Avaliação funcional da barreira de junção apertada intestinal e permeabilidade de íons em tecido nativo pela técnica da câmara de ussing
Summary
O epitélio intestinal confere não apenas absorção de nutrientes, mas proteção contra substâncias nocivas. A junção intercelular mais epitelial apical, ou seja, a junção apertada, regula soluto paracelular e permeabilidade de íons. Aqui, é descrito um protocolo para a preparação de folhas mucosas e avaliação da seletividade de íons de junções apertadas usando a técnica da câmara de Ussing.
Abstract
A técnica da câmara de Ussing foi inventada pela primeira vez pelo cientista dinamarquês Hans Ussing em 1951 para estudar o transporte transcelular de sódio através da pele de sapo. Desde então, essa técnica tem sido aplicada a muitos tecidos diferentes para estudar os parâmetros fisiológicos do transporte através de membranas. O método de câmara de Ussing é preferível a outros métodos porque o tecido nativo pode ser usado, tornando-o mais aplicável ao que está acontecendo in vivo. No entanto, como o tecido nativo é usado, o rendimento é baixo, o tempo é limitado, e a preparação do tecido requer habilidade e treinamento. Essas câmaras têm sido utilizadas para estudar proteínas específicas de transporte em diversos tecidos, entender a fisiopatologia da doença, como na Fibrose Cística, estudar o transporte e a absorção de medicamentos, e especialmente contribuír para a compreensão do transporte de nutrientes no intestino. Dado todo o processo de transporte epitelial de um tecido, não apenas vias transepiteliais, mas também caminhos paracelulares são importantes. Junções apertadas são um determinante chave da permeabilidade paracelular específica do tecido em todo o intestino. Neste artigo, a técnica da câmara de Ussing será usada para avaliar a permseletividade paracelular dos íons, medindo os potenciais de condução transeptelial e diluição.
Introduction
O método da câmara de Ussing foi desenvolvido pela primeira vez pelo cientista dinamarquês Hans Ussing. Ussing primeiro o usou para medir a corrente de curto-circuito do transporte de sódio através da pele de sapo depois que foi observado que NaCl poderia ser transportado através da pele contra um gradiente de concentração íngreme1. Seu sistema consistia na pele do sapo montada entre duas câmaras com acesso a ambos os lados da pele. Cada câmara continha a solução de Ringer que foi circulada e arejada. Duas pontes estreitas de ágar anéis situadas perto da pele e conectadas a eletrodos Saturados KCl-calomel mediram a diferença potencial como lido por um potencializador. Um segundo par de pontes de ágar ringer estavam situadas na extremidade oposta de cada câmara conectada a béquers com KCl saturado com AgCl para aplicar uma força eletromotiva fornecida por uma bateria. Um divisor potencial foi usado para ajustar a tensão de modo que a diferença potencial entre a pele permaneceu zero, criando assim condições de curto-circuito. Um medidor de microampere também foi conectado para ler a corrente que passa pela pele (ver a figura no ref.1 para o desenho original da câmara).
Ao longo dos últimos 70 anos, essa técnica tem sido aplicada a muitos tecidos diferentes, particularmente o tecido intestinal, para estudar o transporte de nutrientes e íons. Por exemplo, o mecanismo de diarreia induzida pela cólera foi estudado pela montagem de íleo de coelho nessas câmaras, e descobriu-se que a diarreia induzida por toxina de cólera é mediada por cAMP2. Além disso, essas câmaras também foram utilizadas para estudar o mecanismo subjacente ao transporte de glicose via cotransportador Na+-Glicose 1 (SGLT1)3. Nosso laboratório se concentra no transporte transcelular e paracelular em células epiteliais intestinais. Utilizando o método da câmara de Ussing, o transporte de peptídeos foi avaliado em Claudin 15 camundongos nocauteados, que têm prejudicado o transporte paracelular de sódio, usando câmaras de Ussing para medir a absorção da glicitsarcosina de dipeptídeo não-higidivelmente. Descobriu-se que a homeostase Luminal Na+ é importante para o transporte de peptídeos acoplado a prótons4. Além disso, essas câmaras também foram usadas para investigar a secreção de ânion no ceco murino em resposta à ativação submucosal do receptor ativado proteinase 1 pelo serino protease trypsin5.
Câmaras de ussing também foram usadas recentemente para avaliar as vias paracelulares no tecido epitelial. As vias paracelulares são reguladas por junções apertadas, que são complexos de proteínas que se formam no ponto onde duas ou mais células se encontram6. A função de barreira e seletividade de íons (se os ânions ou cáations são seletivamente capazes de passar pela junção apertada) é determinada pela presença de proteínas da família Claudin; alguns dos quais atuam como barreiras (claudin 3 e 7), poros de anion (claudin 10a), ou poros de cáção (claudin 2, 10b e 15)7. Outros métodos têm sido utilizados para avaliar a via paracelular, como gavage oral do FITC acompanhado de concentração FITC de plasma de sangue8, ou EDTA-Cr9; no entanto, essas técnicas são de menor resolução e não podem avaliar a seletividade de íons ou uma seção específica das seções do trato intestinal. As câmaras de ussing, no entanto, podem ser usadas para avaliar o potencial de diluição dos íons-alvo e, portanto, determinar a seletividade de íons das junções apertadas. Por exemplo, com NaCl, a seletividade das junções apertadas para Na+ e Cl– pode ser calculada diluindo um lado da membrana (geralmente o lado mucosal) e medindo a mudança na diferença potencial transepitetelial. As permeabilidades relativas de Na+ e Cl– podem ser estimadas pela equação Goldman-Hodgkin-Katz10 e a seletividade da junção apertada pode ser estimada usando a equação Kimizuka-Koketsu11. Essas câmaras, portanto, têm a vantagem de medir os parâmetros eletrofisiológicos do tecido e, como resultado, fornecem mais informações sobre a passagem de íons através das junções apertadas do que outros métodos de resolução mais baixa.
