Summary
मेलेनोमा एक बहुत ही आक्रामक बीमारी है जो जल्दी से अन्य अंगों में फैलती है। यह प्रोटोकॉल मेटास्टैटिक मेलेनोमा के ब्रैफ / पेंटन माउस मॉडल में वंक्षण लिम्फ नोड्स की मात्रा की निगरानी करने के लिए 3 डी रेंडरिंग के साथ मिलकर अल्ट्रा-हाई-फ्रीक्वेंसी अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के आवेदन का वर्णन करता है।
Abstract
Tyr:: Creer +, BrafCA / +, Ptenlox / lox आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों (Braf / Pten चूहों) व्यापक रूप से मेटास्टैटिक मेलेनोमा के विवो मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। एक बार जब एक प्राथमिक ट्यूमर को टैमोक्सीफेन उपचार द्वारा प्रेरित किया जाता है, तो प्रेरण के बाद 4-6 सप्ताह के भीतर मेटास्टैटिक बोझ में वृद्धि देखी जाती है। इस पेपर से पता चलता है कि अल्ट्रा-हाई-फ्रीक्वेंसी अल्ट्रासाउंड (यूएचएफयूएस) इमेजिंग को उनकी मात्रा में वृद्धि को मापने के द्वारा वंक्षण लिम्फ नोड्स की मेटास्टैटिक भागीदारी में वृद्धि की निगरानी करने के लिए शोषण किया जा सकता है।
UHFUS प्रणाली का उपयोग एक UHFUS रैखिक जांच (22-55 मेगाहर्ट्ज, अक्षीय रिज़ॉल्यूशन 40 μm) के साथ anesthetized चूहों को स्कैन करने के लिए किया जाता है। वंक्षण लिम्फ नोड्स (बाएं और दाएं दोनों तरफ) से बी-मोड छवियों को एक लघु-अक्ष दृश्य में अधिग्रहित किया जाता है, जो जानवरों को पृष्ठीय शक्ति में स्थित करता है। अल्ट्रासाउंड रिकॉर्ड एक motorized यांत्रिक हाथ पर एक 44 μm कदम आकार का उपयोग कर अधिग्रहित कर रहे हैं. इसके बाद, दो आयामी (2 डी) बी-मोड अधिग्रहण अल्ट्रासाउंड छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए सॉफ्टवेयर प्लेटफॉर्म में आयात किए जाते हैं, और वंक्षण लिम्फ नोड्स की पहचान की जाती है और अधिग्रहित क्रॉस-सेक्शनल 2 डी छवियों में अर्ध-स्वचालित रूप से विभाजित किया जाता है। अंत में, तीन आयामी (3 डी) वॉल्यूम का कुल पुनर्निर्माण स्वचालित रूप से लिम्फ नोड वॉल्यूम के प्रतिपादन के साथ प्राप्त होता है, जिसे एक पूर्ण माप के रूप में भी व्यक्त किया जाता है।
वीवो तकनीक में यह गैर-इनवेसिव बहुत अच्छी तरह से सहन किया जाता है और 2 सप्ताह में एक ही प्रयोगात्मक जानवर पर कई इमेजिंग सत्रों के शेड्यूलिंग की अनुमति देता है। इसलिए, मेटास्टैटिक बीमारी पर औषधीय उपचार के प्रभाव का आकलन करना आदर्श है।
Introduction
मेलेनोमा त्वचा कैंसर का एक आक्रामक रूप है जो अक्सर अन्य त्वचा साइटों (चमड़े के नीचे मेटास्टेसिस) के साथ-साथ लिम्फ नोड्स, फेफड़ों, यकृत, मस्तिष्क और हड्डियों में फैलता है। पिछले दशक में, नई दवाओं को नैदानिक अभ्यास में पेश किया गया है और मेटास्टैटिक मेलेनोमा रोगियों की जीवन प्रत्याशा में सुधार करने में योगदान दिया है। हालांकि, सीमाएं बनी हुई हैं, जिसमें प्रतिक्रिया का चर समय और डिग्री, गंभीर दुष्प्रभाव और अधिग्रहित प्रतिरोध 1 का विद्रोह शामिल है। इसलिए, अपने शुरुआती चरणों में मेटास्टैटिक प्रसार का पता लगाना महत्वपूर्ण है, यानी, जब यह स्थानीय लिम्फ नोड्स तक पहुंचता है।
