% svavelsyra för att försura proverna för att uppnå pH = 1.
- Tillsätt 3 ml dietyleter. Blanda försiktigt innehållet genom att virvla.
- Låt de två faserna bildas genom att lösa sig. Återställ dietyleterfasen och överför till ett nytt rör. Upprepa tvättsteget totalt tre gånger.
- Tvätta dietyleterextraktet med 2 ml destillerat vatten och överför den övre delen som motsvarar dietyletern till ett nytt rör. Upprepa tvättsteget totalt tre gånger.
- Tillsätt 2 g vattenfritt natriumsulfat över dietyleterextraktet för att torka det.
- Filtrera fjädringen. Avdunsta innehållet med hjälp av ett kvävegasflöde.
- För att utföra metyleringssteget, lös 3 g N-nitroso-N-metylurea i en förkyld lösning som bildas av 45 ml dietyleter och 9 ml 40% KOH i destillerat vatten.
VARNING: N-nitroso-N-metylurea är ett giftigt, irriterande, cancerframkallande och farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar). - Överför supernatanten (diazometan) till en ny kolv kyld i is som innehåller kaliumhydroxidpellets (ca 30 g).
OBS: Om supernatanten inte används omedelbart kan den förvaras vid -20 °C i högst 1 timme.
VARNING: Kaliumhydroxidpellets är ett irriterande och frätande ämne. Detta material måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
VARNING: Diazometan är mycket giftigt och potentiellt explosivt. Den måste användas i en laminär flödeshuv med säkerhetsglas som bär lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar). - Tillsätt 2 ml eterlösning som innehåller diazometan, erhållet i steg 3.10, i det torkade dietyleterextraktet som innehåller mykolitsyror, erhållna i steg 3.8. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Avdunsta suspensionen vid 40 °C. Fyll röret med kvävegas, stäng det och förvara de metylerade lipiderna vid 4 °C.
OBS: Avdunsta diazometanen från eterlösningen under laminärflödeshuven tills etern förlorar den gula färgen.
4. Analys av tunnskiktsk kromatografi (TLC)
- Mätta TLC-kammaren i glas. För att göra detta, täck en av väggarna i TLC-kammaren med ett filterpapper och låt det vara i kontakt med den mobila fasen som består av blandningen av lösningsmedel. Placera den återstående volymen av lösningsmedlet på botten av TLC-kammaren.
OBS: TLC-kammarens botten måste täckas av minst 1 cm av den mobila fasen. I de nuvarande experimenten användes olika mobila faser för att utveckla TLCs. De bestod av 85 ml n-hexan plus 15 ml dietyleter; 100 ml diklormetan; 90 ml kloroform, 10 ml metanol och 1 ml vatten. 30 ml kloroform, plus 8 ml metanol och 1 ml vatten. 60 ml kloroform, plus 35 ml metanol och 8 ml vatten. 95 ml kloroform plus 5 ml metanol; och 90 ml petroleumeter (60–80 °C) plus 10 ml dietyleter.
OBS: I den tvådimensionella TLC, använd n-hexane:aceton (95:5) i första riktningen tre gånger och använd en enda utveckling med toluen:aceton (97:3) i andra riktningen för att analysera mykolicsyrakomposition. För att analysera PIMs, använd kloroform: metanol:vatten (60:30:6) i första riktningen en gång och använd kloroform: ättiksyra:metanol:vatten (40:25:3:6) i andra riktningen. För att analysera PDIM och AG, använd petroleumeter (60-80 °C):etylacetat (98:2) i första riktningen tre gånger och använd en enda utveckling med petroleumeter (60-80 °C):aceton (98:2) i andra riktningen.
VARNING: Dietyleter är ett potentiellt giftigt och farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
VARNING: Diklormetan är ett potentiellt giftigt och farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
VARNING: Petroleumeter är ett potentiellt brandfarligt, miljöskadligt och extremt farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
VARNING: Ättiksyra är ett potentiellt brandfarligt och frätande ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
VARNING: Etylacetat är ett brandfarligt och farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
VARNING: Aceton är ett brandfarligt och farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar). - Stäng TLC-kammaren för att mätta den i minst 20 minuter. Lös under tiden upp lipiderna som finns i glasröret i 0,2-1 ml kloroform.
