Evaluación funcional de la barrera de unión estrecha intestinal y la permeabilidad iónica en tejido nativo mediante la técnica de cámara de Ussing
Summary
El epitelio intestinal confiere no solo la absorción de nutrientes, sino también la protección contra sustancias nocivas. La unión intercelular epitelial más apical, es decir, la unión estrecha, regula el soluto paracelular y la permeabilidad iónica. Aquí, se describe un protocolo para la preparación de láminas mucosas y la evaluación de la selectividad iónica de uniones estrechas utilizando la técnica de cámara de Ussing.
Abstract
La técnica de la cámara de Ussing fue inventada por primera vez por el científico danés Hans Ussing en 1951 para estudiar el transporte transcelular de sodio a través de la piel de rana. Desde entonces, esta técnica se ha aplicado a muchos tejidos diferentes para estudiar los parámetros fisiológicos del transporte a través de las membranas. El método de la cámara de Ussing es preferible a otros métodos porque se puede usar tejido nativo, lo que lo hace más aplicable a lo que está sucediendo in vivo. Sin embargo, debido a que se utiliza tejido nativo, el rendimiento es bajo, el tiempo es limitado y la preparación del tejido requiere habilidad y entrenamiento. Estas cámaras se han utilizado para estudiar proteínas transportadoras específicas en diversos tejidos, comprender la fisiopatología de enfermedades como en la fibrosis quística, estudiar el transporte y la absorción de fármacos, y especialmente contribuyeron a la comprensión del transporte de nutrientes en el intestino. Dado todo el proceso de transporte epitelial de un tejido, no solo las vías transepiteliales, sino también las vías paracelulares son importantes. Las uniones estrechas son un determinante clave de la permeabilidad paracelular específica del tejido a través del intestino. En este artículo, la técnica de la cámara de Ussing se utilizará para evaluar la permselectividad paracelular de los iones mediante la medición de la conductancia transepitelial y los potenciales de dilución.
Introduction
El método de la cámara de Ussing fue desarrollado por primera vez por el científico danés Hans Ussing. Ussing lo usó por primera vez para medir la corriente de cortocircuito del transporte de sodio a través de la piel de rana después de que se observó que el NaCl podía transportarse a través de la piel contra un gradiente de concentración pronunciado1. Su sistema consistía en la piel de rana montada entre dos cámaras con acceso a cada lado de la piel. Cada cámara contenía la solución de Ringer que circulaba y aireaba. Dos estrechos puentes de timbre de agar situados cerca de la piel y conectados a electrodos Saturados de KCl-calomel midieron la diferencia de potencial según lo leído por un potenciador. Un segundo par de puentes de timbre de agar se situaron en el extremo opuesto de cada cámara conectados a vasos de precipitados con KCl saturado saturado de AgCl para aplicar una fuerza electromotriz proporcionada por una batería. Se utilizó un divisor de potencial para ajustar el voltaje de modo que la diferencia de potencial a través de la piel permaneciera cero, creando así condiciones de cortocircuito. También se conectó un medidor de microamperios para leer la corriente que pasa a través de la piel (consulte la figura en ref.1 para el diseño original de la cámara).
En los últimos 70 años, esta técnica se ha aplicado a muchos tejidos diferentes, particularmente al tejido intestinal, para estudiar el transporte de nutrientes e iones. Por ejemplo, el mecanismo de la diarrea inducida por el cólera se estudió montando íleon de conejo en estas cámaras, y se encontró que la diarrea inducida por la toxina del cólera está mediada por cAMP2. Además, estas cámaras también se utilizaron para estudiar el mecanismo subyacente al transporte de glucosa a través del cotransportador de Na+-Glucosa 1 (SGLT1)3. Nuestro laboratorio se centra en el transporte transcelular y paracelular en células epiteliales intestinales. Utilizando el método de la cámara de Ussing, se evaluó el transporte de péptidos en ratones knockout Claudin 15, que han deteriorado el transporte de sodio paracelular, utilizando cámaras de Ussing para medir la absorción del dipéptido no hidrolizable glicilsarcosina. Se encontró que la homeostasis luminal de Na+ es importante para el transporte de péptidos acoplados a protones4. Además, estas cámaras también se utilizaron para investigar la secreción de aniones en el ciego murino en respuesta a la activación submucosa del receptor 1 activado por la proteinasa por la serina proteasa tripsina5.