स्थानीय लिम्फ नोड्स (प्रहरी लिम्फ नोड्स) की बायोप्सी आमतौर पर मेलेनोमा कोशिकाओं की उपस्थिति की जांच के लिए की जाती है। हालांकि, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग मेटास्टैटिक भागीदारी का पता लगाने की एक गैर-आक्रामक विधि के रूप में पकड़ रही है, क्योंकि यह नैदानिक मूल्यांकन को मात देती है और अनावश्यक बायोप्सी 2,3,4 से बचने में मदद कर सकती है। इसके अलावा, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग लिम्फ नोड निगरानी के लिए उपयुक्त लगता है, विशेष रूप से उन्नत उम्र और / या कोमोर्बिडिटीज़ 5,6 के मामले में। अल्ट्रासाउंड विश्लेषण द्वारा पता लगाई जाने वाली विशेषताएं और सामान्य और मेटास्टैटिक लिम्फ नोड्स के बीच भेदभाव की अनुमति देती हैं, उनमें बढ़े हुए आकार (मात्रा), अंडाकार से गोल तक आकार का परिवर्तन, अनियमित मार्जिन, परिवर्तित इकोजेनिक पैटर्न, और परिवर्तित (वृद्धि) संवहनीकरण 7 शामिल हैं।
Tyr::Creer+, BrafCA/+, Ptenlox/lox आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों (Braf/Pten चूहों) को हाल ही में वैज्ञानिक समुदाय को मेटास्टैटिक मेलेनोमा 8 के लिए ऊतक-विशिष्ट और अपरिवर्तनीय मॉडल के रूप में उपलब्ध कराया गया है। इस पशु मॉडल में, प्राथमिक ट्यूमर बहुत तेज़ी से विकसित होते हैं: वे जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) ब्रैफ से ब्राफवी 600ई तक स्विच के प्रेरण के बाद 2-3 सप्ताह के भीतर दिखाई देते हैं और Pten के नुकसान के बाद, जबकि वे 4 सप्ताह के भीतर 50-100 मिमी 3 की मात्रा तक पहुंचते हैं। अगले 2 हफ्तों में, प्राथमिक ट्यूमर की वृद्धि अन्य त्वचा साइटों, लिम्फ नोड्स और फेफड़ों में मेटास्टैटिक बोझ में प्रगतिशील वृद्धि के साथ होती है।
Braf / Pten चूहों को बड़े पैमाने पर कई उद्देश्यों के लिए उपयोग किया गया है, जिसमें मेलेनोमाजेनेसिस 9,10 में शामिल सिग्नलिंग मार्गों का विच्छेदन, मूल 11,12,13 की मेलेनोमा कोशिकाओं की पहचान, और लक्षित चिकित्सा और इम्यूनोथेरेपी दोनों के संदर्भ में नए चिकित्सीय विकल्पों का परीक्षण शामिल है8,14,15,16 . विशेष रूप से, हमने Braf / Pten चूहों का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया कि क्षीण लिस्टेरिया monocytogenes (Lmat) एक विरोधी मेलेनोमा वैक्सीन के रूप में काम करता है। जब चिकित्सीय सेटिंग में व्यवस्थित रूप से प्रशासित किया जाता है, तो एलमैट समग्र विषाक्तता से जुड़ा नहीं होता है क्योंकि यह ट्यूमर साइटों पर चुनिंदा रूप से जमा होता है। इसके अलावा, यह प्राथमिक मेलेनोमा द्रव्यमान में उल्लेखनीय कमी और लिम्फ नोड्स और फेफड़ों में मेटास्टैटिक बोझ में कमी का कारण बनता है। आणविक स्तर पर, एलमैट मेलेनोमा कोशिकाओं की एपोप्टोटिक हत्या का कारण बनता है, जो कम से कम भाग में, गैर-सेल-स्वायत्त गतिविधियों (सीडी 4 + और सीडी 8 + टी लिम्फोसाइट्स की साइट पर भर्ती) 16 के कारण होता है।