OBS: Volymen som används för att lösa upp lipiderna kan ändras beroende på önskad eller förväntad koncentration av provet. - Applicera 10 μL av varje fjädring med hjälp av ett kapillärglasrör direkt på TLC-plattan och låt provet torka i 5 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Prover måste appliceras på undersidan av plattan och lämna 1 cm på varje sida. Proverna skall separeras från varandra i minst 0,5 cm. När provet appliceras på plattan kan rören avdunsta igen med kvävegas och lagras vid 4 °C för vidare användning. - För in plattan i den mättade TLC-kammaren som innehåller den mobila fasen. Låt den mobila fasen gå igenom TLC:en.
OBS: Varje rörelse som appliceras på TLC-kammaren påverkar det rinnande lösningsmedlet på plattan och påverkar lipidrörligheten. Vid tvådimensionell TLC krävs två TLC-kammare för att innehålla båda elueringssystemen. - Ta bort plattan från TLC-kammaren när lösningsmedlet når 1 cm avstånd från plattans övre ände. Låt plattan vara under laminärt flöde tills kiseldioxiden är helt torkad.
OBS: Vid analys av mykolicsyrakompositionen, med n-hexan och dietetyleter (85:15), upprepa steg 4.4 och 4.5 två gånger mer, tills du kör mobilfasen tre gånger över TLC-plattan. - Avslöja plattan med önskad fläck; värm plattan vid behov.
OBS: I det aktuella experimentet användes 15-20 ml av följande lösningar för att spruta TLC-plattorna: 10% Molybdatofosforsyrahydrat i etanol tills plattan är ljusgul, följt av uppvärmning av plattan vid 120 °C; 5% i etanol på 20% α-naftatol i svavelsyra följt av uppvärmning av plattan vid 120 °C; MolybdenBlå reagens (1,3% molybdenoxid i 4,2 M svavelsyra) tills fosfatband uppträdde eller 1% antropon i svavelsyra.
VARNING: Molybdatofosforsyrahydrat är ett brandfarligt och frätande ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
VARNING: Etanol är ett potentiellt brandfarligt och farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
VARNING: 1-Naftol är ett brandfarligt, frätande och extremt farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
VARNING: Molybden Blue Spray Reagens är ett frätande, giftigt och extremt farligt ämne. Den måste användas i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning (laboratorierock, skyddsglasögon och nitrilhandskar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I syfte att visa ett brett spektrum av lipider närvarande i olika mycobacteria arter, M. bovis BCG valdes eftersom det är grov och långsamt växande mycobacteria. Den grova och snabbväxande M. fortuitum och M. brumae lades till i förfarandet och slutligen inkluderades också den släta morphotypen av M. abscessus. Dessa fyra arter tillåter oss att visualisera ett brett spektrum av mykobakterier-härledda lipider som acyltrehaloser (AT), GPLs, PDIM, PGL, PIM, TDM och TMM. Dessutom har alla fyra arter olika mykolicsyramönster.
Efter att ha utfört mykolicsyra extraktionsprotokoll analyserades lipid extrakt genom 1D-TLC analys med hjälp av två olika, lika giltiga, eluering system (Figur 3A, B). Den första mobila fasen (figur 3A) komponerades av n-hexan och dietyleter (85:15), och plattan var körd tre gånger. Den andra mobila fasen bestod av 100% diklormetan och plattan eluerades en gång (figur 3B). I båda elueringssystemen finns mykolicsyror ungefär i mitten av TLC-plattan från ursprunget till provapplikationen. Som figur 3 visar har M. brumae bara mykolicsyror av typ I, en mykolicsyra som finns i alla mykobakterier. M. bovis (M) BCG har typ I och IV, M. fortuitum typ I och V, och M. abscessus,typ I och II mykolic syror profiler. Att utföra två typer av metylering förfaranden tillåter oss att bekräfta förekomsten av typ V mykolic syra eftersom typ V mykolic syra klyvs under syra metanol förfarandet. Som figur 3 visar var först efter förtvålningsförfarandet den plats som motsvarade mykolicsyra av typ V som observerades. Efter metanol visade TLC de härledda föreningarna från typ V-klyvning som migrerade nära tillämpningspunkten19. För neofytforskare kan 2D-TLC möjliggöra en kompletterande metod för att identifiera varje mykolicsyratyp (Figur 3C,D). Mykolicsyraextrakt måste först köras i ett elueringssystem som bildas av petroleumeter (60-80 °C) och aceton (95:5) tre gånger. Därefter måste plattan köras i andra riktningen med en mobil fas som bildas av toluen och aceton (97:3). 2D-TLC i kombination med masspektrometri (MS) har använts för att identifiera och kemiskt karakterisera de funktionella grupperna av mykolicsyror och har använts i stor utsträckning för att karakterisera mykolicsyror20,21,22. Därför är mykolicsyra mönster en av de biokemiska funktionerna i värde i systematiska mycobacterial utvärdering i kombination med andra analyser på grund av att dela mycolic syra mönster mellan olika arter.