Las cámaras de ussing también se han utilizado recientemente para evaluar las vías paracelulares en el tejido epitelial. Las vías paracelulares están reguladas por uniones estrechas, que son complejos de proteínas que se forman en el punto donde dos o más células se encuentran6. La función de barrera y la selectividad iónica (si los aniones o cationes son selectivamente capaces de pasar a través de la unión estrecha) está determinada por la presencia de proteínas de la familia de la claudina; algunos de los cuales actúan como barreras (claudina 3 y 7), poros aniónicos (claudina 10a) o poros catiónicos (claudina 2, 10b y 15)7. Se han utilizado otros métodos para evaluar la vía paracelular, como la sonda oral de FITC acompañada de concentración plasmática de FITC8, o EDTA-Cr9; sin embargo, estas técnicas son de menor resolución y no pueden evaluar la selectividad iónica o una sección específica de las secciones del tracto intestinal. Las cámaras de ussing, sin embargo, se pueden utilizar para evaluar el potencial de dilución de los iones objetivo y, por lo tanto, determinar la selectividad iónica de las uniones estrechas. Por ejemplo, con NaCl, la selectividad de las uniones estrechas para Na+ y Cl– se puede calcular diluyendo un lado de la membrana (generalmente el lado de la mucosa) y midiendo el cambio en la diferencia de potencial transepitelial. Las permeabilidades relativas de Na+ y Cl– pueden estimarse mediante la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz10 y la selectividad de la unión estrecha puede estimarse utilizando la ecuación de Kimizuka-Koketsu11. Estas cámaras, por lo tanto, tienen la ventaja de medir los parámetros electrofisiológicos del tejido y, como resultado, proporcionan más información sobre el paso de iones a través de las uniones estrechas que otros métodos de menor resolución.
El método de la cámara de Ussing no solo se limita al tracto intestinal, aunque es ampliamente utilizado en estudios relacionados con el intestino, sino que también tiene muchas otras aplicaciones. Por ejemplo, estas cámaras se han utilizado para estudiar la Fibrosis Quística, y específicamente el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística del canal cloruro (CFTR)12. La fibrosis quística es causada por una mutación en CFTR13, que resulta en una alteración de la secreción de cloruro y el transporte de líquido por las células epiteliales respiratorias, y una capa mucosa más gruesa y seca resultante14. El estudio del CFTR epitelial de las vías respiratorias se ha realizado con estas cámaras no solo para comprender la enfermedad, sino también para descubrir formas de tratar la enfermedad. Por ejemplo, en pacientes con mutaciones raras que causan Fibrosis Quística, el análisis de las células epiteliales respiratorias del paciente se ha utilizado para probar terapias como Orkambi y una coterapia amplificadora15.
Las cámaras de ussing también se han utilizado para estudiar las vías de administración de fármacos, como con el tejido de biopsia humana para estudiar la captación de fármacos y la farmacocinética16. La absorción intestinal no es la única vía de administración de fármacos. Estas cámaras también se han utilizado para estudiar los sistemas nasales de administración de fármacos17. También se han realizado estudios de administración de fármacos con cámaras de Ussing para el ojo. En la córnea del conejo, se realizaron estudios de permeabilidad y captación con Labrasol, un fármaco diseñado para aumentar la absorción de fármacos a través de los tejidos18. Otro estudio examinó el efecto del cloruro de bencilalconio en la administración transescleral de fármacos en la esclerótica del conejo19.