जब मेलेनोमा मॉडलिंग के लिए ब्रैफ / पीटीएन चूहों का उपयोग किया जाता है, तो प्राथमिक ट्यूमर और चमड़े के नीचे के मेटास्टेसिस के विकास की निगरानी कैलिपर माप द्वारा की जा सकती है। हालांकि, लिम्फ नोड्स और फेफड़ों की भागीदारी की जांच एक वैकल्पिक तकनीक का उपयोग करके की जानी चाहिए, संभवतः एक गैर-आक्रामक एक जो शोधकर्ताओं को समय के साथ एक ही जानवर का पालन करने की अनुमति देता है। यह पेपर अल्ट्रासाउंड इमेजिंग (चित्रा 1) के उपयोग का वर्णन करता है, जो वंक्षण लिम्फ नोड्स के आकार (मात्रा) में वृद्धि की अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए प्राप्त डेटा के बाद के 3 डी वॉल्यूमेट्रिक विश्लेषण के साथ युग्मित है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
यहां वर्णित सभी तरीकों को इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (पशु प्रोटोकॉल # 754/2015-पीआर और # 684/2018-पीआर) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. मेलेनोमा प्रेरण
नोट: छह सप्ताह पुराने Tyr:: Creer +, BrafCA / + , Ptenlox / lox चूहों [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg (Tyr-cre / ERT2)13Bos / BosJ (Braf / Pten)] का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था (सामग्री की तालिका देखें)।
- 4-hydroxytamoxifen (4-HT) के साथ चूहों का इलाज 5 mM 4-HT के 3 μL को ऊपरी पीठ की मुंडा त्वचा के ~ 1 सेमी 2 पर लागू करके, जैसा कि पहले वर्णित 11,16,17, एक पंक्ति में 3 दिनों के लिए किया गया था।
नोट: यह Cre एंजाइम को सक्रिय करेगा और wt Braf से BrafV600E और Pten के नुकसान के लिए एक स्विच का कारण होगा। ये दो हिट मेलेनोमा गठन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हैं। - ध्यान दें कि प्राथमिक ट्यूमर 2-3 सप्ताह में त्वचा पेंटिंग की साइट पर विकसित होते हैं और 4 सप्ताह में 50-100 मिमी 3 की मात्रा तक पहुंचते हैं। इसके अलावा, इस समय बिंदु (टी 0) पर अन्य त्वचा साइटों, लिम्फ नोड्स और फेफड़ों के लिए मेटास्टेसिस का निरीक्षण करें।
- प्राथमिक ट्यूमर की मात्रा और चमड़े के नीचे मेटास्टेसिस की मात्रा को मापने के लिए कैलिपर्स का उपयोग करें, और वंक्षण लिम्फ नोड्स की मात्रा को मापने के लिए अल्ट्रासाउंड इमेजिंग। एक सप्ताह (टी 1, त्वचा पेंटिंग के बाद 5 सप्ताह) और दो सप्ताह (टी 2, त्वचा पेंटिंग के 6 सप्ताह बाद) के बाद इन मापों को दोहराएं।
- अंतिम समय बिंदु पर, गैसीय sevorane के साथ overdosing द्वारा चूहों euthanize.
- दृश्य निरीक्षण द्वारा प्राथमिक ट्यूमर और लिम्फ नोड्स का विश्लेषण करें, फिर उन्हें हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक्साइज करें, जैसा कि 16 में बताया गया है।
2. इमेजिंग प्रक्रिया
- गैस संज्ञाहरण के लिए एक प्रेरण कक्ष में माउस रखें और शुद्ध ऑक्सीजन में 3% आइसोफ्लुरेन की आपूर्ति करें जब तक कि जानवर पूरी तरह से एनेस्थेटिक न हो जाए। पंजा चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई को सत्यापित करें।