Efter att ha utfört ovannämnda förfarande för att extrahera icke-kovals länkade lipider valdes olika elueringssystem i funktion av polariteten och storleken på lipidprofilen som finns i mycobacteria celler. Den idealiska kombinationen av lösningsmedel i elueringssystemen bör göra det möjligt att visualisera önskade lipider i TLC-plattans mittzon för att underlätta deras ytterligare rening, om så önskas. I figur 4beställs TLC-plattor från elueringssystemet som gör det möjligt att övervaka de mest apolära lipider(figur 4A)till elueringssystemet som gör det möjligt att visualisera de mest polära lipiderna (figur 4E).
Ayl glyceroler (AG) och PDIMs är två av de mest apolära lipider som finns i mykobakteriella cellväggen och visualiseras enkelt genom 1D-TLC-analyser med hjälp av en mobil fas som bildas av petroleumeter:dietyleter (90:10). Figur 4A visar att AGs var närvarande i M. bovis BCG, M. fortuitum och M. brumae men inte i den släta morphotypen av M. abscessus. Även om 1D-TLC föreslog förekomsten av PDIM i M. bovis BCG och M. fortuitum,bekräftades det endast i M. bovis BCG när 2D-TLC analys utfördes (Figur 4B). Sammantaget visar dessa resultat vikten av att bekräfta förekomsten av en mycobacterial förening av minst två olika elueringssystem. En annan intressant lipid att analysera i mycobacteria komposition är PGL. I den valda mykobakterien finns PGL endast i M. bovis BCG, och det märks när TLC elueras med elueringssystemet bestående av kloroform och metanol (95:5) (Figur 4C). Efter idén att visualisera mer polära komponenter användes elueringssystemet bestående av blandningen av 90:10:1 (kloroform:metanol:vatten) för att övervaka förekomsten av GPLs (Figur 4D), som endast finns i M. abscessus smooth morphotype. I samma TLC: PGL, trehalose dimycolate (TDM), acyl trehaloses (AT) och trehalose monomycolate (TMM), kan också observeras. PGL, GPLs, TDM, AT observerades också högst upp på plattan när elueringssystemet bestod av 30:8:1 (kloroform: metanol:vatten) (Figur 4E). TMM ligger i mitten av plattan. TDM och TMM uttrycktes tydligt i alla mycobacteria studerade. Trots att fosfatidyl-inositol mannoider (PIMs) observeras längst ner på plattan, är det bästa elueringssystemet för att analysera PIMs 60:35:8 (kloroform: metanol:vatten) som visas i figur 5A,B. Medan alla sockerhaltiga lipider avslöjas med antropon (figur 5A), innehåller PIMs fosfatgrupper som specifikt avslöjas med Molybden Blue reagens (Figur 5B). I likhet med mykolicsyror, AG och PDIMs kan PIMs också enkelt visualiseras genom 2D-TLC-analyser(figur 5C). När det gäller att analysera mykobakterier som kan syntetisera LOS, PIMs och LOSs skulle dessutom differentieras med samma 2D elutionssystem, som beskrivs i Ren et al.8.
