Évaluation fonctionnelle de la barrière de jonction serrée intestinale et de la perméabilité aux ions dans les tissus natifs par la technique de la chambre d’Ussing
Summary
L’épithélium intestinal confère non seulement l’absorption des nutriments, mais aussi une protection contre les substances nocives. La jonction intercellulaire épithéliale la plus apicale, c’est-à-dire la jonction serrée, régule le soluté paracellulaire et la perméabilité aux ions. Ici, un protocole pour la préparation des feuilles muqueuses et l’évaluation de la sélectivité ionique des jonctions serrées à l’aide de la technique de la chambre d’Ussing est décrit.
Abstract
La technique de la chambre d’Ussing a été inventée pour la première fois par le scientifique danois Hans Ussing en 1951 pour étudier le transport transcellulaire du sodium à travers la peau de grenouille. Depuis lors, cette technique a été appliquée à de nombreux tissus différents pour étudier les paramètres physiologiques du transport à travers les membranes. La méthode de la chambre d’Ussing est préférable à d’autres méthodes car le tissu natif peut être utilisé, ce qui le rend plus applicable à ce qui se passe in vivo. Cependant, comme le tissu natif est utilisé, le débit est faible, le temps est limité et la préparation des tissus nécessite des compétences et de la formation. Ces chambres ont été utilisées pour étudier des protéines transporteuses spécifiques dans divers tissus, comprendre la physiopathologie des maladies telles que la fibrose kystique, étudier le transport et l’absorption des médicaments, et surtout contribué à la compréhension du transport des nutriments dans l’intestin. Compte tenu de l’ensemble du processus de transport épithélial d’un tissu, non seulement les voies transépithéliales, mais aussi les voies paracellulaires sont importantes. Les jonctions serrées sont un déterminant clé de la perméabilité paracellulaire spécifique des tissus dans l’intestin. Dans cet article, la technique de la chambre d’Ussing sera utilisée pour évaluer la permsélectivité paracellulaire des ions en mesurant la conductance transépithéliale et les potentiels de dilution.
Introduction
La méthode de la chambre d’Ussing a été développée pour la première fois par le scientifique danois Hans Ussing. Ussing l’a utilisé pour la première fois pour mesurer le courant de court-circuit du transport du sodium à travers la peau de grenouille après avoir observé que le NaCl pouvait être transporté à travers la peau contre un gradient de concentration élevé1. Son système consistait en la peau de grenouille montée entre deux chambres avec accès de chaque côté de la peau. Chaque chambre contenait la solution de Ringer qui circulait et était aérée. Deux ponts étroits de sonnerie de gélose situés près de la peau et reliés à des électrodes saturées de KCl-calomel ont mesuré la différence de potentiel lue par un potentiateur. Une deuxième paire de ponts de sonnerie de gélose était située à l’extrémité opposée de chaque chambre reliée à des béchers avec du KCl saturé saturé saturé d’AgCl pour appliquer une force électromotrice fournie par une batterie. Un diviseur de potentiel a été utilisé pour ajuster la tension de sorte que la différence de potentiel à travers la peau reste nulle, créant ainsi des conditions de court-circuit. Un microampèremètre a également été connecté pour lire le courant traversant la peau (voir la figure en réf.1 pour la conception originale de la chambre).
Au cours des 70 dernières années, cette technique a été appliquée à de nombreux tissus différents, en particulier le tissu intestinal, pour étudier le transport des nutriments et des ions. Par exemple, le mécanisme de la diarrhée induite par le choléra a été étudié en montant l’iléon de lapin dans ces chambres, et il a été constaté que la diarrhée induite par la toxine du choléra est médiée par l’AMPc2. En outre, ces chambres ont également été utilisées pour étudier le mécanisme sous-jacent au transport du glucose via le cotransporteur Na+-Glucose 1 (SGLT1)3. Notre laboratoire se concentre sur le transport transcellulaire et paracellulaire dans les cellules épithéliales intestinales. En utilisant la méthode de la chambre d’Ussing, le transport peptidique a été évalué chez Claudin 15 souris knockout, qui ont altéré le transport paracellulaire du sodium, en utilisant des chambres d’Ussing pour mesurer l’absorption de la glycylsarcosine dipeptide non hydrolysable. Il a été constaté que l’homéostasie luminale Na+ est importante pour le transport peptidique couplé à des protons4. En outre, ces chambres ont également été utilisées pour étudier la sécrétion d’anions dans le caecum murin en réponse à l’activation sous-muqueuse du récepteur 1 activé par la protéinase par la sérine protéase trypsine5.