El método de la cámara de Ussing es útil porque se puede utilizar tejido nativo. Como tal, es preferible a los modelos in vitro como las líneas celulares Caco-2. Sin embargo, la técnica requiere habilidad y tiempo para preparar especímenes, por lo que no es adecuada para aplicaciones de alto rendimiento. Las propiedades electrofisiológicas de las monocapas celulares se pueden estudiar utilizando insertos de cultivo celular en estas cámaras. Descubrimientos recientes han permitido el cultivo de organoides que son mini-órganos cultivados en cultivo a partir de la cosecha de células madre epiteliales o endoteliales20. El cultivo de organoides puede ser manipulado para ser cultivado en una monocapa, lo que permite montar organoides en una cámara de Ussing21. Se pueden estudiar organoides de diversos tejidos epiteliales y endoteliales, reduciendo el número de animales requeridos, ya que el cultivo de organoides se puede mantener a largo plazo. Esto también aumentará el rendimiento, ya que no se necesitarán pasos laboriosos y de disección y preparación de tejidos que consumen mucho tiempo. En el futuro, los estudios de cámara de Ussing seguirán siendo muy útiles para estudiar el transporte de tejidos y serán especialmente importantes en el campo de la medicina personalizada.
El siguiente protocolo demuestra la aplicación del método de la cámara de Ussing para evaluar la permselectividad y la función de barrera de las uniones estrechas en el intestino delgado de ratones Claudin 15 knockout (Cldn15-/-) y controles de tipo salvaje (WT) midiendo el potencial de dilución de NaCl. Las uniones estrechas (TJ) se forman en el punto donde dos o más células se encuentran en el tejido epitelial y endotelial. Se cree que las uniones estrechas bicelulares (bTJ), particularmente las proteínas de la familia de la claudina que se encuentran dentro de la bTJ, determinan la función de barrera y la permselectividad de TJ7. Los ratones Cldn15-/- tienen un mega intestino delgado22 y una capacidad reducida de absorción de nutrientes debido a la pérdida de reciclaje intestinal de Na+ que se produce a través de la claudina 154,23,24. Los ratones Cldn15-/- tienen una homeostasis de Na+ deteriorada, lo que los convierte en un modelo interesante para estudiar la permselectividad del TJ. El siguiente protocolo evalúa la permeabilidad del TJ al NaCl midiendo el potencial de dilución del NaCl (PNa/PCl) en el intestino delgado medio. Brevemente, el cambio en la diferencia de potencial de membrana que se produce al diluir un lado de la membrana (lado M o lado S, ambos se miden en el protocolo a continuación) se puede utilizar para calcular la permeabilidad de Na + (PNa) y Cl– (PCl), y el potencial de dilución (PNa / PCl) mostrará si la unión estrecha tiene una selectividad catiónica o aniónica.
Los experimentos en este protocolo se llevaron a cabo utilizando una cámara ussing personalizada (Figura 1A), que consta de dos mitades, entre las cuales se monta verticalmente la preparación intestinal, amplificador de pinza de voltaje, registrador eléctrico, electrodos, puentes de sal, solución de Ringer, tampón HEPES (150 mM NaCl), tampón HEPES diluido (75 mM NaCl), preparación intestinal (para detalles sobre el equipo, consulte la Tabla de materiales).
Protocol
Representative Results
Discussion
En este experimento, se utilizaron cámaras de Ussing para medir los parámetros eléctricos basales y el potencial de dilución de NaCl en el intestino delgado de ratones Cldn15-/- y WT. Es muy importante al hacer experimentos de cámara ussing verificar que la preparación de membrana utilizada en los experimentos sea viable. Esto generalmente se hace agregando glucosa o el activador de la adenilato ciclasa forskolina y viendo si hay un aumento apropiado en Isc (100-300 μA / <su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está respaldado por 17K00860 (a HH) y 19K20152 (a NI). WH desea agradecer a la Fundación de Becas Otsuka Toshimi por su apoyo financiero de 2018-2021.
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
Riferimenti
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