- जानवर को एक गर्म बोर्ड में स्थानांतरित करें - यूएचएफयूएस इमेजिंग स्टेशन का एक संवैधानिक हिस्सा - जानवर को एक सुपाइन स्थिति में पकड़ना। शरीर के तापमान को मापने के लिए पेट्रोलियम जेली के साथ स्नेहक युक्त एक रेक्टल प्रोब का उपयोग करें। शारीरिक सीमा (36 ± 1 डिग्री सेल्सियस) में माउस के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए बोर्ड के तापमान को समायोजित करें।
- संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सक मरहम के साथ माउस की आंखों को नम करें। एक माउस की नाक मास्क के माध्यम से नारकोटिक गैस (शुद्ध ऑक्सीजन में 1.5% आइसोफ्लुरेन) की आपूर्ति करें। संज्ञाहरण की सही गहराई को बनाए रखने के लिए आइसोफ्लुरेन के प्रतिशत को समायोजित करें।
- प्रवाहकीय पेस्ट के साथ अग्र और हिंद पंजे को कोट करें और उन्हें बोर्ड में एम्बेडेड ईसीजी प्लेट इलेक्ट्रोड पर टेप करें। जांचें कि शारीरिक पैरामीटर (हृदय गति, श्वसन संकेत, और कोर शरीर का तापमान) सही ढंग से अधिग्रहित और प्रदर्शित किए जाते हैं।
- एक depilatory एजेंट लागू करके दोनों वंक्षण क्षेत्रों से बालों को निकालें और उन्हें एक ध्वनिक युग्मन माध्यम के साथ कोट।
- UHFUS रैखिक जांच (40 मेगाहर्ट्ज केंद्र आवृत्ति) को UHFUS इमेजिंग स्टेशन में एम्बेडेड एक विशेष 3 D मोटर में क्लैंप करें, जिससे जांच के स्वचालित और चरणबद्ध आंदोलन की अनुमति मिलती है।
- वंक्षण लिम्फ नोड (बाएं / दाएं) की लघु-अक्ष छवियों को प्राप्त करने के लिए अल्ट्रासाउंड जांच की स्थिति को ठीक से उन्मुख और समायोजित करें, और फोकल ज़ोन में रुचि के क्षेत्र को रखें।
- वंक्षण लिम्फ नोड की पूरी मात्रा को 2 डी बी-मोड छवियों के अनुक्रम के रूप में स्कैन करें, जैसा कि पहले वर्णित किया गया था18। एक माइक्रोमीटर पैमाने पर कदम आकार के साथ ट्रांसड्यूसर के रैखिक आंदोलन द्वारा लिम्फ नोड के कई स्तरों पर छवियों को प्राप्त करें, स्वचालित रूप से श्वसन- और कार्डियक-गेटेड सिने लूप के संदर्भ में 3 डी डेटा उत्पन्न करने के लिए।
- निम्नलिखित मापदंडों के साथ छवि रिकॉर्डिंग सेट करें: 2 और 5 मिमी के बीच की दूरी को स्कैन करें (लिम्फ नोड आकार के आधार पर); चरण आकार 44 μm, 46-114 स्कैन चरणों / लिम्फ नोड स्लाइस और प्रति पशु 1-3 मिनट के अधिग्रहण समय के परिणाम के साथ। डिजिटल रूप से आगे ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए कच्चे प्रारूप (DICOM) में अधिग्रहित छवियों को संग्रहीत करें।
- इमेजिंग सत्र के अंत में, गैस संज्ञाहरण को बंद कर दें और जानवर को स्टर्नल रेकम्बेंसी में हीटिंग बोर्ड पर ठीक होने की अनुमति दें। जानवर की देखभाल करें जब तक कि यह प्रवण स्थिति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
3. अल्ट्रासाउंड छवियों के बाद प्रसंस्करण
- अल्ट्रासाउंड छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म में बाएं / दाएं वंक्षण लिम्फ नोड की DICOM 3 D छवियों के डेटासेट को खोलें।
- विभाजन:
- 3D अधिग्रहण के दौरान कैप्चर की गई प्रत्येक छवि के अनुरूप सभी फ़्रेमों के वर्तमान फ़्रेम और थंबनेल दोनों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए बहु-स्लाइस विधि का चयन करें.