O método da câmara de Ussing não se limita apenas ao trato intestinal, embora seja amplamente utilizado em estudos relativos ao intestino, ele tem muitas outras aplicações também. Por exemplo, essas câmaras têm sido usadas para estudar fibrose cística, e especificamente o regulador de condutância de fibrose transmembrana de fibrose cisticida do canal cloreto (CFTR)12. A Fibrose Cística é causada por uma mutação no CFTR13, que resulta em secreção de cloreto prejudicada e transporte de fluidos por células epiteliais respiratórias, e uma camada mucosa mais espessa e seca14. Estudo da CFTR epitelial das vias aéreas tem sido realizado com essas câmaras para não só entender a doença, mas para descobrir formas de tratar a doença. Por exemplo, em pacientes com mutações raras que causam fibrose cística, a análise de células epiteliais respiratórias do paciente tem sido usada para testar terapias como Orkambi e uma coterapia amplificadora15.
Câmaras ussing também têm sido usadas para estudar rotas de entrega de medicamentos, como com tecido de biópsia humana para estudar a absorção de drogas e farmacocinética16. A absorção intestinal não é a única rota de entrega de drogas. Essas câmaras também têm sido usadas para estudar sistemas de entrega de drogas nasais17. Estudos de entrega de drogas com câmaras de Ussing também foram realizados para o olho. Na córnea do coelho, foram realizados estudos de permeabilidade e absorção com Labrasol, uma droga projetada para aumentar a absorção de drogas entre tecidos18. Outro estudo analisou o efeito do cloreto de benzilaalkonium na entrega de drogas transesclerais na esclera do coelho19.
O método de câmara de Ussing é útil porque o tecido nativo pode ser usado. Como tal, é preferível sobre modelos in vitro, como linhas celulares Caco-2. No entanto, a técnica requer habilidade e tempo para preparar espécimes, por isso não é adequada para aplicações de alto rendimento. As propriedades eletrofisiológicas das monocamadas celulares podem ser estudadas usando pastilhas de cultura celular nessas câmaras. Descobertas recentes permitiram a cultura de organoides que são mini-órgãos cultivados na cultura a partir da colheita de células-tronco epiteliais ou endoteliais20. A cultura organoide pode ser manipulada para ser cultivada em uma monocamadas, tornando possível montar organoides em uma câmara de Ussing21. Organoides de vários tecidos epiteliais e endoteliais podem ser estudados, diminuindo o número de animais necessários, pois a cultura organoide pode ser mantida a longo prazo. Isso também aumentará o rendimento, uma vez que não serão necessárias etapas de dissecção e preparação de tecidos demorados e trabalhosos. No futuro, os estudos de câmara de Ussing continuarão a ser muito úteis para estudar o transporte de tecidos e serão especialmente importantes no campo da medicina personalizada.
O protocolo a seguir demonstra a aplicação do método de câmara de Ussing para avaliar a permseletividade e a função de barreira das junções apertadas no intestino delgado de Claudin 15 knockout (Cldn15-/-) ratos e controles do tipo selvagem (WT) medindo o potencial de diluição de NaCl. Junções apertadas (TJ) são formadas no ponto onde duas ou mais células se encontram em tecido epitelial e endotelial. Acredita-se que as junções apertadas bicelulares (bTJ), particularmente as proteínas da família Claudin encontradas dentro do bTJ, determinem a função da barreira e a permseletividade do TJ7. Os camundongos têm um mega intestino delgado22 e capacidade reduzida de absorção de nutrientes devido à perda da reciclagem intestinal na+ que ocorre através de claudin 154,23,24. Cldn15-/- camundongos têm prejudicado a homeostase Na+, o que os torna um modelo interessante para estudar a permeseletividade do TJ. O protocolo a seguir avalia a permeabilidade do TJ para a LCA medindo o potencial de diluição de NaCl (PNa/PCl) no intestino delgado médio. Resumidamente, a mudança na diferença potencial da membrana que ocorre diluindo um lado da membrana (lado M ou lado S, ambos são medidos no protocolo abaixo) pode ser usada para calcular a permeabilidade de Na+ (PNa) e Cl– (PCl), e o potencial de diluição (PNa/PCl) mostrará se a junção apertada tem uma seletividade cônica ou aniônica.
Os experimentos neste protocolo foram realizados utilizando uma câmara ussing personalizada (Figura 1A), que consiste em duas metades, entre as quais a preparação intestinal é montada verticalmente, amplificador de grampo de tensão, gravador elétrico, eletrodos, pontes de sal, solução de Ringer, tampão HEPES (150 mM NaCl), tampão HEPES diluído (75 mM NaCl), preparação intestinal (para detalhes sobre o equipamento ver a Tabela de Materiais).
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste experimento, as câmaras de Ussing foram usadas para medir os parâmetros elétricos da linha de base e o potencial de diluição de NaCl no intestino delgado de camundongos Cldn15-/- e WT. É muito importante ao fazer experimentos de câmara de Ussing para verificar se a preparação da membrana usada nos experimentos é viável. Isso geralmente é feito adicionando glicose ou o ativador de cíclase adenílato forskolin e vendo se há um aumento apropriado no Isc (100-300 μ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é suportado por 17K00860 (para HH) e 19K20152 (para NI). A WH gostaria de reconhecer a Fundação bolsa Otsuka Toshimi por seu apoio financeiro de 2018-2021.
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
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