Les chambres d’ussing ont également été récemment utilisées pour évaluer les voies paracellulaires dans le tissu épithélial. Les voies paracellulaires sont régulées par des jonctions serrées, qui sont des complexes de protéines qui se forment au point où deux cellules ou plus se rencontrent6. La fonction barrière et la sélectivité ionique (si les anions ou les cations sont sélectivement capables de passer à travers la jonction serrée) sont déterminées par la présence de protéines de la famille des claudines; certains d’entre eux agissent comme des barrières (claudin 3 et 7), des pores anioniques (claudin 10a) ou des pores cationiques (claudin 2, 10b et 15)7. D’autres méthodes ont été utilisées pour évaluer la voie paracellulaire, telles que le gavage oral de FITC accompagné d’une concentration plasmatique de FITC8, ou EDTA-Cr9; cependant, ces techniques sont de résolution inférieure et ne peuvent pas évaluer la sélectivité ionique ou une section spécifique des sections du tractus intestinal. Les chambres d’ussage, cependant, peuvent être utilisées pour évaluer le potentiel de dilution des ions cibles et, par conséquent, déterminer la sélectivité ionique des jonctions serrées. Par exemple, avec naCl, la sélectivité des jonctions serrées pour Na+ et Cl– peut être calculée en diluant un côté de la membrane (généralement le côté muqueux) et en mesurant le changement de différence de potentiel transépithélial. Les perméabilités relatives de Na+ et Cl– peuvent être estimées par l’équation de Goldman-Hodgkin-Katz10 et la sélectivité de la jonction serrée peut être estimée à l’aide de l’équation de Kimizuka-Koketsu11. Ces chambres ont donc l’avantage de mesurer les paramètres électrophysiologiques des tissus et, par conséquent, de fournir plus d’informations sur le passage des ions à travers les jonctions serrées que d’autres méthodes de résolution inférieure.
La méthode de la chambre d’Ussing ne se limite pas seulement au tractus intestinal, bien qu’elle soit largement utilisée dans les études concernant l’intestin, elle a également de nombreuses autres applications. Par exemple, ces chambres ont été utilisées pour étudier la fibrose kystique, et plus particulièrement le régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR)12 à canal chlorure. La fibrose kystique est causée par une mutation du CFTR13, qui entraîne une altération de la sécrétion de chlorure et du transport des liquides par les cellules épithéliales respiratoires, ainsi qu’une couche muqueuse plus épaisse et plus sèche14. L’étude du CFTR épithélial des voies respiratoires a été réalisée avec ces chambres non seulement pour comprendre la maladie, mais aussi pour découvrir des moyens de traiter la maladie. Par exemple, chez les patients présentant des mutations rares causant la fibrose kystique, l’analyse des cellules épithéliales respiratoires des patients a été utilisée pour tester des thérapies telles que Orkambi et une cothérapie amplificateur15.
Les chambres d’ussing ont également été utilisées pour étudier les voies d’administration des médicaments, par exemple avec le tissu de biopsie humaine pour étudier l’absorption des médicaments et la pharmacocinétique16. L’absorption intestinale n’est pas la seule voie d’administration du médicament. Ces chambres ont également été utilisées pour étudier les systèmes d’administration nasale de médicaments17. Des études d’administration de médicaments avec des chambres d’Ussing ont également été réalisées pour l’œil. Dans la cornée de lapin, des études de perméabilité et d’absorption ont été menées avec Labrasol, un médicament conçu pour augmenter l’absorption des médicaments dans les tissus18. Une autre étude a examiné l’effet du chlorure de benzylalkonium sur l’administration transsclérale de médicaments dans la sclérotique du lapin19.