- समोच्च दृश्य में लोड करने के लिए पहले फ़्रेम के थंबनेल का चयन करें. समोच्च दृश्य में, लिम्फ नोड की सीमा के साथ बिंदुओं को छोड़ने के लिए माउस पर बाएँ-क्लिक करें. एक बार जब वांछित संख्या में अंक सेट हो जाते हैं (रेंज 10-15), समोच्च को पूरा करने के लिए राइट-क्लिक करें।
- पहला समोच्च पूरा होने के बाद, contouring के लिए अगली छवि का चयन करने के लिए थंबनेल दृश्य का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो प्रत्येक 3 डी वॉल्यूम के लिए आवश्यक मैनुअल ट्रेस की संख्या को कम करने के लिए समोच्च के बीच कई छवियों (3 फ्रेम का औसत) पर छोड़ दें।
नोट: अल्ट्रासाउंड छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म स्वचालित रूप से मैन्युअल निशान के बीच रूपरेखा उत्पन्न करेगा, जिससे विश्लेषण का समय कम हो जाएगा। - इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएँ जब तक कि संपूर्ण वॉल्यूम को रेखांकित नहीं किया जाता. एक बार पूरा होने के बाद, समाप्त पर क्लिक करें।
- 3 डी वायरफ्रेम और मात्रा माप की पीढ़ी:
- जबकि 3 डी मोड विंडो कार्यस्थान में, सतह दृश्य को सक्रिय करने के लिए छवि प्रदर्शन क्षेत्र के नीचे वॉल्यूम माप आइकन पर क्लिक करें।
नोट:: सतह दृश्य उपयोगकर्ता-जनरेट किए गए वॉल्यूम को अधिग्रहित छवि के लिए मैप करता है एक संकलन दृश्य बनाता है। सतह के दृश्य को किसी भी वांछित स्थिति में घुमाया जा सकता है। - घन दृश्य के निचले बाएँ कोने में सूचीबद्ध वॉल्यूम माप का ध्यान रखें.
नोट: विभाजन और 3 डी वॉल्यूम जनरेशन को सामान्य छवि प्रसंस्करण के लिए कस्टम-विकसित सॉफ़्टवेयर और / या स्वतंत्र रूप से उपलब्ध / वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके भी प्राप्त किया जा सकता है। मैन्युअल विभाजन से शुरू करते हुए, सॉफ़्टवेयर को लिम्फ नोड समोच्च का गणितीय और / या पिक्सेल-स्तर का विवरण प्रदान करना चाहिए। इन रूपरेखाओं को लिम्फ नोड्स की बाहरी सतह को प्रस्तुत करने के लिए एक 3 डी स्पेस में जोड़ा जाएगा। इमेजिंग प्रक्रिया में वर्णित सभी चरणों और अल्ट्रासाउंड छवियों के पोस्ट-प्रोसेसिंग को चित्र 2 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।
- जबकि 3 डी मोड विंडो कार्यस्थान में, सतह दृश्य को सक्रिय करने के लिए छवि प्रदर्शन क्षेत्र के नीचे वॉल्यूम माप आइकन पर क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tyr की त्वचा पेंटिंग के बाद :: CreER +, BrafCA / +, Ptenlox / lox चूहों के साथ 4-HT, Cre गतिविधि प्रेरित है, जिसके कारण wt Braf से BrafV600E तक जीनोमिक स्तर पर एक स्विच होता है, जबकि Pten खो जाता है (चित्रा 3A)। 2-3 हफ्तों में, चूहों को 100% पेनेट्रेंस के साथ ऑन-साइट प्राथमिक ट्यूमर विकसित होते हैं। 4-एचटी उपचार (टी 0) से चार सप्ताह के बाद, प्राथमिक ट्यूमर 50-100 मिमी 3 की मात्रा तक पहुंचते हैं, और उनके विकास को अतिरिक्त 2 सप्ताह ((टी 1 और टी 2) के लिए कैलिपर्स द्वारा मापा जा सकता है; चित्रा 3 बी, ऊपरी पैनलों)। बाद के समय बिंदुओं तक नहीं पहुंचा जा सकता है क्योंकि ट्यूमर इतना बड़ा हो जाता है कि चूहों को इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है।
जहां तक मेटास्टैटिक बोझ का संबंध है, 4-एचटी उपचार (चित्रा 3 बी, निचले पैनल) से 4-6 सप्ताह के भीतर वंक्षण लिम्फ नोड्स में रंजकता में क्रमिक वृद्धि देखी जाती है। रंजकता में इस तरह की वृद्धि मेलेनिन जमा की उपस्थिति के कारण होती है, जैसा कि मेलेनिन को हटाने के बिना किए गए हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की जा सकती है। बदले में, मेलेनिन जमा हमेशा मेटास्टेसाइज़्ड मेलेनोमा कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण होते हैं, जैसा कि मेलेनोमा एंटीजन एमएलएएनए और BRAFV600E (चित्रा 3 सी) के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की जाती है।
