Doğal Dokuda İntestinal Sıkı Bileşke Bariyeri ve İyon Geçirgenliğinin Ussing Oda Tekniği ile Fonksiyonel Olarak Değerlendirilmesi
Summary
Bağırsak epiteli sadece besin emilimini değil, aynı zamanda zararlı maddelere karşı koruma sağlar. Apikal-en epitelyal hücreler arası bileşke, yani sıkı bileşke, parasellüler çözünen ve iyon geçirgenliğini düzenler. Burada, mukozal tabakaların hazırlanması ve Ussing oda tekniği kullanılarak sıkı bağlantıların iyon seçiciliğinin değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Ussing oda tekniği ilk olarak 1951 yılında Danimarkalı bilim adamı Hans Ussing tarafından sodyumun kurbağa derisi boyunca hücre ötesi taşınmasını incelemek için icat edildi. O zamandan beri, bu teknik, membranlar arasında taşımanın fizyolojik parametrelerini incelemek için birçok farklı dokuya uygulanmıştır. Ussing odası yöntemi diğer yöntemlere göre tercih edilir, çünkü doğal doku kullanılabilir, bu da onu in vivo olanlara daha uygulanabilir hale getirir. Bununla birlikte, doğal doku kullanıldığından, verim düşüktür, zaman sınırlıdır ve doku hazırlığı beceri ve eğitim gerektirir. Bu odalar, çeşitli dokulardaki spesifik taşıyıcı proteinleri incelemek, Kistik Fibrozis gibi hastalık patofizyolojisini anlamak, ilaç taşınmasını ve alımını incelemek ve özellikle bağırsakta besin taşınmasının anlaşılmasına katkıda bulunmak için kullanılmıştır. Bir dokunun tüm epitel taşıma süreci göz önüne alındığında, sadece transepitelyal yollar değil, aynı zamanda parasellüler yollar da önemlidir. Sıkı kavşaklar, bağırsak boyunca dokuya özgü parasellüler geçirgenliğin önemli bir belirleyicisidir. Bu makalede, transepitelyal iletkenlik ve seyreltme potansiyellerini ölçerek iyonların parasellüler geçirgenliğini değerlendirmek için Ussing odası tekniği kullanılacaktır.
Introduction
Ussing odası yöntemi ilk olarak Danimarkalı bilim adamı Hans Ussing tarafından geliştirilmiştir. Ussing, NaCl’nin dik bir konsantrasyon gradyanına karşı cilt boyunca taşınabileceği gözlemlendikten sonra kurbağa derisi boyunca sodyum taşınmasının kısa devre akımını ölçmek için ilk kez kullandı1. Sistemi, cildin her iki tarafına erişimi olan iki oda arasına monte edilmiş kurbağa derisinden oluşuyordu. Her oda, dolaşıma sokulan ve havalandırılan Ringer çözeltisini içeriyordu. Cildin yakınında bulunan ve doymuş KCl-calomel elektrotlarına bağlı iki dar agar zil köprüsü, bir potansiyelleştirici tarafından okunduğu gibi potansiyel farkı ölçtü. İkinci bir çift agar zil köprüsü, bir batarya tarafından sağlanan bir elektromotor kuvveti uygulamak için AgCl ile doymuş KCl’ye sahip beherlere bağlı her odanın karşı ucuna yerleştirildi. Voltajı ayarlamak için potansiyel bir bölücü kullanıldı, böylece cilt boyunca potansiyel fark sıfır kaldı ve böylece kısa devre koşulları yaratıldı. Deriden geçen akımı okumak için bir mikroamper metre de bağlandı (orijinal oda tasarımı için ref.1’deki şekle bakın).
Son 70 yılda, bu teknik, besin ve iyon taşınımını incelemek için birçok farklı dokuya, özellikle bağırsak dokusuna uygulanmıştır. Örneğin, kolera kaynaklı ishalin mekanizması bu odalara tavşan ileum monte edilerek incelenmiş ve kolera toksinine bağlı ishale cAMP2 aracılık ettiği bulunmuştur. Ek olarak, bu odalar ayrıca Na +-Glikoz kotransporter 1 (SGLT1) 3 aracılığıyla glikoz taşınmasının altında yatan mekanizmayı incelemek için de kullanılmıştır. Laboratuvarımız intestinal epitel hücrelerinde transsellüler ve parasellüler transporta odaklanmaktadır. Ussing odası yöntemi kullanılarak, hidrolize edilemeyen dipeptid glisilsarkozinin emilimini ölçmek için Ussing odaları kullanılarak, parasellüler sodyum taşınımını bozan Claudin 15 nakavt farelerinde peptid taşınması değerlendirildi. Luminal Na+ homeostazının proton kuplajlı peptid transportu için önemli olduğu bulunmuştur4. Ek olarak, bu odalar ayrıca serin proteaz tripsin5 tarafından proteinaz aktive edilmiş reseptör 1’in submukozal aktivasyonuna yanıt olarak murin çekumdaki anyon sekresyonunu araştırmak için de kullanılmıştır.