Figur 1: System för förfarandet för extrakt av lipidinnehåll i mykobakterier som odlas på fasta medier. Huvudsteg för att dechiffrera lipider som finns på mykobaktericeller. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Systemet för extrakt av mykolicsyrahalten i mykobakterier som odlas på fasta medier. Huvudsteg för att dechiffrera mykolicsyror som finns på mykobaktericeller med antingen (A) sur metanol eller (B) förtvålning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa resultat av lipidextraktion från mykobakterier. Tunnskiktskromatografi (TLC) analys av mykolicsyror utvecklade i (A) 85 ml n-hexan, plus 15 ml dietyleter (tre körningar) och (B) 100 ml diklormetan. C)Tvådimensionell TLC-analys av mykolicsyror som extraheras genom sur metanolbehandling som utvecklats 95:5 (n-hexan:aceton) (tre körningar) i första riktningen och 97:3 (toluen:aceton) i andra riktningen. D)Tvådimensionell TLC-analys av mykoliksyror från M. fortuitum extraherat genom förtvålning utvecklad 95:5 (n-hexan:aceton) (tre körningar) i första riktningen och 97:3 (toluen:aceton) i andra riktningen. TLCs avslöjades med 10% molybdatophosphoric syrahydrat i etanol följt av uppvärmning av plattan vid 120 °C. M. bovis BCG Connaught (linje 1 och 1'); M. fortuitum (linje 2 och 2". M. abscessus smooth morphotype (linje 3 och 3') och M. brumae (linje 4 och 4'). Mykolicsyror framställt genom sur metanol och 1'-4 mykolicsyror som erhålls genom förtvålning. Jag, α-mycolates; II, α'-mycolates; IV, ketomycolates; V, epoximycolates. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativa resultat av lipidextraktion från mykobakterier. (A)TLC-analys av acylglyceroler (AG) och phthiocerol dimycocerosates (PDIMs) som utvecklats 90:10 (petroleumeter (60-80 °C) :d ieetyleter). B) Tvådimensionell TLC-analys av PDIM och AG utvecklad i 98:2 (petroleumeter (60-80 °C):etylacetat) (tre körningar) i första riktning och 98:2 (petroleumeter (60-80 °C): aceton) i andra riktningen. C)TLC-analys av fenolglykolpid (PGL) utvecklad 95:5 (kloroform:metanol). (D) TLC-analyser utvecklade i 90:10:1 (kloroform:metanol:vatten) av PGL, glykopeptidolipids (GPL), trehalose dimycolate (TDM), acyl trehaloser (AT) och treosehal monomycolate (TMM). e)TLC-analys av PGL- och GPL-, AT-, TMM- och fosfatidyl-inositolmannoider (PIMs) som utvecklats i 30:8:1 (kloroform:metanol:vatten). A-B-C avslöjades med 10% molybdatofosforsyrahydrat i etanol följt av uppvärmning av plattan vid 120 °C. D-Eavslöjades med 5% i etanol av 20% α-naftol i svavelsyra och upphettades vid 120 °C. Linje 1: M. bovis BCG Connaught; Linje 2: M. fortuitum; Linje 3: M. abscessus smooth morphotype; Linje 4: M. brumae. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Representativa resultat av PIMs från mykobakterier. (A-B) TLC-analys av PIMs som utvecklats i 60:35:8 (kloroform:metanol:vatten). C)Tvådimensionell TLC-analys av PIMs utvecklad 60:30:6 (kloroform:metanol:vatten) i första riktning och 40:25:3:6 (kloroform:ättiksyra:metanol:vatten) i andra riktningen. A-C avslöjades med 1% anthrone i svavelsyra följt av uppvärmning av plattan vid 120 °C. B avslöjades med Molybden Blue reagens tills fosfatband uppträdde. Linje 1: M. bovis BCG Connaught; Linje 2: M. fortuitum; Linje 3: M. abscessus smooth morphotype; Linje 4: M. brumae. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett enkelt protokoll som betraktas som guld standard metod för utvinning av icke-covalently länkade lipid föreningar från mycobacterial cell väggen presenteras. Ytterligare visualisering av en- och tvådimensionella TLCs från extraherade lipider av fyra olika mycobacteria visas.
Två på varandra följande kombinerade blandningar av kloroform och metanol för att återställa lipidhalten i mykobakteriella celler är den mest använda lösningsmedelsblandningen23,24,25,26,27,28,29. Denna blandning möjliggör återhämtning av ett brett spektrum av apolära och polära lipider från cellerna. Ändå har vissa andra metoder beskrivits i litteraturen för att extrahera totala eller specifika mycobacterial lipider, som nyligen har granskats av Hameed et al.29. Till exempel är Folch-metoden ett av de mest använda protokollen som utvecklats för att återställa de totala mykobakteriella lipiderna frånvävnader 30 och har också anpassats till rena mykobakteriella kulturer. Den består av att suspendera mykobakteriella celler i kloroform:metanol (1:2), följt av centrifugering och tillsats av kloroform för att erhålla ett förhållande på 1:1. Slutligen används KCl för att ta bort icke-lipidkomponenter frånextraherandet 31. Parallellt har andra protokoll utvecklats för att extrahera specifika lipider. Slayden et al. använde en blandning av kloroform: metanol plus aceton för att specifikt återvinna glykolpider som TDM eller TMM32. Sammantaget är publicerade metoder baserade på att utsätta mykobakteriella celler för olika koncentrationer av lösningsmedel, främst kloroform och metanol. På samma sätt tillsätts vissa salter ibland för att kassera andra cellkomponenter som finns på provet.