La méthode de la chambre d’Ussing est utile car le tissu natif peut être utilisé. En tant que tel, il est préférable aux modèles in vitro tels que les lignées cellulaires Caco-2. Cependant, la technique nécessite des compétences et du temps pour préparer des échantillons, elle ne convient donc pas aux applications à haut débit. Les propriétés électrophysiologiques des monocouches cellulaires peuvent être étudiées à l’aide d’inserts de culture cellulaire dans ces chambres. Des découvertes récentes ont permis la culture d’organoïdes qui sont des mini-organes cultivés en culture à partir de la récolte de cellules souches épithéliales ou endothéliales20. La culture organoïde peut être manipulée pour être cultivée en monocouche, ce qui permet de monter des organoïdes dans une chambre d’Ussing21. Les organoïdes de divers tissus épithéliaux et endothéliaux peuvent être étudiés, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires, car la culture organoïde peut être maintenue à long terme. Cela augmentera également le débit, car des étapes de dissection et de préparation des tissus fastidieuses et laborieuses ne seront pas nécessaires. À l’avenir, les études en chambre d’Ussing continueront d’être très utiles pour étudier le transport des tissus et elles seront particulièrement importantes dans le domaine de la médecine personnalisée.
Le protocole suivant démontre l’application de la méthode de la chambre d’Ussing pour évaluer la permsélectivité et la fonction barrière des jonctions serrées dans l’intestin grêle des souris knock-out Claudin 15 (Cldn15-/-) et des témoins de type sauvage (WT) en mesurant le potentiel de dilution du NaCl. Des jonctions serrées (TJ) se forment au point où deux cellules ou plus se rencontrent dans le tissu épithélial et endothélial. On pense que les jonctions serrées bicellulaires (bTJ), en particulier les protéines de la famille de la claudine présentes dans la bTJ, déterminent la fonction barrière et la permsélectivité de TJ7. Les souris Cldn15-/- ont un méga intestin grêle22 et une capacité d’absorption des nutriments réduite en raison de la perte de recyclage intestinal de Na+ qui se produit via la claudine 154,23,24. Les souris Cldn15-/- ont une homéostasie Na+ altérée, ce qui en fait un modèle intéressant pour étudier la permsélectivité du TJ. Le protocole suivant évalue la perméabilité du TJ au NaCl en mesurant le potentiel de dilution du NaCl (PNa/PCl) dans l’intestin grêle moyen. En bref, le changement de différence de potentiel membranaire qui se produit en diluant un côté de la membrane (côté M ou côté S, les deux sont mesurés dans le protocole ci-dessous) peut être utilisé pour calculer la perméabilité de Na+ (PNa) et Cl– (PCl), et le potentiel de dilution (PNa / PCl) montrera si la jonction serrée a une sélectivité cationique ou anionique.
Les expériences de ce protocole ont été menées à l’aide d’une chambre Ussing personnalisée (Figure 1A), qui se compose de deux moitiés, entre lesquelles la préparation intestinale est montée verticalement, amplificateur de serrage de tension, enregistreur électrique, électrodes, ponts salins, solution de Ringer, tampon HEPES (150 mM NaCl), tampon HEPES dilué (75 mM NaCl), préparation intestinale (pour plus de détails sur l’équipement, voir la Table des matériaux).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette expérience, des chambres d’Ussing ont été utilisées pour mesurer les paramètres électriques de base et le potentiel de dilution du NaCl dans l’intestin grêle de souris Cldn15-/- et WT. Il est très important lors des expériences en chambre d’Ussing de vérifier que la préparation membranaire utilisée dans les expériences est viable. Cela se fait généralement en ajoutant du glucose ou de l’activateur de l’adénylate cyclase forskoline et en voyant s’il y a une augmen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par 17K00860 (à HH) et 19K20152 (à NI). WH tient à remercier la Fondation des bourses d’études Otsuka Toshimi pour son soutien financier de 2018 à 2021.
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
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