Ussing odaları son zamanlarda epitel dokusundaki parasellüler yolları değerlendirmek için de kullanılmaktadır. Parasellüler yollar, iki veya daha fazla hücrenin buluştuğu noktada oluşan protein kompleksleri olan sıkı kavşaklarla düzenlenir6. Bariyer fonksiyonu ve iyon seçiciliği (anyonların veya katyonların seçici olarak sıkı kavşaktan geçip geçemeyeceği), claudin ailesi proteinlerinin varlığı ile belirlenir; bazıları bariyer görevi görür (claudin 3 ve 7), anyon gözenekleri (claudin 10a) veya katyon gözenekleri (claudin 2, 10b ve 15)7. Parasellüler yolu değerlendirmek için, kan plazması FITC konsantrasyonu8 veya EDTA-Cr9 eşliğinde FITC’nin oral gavajı gibi diğer yöntemler kullanılmıştır; Bununla birlikte, bu teknikler daha düşük çözünürlüktedir ve iyon seçiciliğini veya bağırsak sistemi bölümlerinin belirli bir bölümünü değerlendiremez. Bununla birlikte, ussing odaları, hedef iyonların seyreltme potansiyelini değerlendirmek ve bu nedenle sıkı bağlantıların iyon seçiciliğini belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, NaCl ile, Na + ve Cl– için sıkı bağlantıların seçiciliği, membranın bir tarafının (genellikle mukozal taraf) seyreltilmesi ve transepitelyal potansiyel farkındaki değişimin ölçülmesiyle hesaplanabilir. Na+ ve Cl- bağıl geçirgenlikleri Goldman-Hodgkin-Katz denklemi10 ile tahmin edilebilir ve sıkı bağlantının seçiciliği Kimizuka-Koketsu denklemi11 kullanılarak tahmin edilebilir. Bu nedenle, bu odalar, dokunun elektrofizyolojik parametrelerini ölçme avantajına sahiptir ve sonuç olarak, iyonların sıkı bağlantılardan geçişi hakkında diğer düşük çözünürlüklü yöntemlerden daha fazla bilgi sağlar.
Ussing odası yöntemi sadece bağırsak sistemi ile sınırlı değildir, bağırsakla ilgili çalışmalarda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, başka birçok uygulaması da vardır. Örneğin, bu odalar Kistik Fibrozis’i ve özellikle klorür kanalı kistik fibroz transmembran iletkenlik regülatörünü (CFTR) incelemek için kullanılmıştır12. Kistik Fibrozis, CFTR13’teki bir mutasyondan kaynaklanır, bu da bozulmuş klorür sekresyonu ve solunum epitel hücreleri tarafından sıvı taşınması ve bunun sonucunda daha kalın, daha kuru bir mukoza tabakası ile sonuçlanır14. Hava yolu epitelyal CFTR’nin incelenmesi, sadece hastalığı anlamak için değil, aynı zamanda hastalığı tedavi etmenin yollarını keşfetmek için bu odalarla gerçekleştirilmiştir. Örneğin, Kistik Fibrozise neden olan nadir mutasyonları olan hastalarda, Orkambi ve bir amplifikatör ko-terapisi gibi tedavileri test etmek için hasta solunum epitel hücrelerinin analizi kullanılmıştır15.
Ussing odaları, ilaç alımını ve farmakokinetiği incelemek için insan biyopsi dokusu gibi ilaç dağıtım yollarını incelemek için de kullanılmıştır16. Bağırsak alımı, ilaç dağıtımının tek yolu değildir. Bu odalar ayrıca nazal ilaç dağıtım sistemlerini incelemek için de kullanılmıştır17. Göz için Ussing odaları ile ilaç dağıtım çalışmaları da yapılmıştır. Tavşan korneasında, ilaçların dokular arasında emilimini artırmak için tasarlanmış bir ilaç olan Labrasol ile geçirgenlik ve alım çalışmaları yapılmıştır18. Başka bir çalışmada, benzilalkonyum klorürün tavşan sklerasında transskleral ilaç dağıtımı üzerindeki etkisi incelenmiştir19.