Förutom icke-covalently kopplade lipider, mycolic syra extraktion av två olika förfaranden visas också. Medan sur metanol tillåter enkel extraktion av mykolicsyror med mindre farliga reagenser, bevarar förtvålningsförfarandet strukturen hos alla mykolicsyratyper, inklusive typ V mykolicsyra, som klyvs under metanolprocedurerna. När lipiderna har extraherats är 1D- eller 2D-TLC standardmetoder för att övervaka dem, och analysen som används varierar beroende på lipidens fysikaliskkemiska egenskaper. Polariteten och storleken på varje molekyl kommer att bestämma valet av elueringssystem som behövs, vilket möjliggör bestämning av de lipider som ingår i mykobakteriet. Endimensionell TLC kan väljas när retentionsfaktorerna (Rf) mellan mykobakteriella lipider är olika, medan 2D-TLC underlättar visualisering när olika lipider delar molekylvikt och polaritetsegenskaper. För att underlätta identifieringen bör renade lipider köras parallellt med det extraherade provet för att jämföra liknande Rf. Identifiering av en lipid kan uppnås när den körs med samma Rf som den kända renade kontrollen åtminstone i två TLC-system (två olika mobila faser). Renade lipider kan erhållas från kommersiella leverantörer eller från mykobakteriella forskningslaboratorier. Slutligen indikerar molekylens biokemiska karaktär vilken fläck som kan användas för att avslöja TLC-plattor. Det finns universella färgningsmetoder, såsom fosfomolybsyra som gör det möjligt att visualisera alla organiska komponenter när den binder till kolbindningar. Medan andra som a-naphthol eller anthrone ger specifika färger till sockerrester, binder molybdenblått specifikt till fosfatrester.
Det viktigaste övervägandet för att analysera lipidhalten i mykobakterier är att undvika användning av plastmaterial under hela procedurerna eftersom kontakt med organiska lösningsmedel med plast kan förorena proverna och kan observeras i TLC-plattorna. Det är också relevant att tänka på att den kulturmediumkomposition som används för mykobakteriodling, liksom temperatur eller inkubationsdagar, kan ändra lipidmönstret för varje mykobakterie, som tidigarebeskrivits 16. Mykobakterier som odlas på antingen flytande och fasta medier kan användas för att extrahera icke-kovalskopplade lipider eller mykolicsyror. När de får celler från flytande odling bör de filtreras och torkas på lämpligt sätt för att undvika förekomst av flytande medier i provet. Vid användning av mykobakterier från flytande medier måste bakterier dessutom odlas ordentligt och jämnt mellan försöken för att få reproducerbara resultat över tid. Dessutom kan mykobakteriella celler också odlas på pellicles17,33,34,35,36, från vilka de mest yttersta lipiderna kan återvinnas med organiska lösningsmedel och övervakas av TLC, som vi visade i den nuvarande artikeln.
Den huvudsakliga begränsningen av mycobacterial lipid extraktion förfaranden förblir användningen av giftiga lösningsmedel under säkra förhållanden. TLC-förfarandet är mindre känsligt än andra tekniker, såsom gaskromatografi eller högpresterande vätskekromatografi. Dessutom tillåter TLC inte kvantifiering av prover, och ytterligare tekniker måste tillämpas för att identifiera strukturen hos de extraherade föreningarna. Till exempel måste kärnmagnetisk resonans utföras för att skilja lipid isomers. Det är anmärkningsvärt att för att beskriva strukturen hos en mykobakteriell lipid för första gången krävs masspektrometri eller infraröd spektroskopi. Kvantitativ och kvalitativ analys av lipidklasser kräver således normalt kombinationer av olika extraktions-, derivatiserings-, kromatografiska och detektionsmetoder, såsom högpresterande flytande kromatografi tandemmasspektrometri och kärnmagnetisk resonansspektroskopi37,38,39,40. Nyligen genomförda studier har visat att användning av en enstegs tunnskikts kromatografi-flamjoniseringsdetekteringsteknik möjliggör kvantifiering och preliminär screening av mykolicsyror i Actinobacteria41. Ändå är TLC en extremt användbar, tidsssparande och billig teknik för att screena och utvärdera lipidkompositionen av mykobakterier. Sammantaget är de procedurer som presenteras här mycket mångsidiga och tillhandahåller grundläggande verktyg för att analysera den mest relevanta funktionen hos mykobaktericeller: dess komplexa cellvägg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av det spanska ministeriet för vetenskap, innovation och universitet (RTI2018-098777-B-I00), FEDER-fonderna och Generalitat of Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido är mottagare av ett doktorandkontrakt (FI) från Generalitat de Catalunya.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M.
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E.
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