Ussing odası yöntemi yararlıdır çünkü doğal doku kullanılabilir. Bu nedenle, Caco-2 hücre hatları gibi in vitro modellere göre tercih edilir. Bununla birlikte, teknik numuneleri hazırlamak için beceri ve zaman gerektirir, bu nedenle yüksek verimli uygulamalar için uygun değildir. Hücre monokatmanlarının elektrofizyolojik özellikleri, bu odalardaki hücre kültürü ekleri kullanılarak incelenebilir. Son keşifler, epitel veya endotel kök hücrelerinin toplanmasından kültürde yetiştirilen mini organlar olan organoidlerin kültürüne izin vermiştir20. Organoid kültürü, tek katmanlı olarak yetiştirilmek üzere manipüle edilebilir, böylece organoidlerin bir Ussing odasına monte edilmesini mümkün kılar21. Çeşitli epitel ve endotel dokularının organoidleri incelenebilir, bu da organoid kültür uzun vadede korunabileceğinden, gerekli hayvan sayısını azaltır. Bu aynı zamanda zaman alıcı ve zahmetli doku diseksiyonu ve hazırlık adımlarına ihtiyaç duyulmayacağından verimi de artıracaktır. Gelecekte, Ussing odası çalışmaları doku naklini incelemek için çok yararlı olmaya devam edecek ve özellikle kişiselleştirilmiş tıp alanında önemli olacaktır.
Aşağıdaki protokol, NaCl’nin seyreltme potansiyelini ölçerek Claudin 15 nakavt (Cldn15-/-) farelerinin ve vahşi tip (WT) kontrollerin ince bağırsağındaki sıkı bağlantıların geçirgenlik ve bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için Ussing odası yönteminin uygulanmasını göstermektedir. Epitel ve endotel dokusunda iki veya daha fazla hücrenin buluştuğu noktada sıkı kavşaklar (TJ) oluşur. İki hücreli sıkı kavşakların (bTJ), özellikle bTJ içinde bulunan claudin ailesi proteinlerinin, TJ7’nin bariyer fonksiyonunu ve permselectivity’sini belirlediği düşünülmektedir. Cldn15-/- fareler mega ince bağırsağa22 sahiptir ve claudin 154,23,24 yoluyla meydana gelen bağırsak Na + geri dönüşümünün kaybı nedeniyle besin alım kabiliyeti azalır. Cldn15-/- fareler Na + homeostazını bozmuştur, bu da onları TJ’nin geçirgenliğini incelemek için ilginç bir model haline getirmektedir. Aşağıdaki protokol, orta ince bağırsaktaki NaCl’nin (PNa / PCl) seyreltme potansiyelini ölçerek TJ’nin NaCl’ye geçirgenliğini değerlendirir. Kısaca, membranın bir tarafının seyreltilmesiyle ortaya çıkan membran potansiyel farkındaki değişim (M tarafı veya S tarafı, her ikisi de aşağıdaki protokolde ölçülmüştür), Na + (PNa) ve Cl– (PCl) geçirgenliğini hesaplamak için kullanılabilir ve seyreltme potansiyeli (PNa / PCl), sıkı bağlantının katyonik veya anyonik bir seçiciliğe sahip olup olmadığını gösterecektir.
Bu protokoldeki deneyler, bağırsak preparatının dikey olarak monte edildiği iki yarıdan oluşan özelleştirilmiş bir Ussing odası (Şekil 1A), voltaj kelepçesi amplifikatörü, elektrik kaydedici, elektrotlar, tuz köprüleri, Ringer çözeltisi, HEPES tamponu (150 mM NaCl), seyreltilmiş HEPES tamponu (75 mM NaCl), bağırsak hazırlığı (ekipman hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu deneyde, Cldn15-/- ve WT farelerinin ince bağırsağında NaCl’nin temel elektriksel parametrelerini ve seyreltme potansiyelini ölçmek için Ussing odaları kullanıldı. Ussing odası deneyleri yaparken, deneylerde kullanılan membran preparatının uygulanabilir olduğunu doğrulamak çok önemlidir. Bu genellikle glikoz veya adenilat siklaz aktivatörü forskolin eklenerek ve Isc’de uygun bir artış olup olmadığını görerek yapılır (farelerde 100-300 μA / cm2<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma 17K00860 (HH’ye) ve 19K20152 (NI’ye) tarafından desteklenmektedir. WH, Otsuka Toshimi Burs Vakfı’na 2018-2021 yılları arasındaki finansal destekleri için teşekkür eder.
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
Riferimenti
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3′, 5′-AMP. American Journal of Physiology – Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing’s chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology – Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907 (2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032 (2018).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, 1-19 (2017).
- Östh, K. . The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery – Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703 (2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al. Megaintestine in claudin-15-deficient mice. Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376 (2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