वंक्षण लिम्फ नोड्स के अंदर पिगमेंटेड मेलेनोमा कोशिकाओं का संचय उनकी मात्रा में प्रगतिशील वृद्धि के साथ होता है, जैसा कि दृश्य निरीक्षण (चित्रा 3 बी, निचले पैनल) द्वारा स्पष्ट है। अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रत्येक प्रयोगात्मक माउस में इस तरह की वृद्धि को अनुदैर्ध्य रूप से मापने का अनूठा अवसर प्रदान करता है, जैसा कि पहले वर्णित है16। वॉल्यूमेट्रिक माप, विभाजन परिणाम, और 3 डी रेंडरिंग, सभी एक प्रतिनिधि मामले का उल्लेख करते हुए, चित्र 4 में दिखाए गए हैं। प्रत्येक लिम्फ नोड की मात्रा 3 डी स्कैन के दौरान अधिग्रहित अक्षीय वर्गों के मैनुअल विभाजन द्वारा प्राप्त की जाती है।
विभाजन चरण के अंत में, सभी अनुभाग लिम्फ नोड (चित्रा 4 ए) के बाहरी समोच्च के ओवरले को दिखाते हैं। ये रूपरेखा रेंडरिंग चरण में फ्रेम-दर-फ्रेम से जुड़े होते हैं, और पूरे लिम्फ नोड की बाहरी सतह को 3 डी स्पेस में प्रक्षेपित किया जाता है। एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, t0, t1, और t2 पर विश्लेषण किए गए एक सही वंक्षण लिम्फ नोड के 3 D प्रतिपादन को क्रमशः चित्र 4B, चित्रा 4C और चित्रा 4D में दिखाया गया है। चित्रा 4E में ग्राफ समय के साथ एक ही जानवर के बाएं और दाएं वंक्षण लिम्फ नोड्स द्वारा प्रदर्शित मात्रा में वृद्धि को निर्धारित करता है।
चित्र 1: अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रणाली का उपयोग मेलेनोमा के ब्रैफ / पीटीएन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल में वंक्षण लिम्फ नोड्स की मात्रा में वृद्धि की निगरानी के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: इमेजिंग प्रक्रिया और अल्ट्रासाउंड छवियों के पोस्ट-प्रोसेसिंग का चरण-दर-चरण सारांश। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: माउस में ऊतक-विशिष्ट और अपरिवर्तनीय Braf / Pten मेटास्टैटिक मेलेनोमा मॉडल में वंक्षण लिम्फ नोड्स के दृश्य निरीक्षण और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण। (A) Cre एंजाइम BrafV600E में wt Braf के स्विच का कारण बनता है और Pten के नुकसान (exons 4 और 5 का उच्छेदन)। यह प्रणाली मेलानोसाइट-विशिष्ट है क्योंकि क्रे एंजाइम की अभिव्यक्ति टाइरोसिनेस के प्रमोटर के नियंत्रण में है, जो मेलेनिन संश्लेषण में शामिल एक एंजाइम है। इसलिए, दो ऑन्कोजेनिक हिट मेलानोसाइटिक वंश तक सीमित हैं। यह प्रणाली भी कम करने योग्य है क्योंकि क्रे को एस्ट्रोजन रिसेप्टर के साथ एक संलयन प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जाता है और नाभिक में स्थानांतरित करने के लिए 4-एचटी के साथ त्वचा पेंटिंग की आवश्यकता होती है, जहां यह अपना कार्य कर सकता है। (बी) प्राथमिक मेलेनोमा ट्यूमर (ऊपरी चित्र) और वंक्षण लिम्फ नोड्स (निचले चित्र) की उपस्थिति 4-एचटी उपचार (क्रमशः टी 0, टी 1, और टी 2) के बाद 4, 5, और 6 सप्ताह के बाद। लिम्फ नोड्स में, मेलेनिन संचय और आकार में वृद्धि दृश्य निरीक्षण द्वारा पता लगाई जाती है। स्केल सलाखों = 0.5 सेमी (ऊपरी चित्र); 0.2 सेमी (कम चित्र)। (सी) वंक्षण लिम्फ नोड्स के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, 4-एचटी उपचार के 6 सप्ताह बाद। (ऊपरी बाएँ) एच एंड ई धुंधला: मेलेनिन जमा 1% KOH और 3% H2O2 के साथ स्लाइस incubating द्वारा हटा दिया जाता है। (ऊपरी दाएँ) मेलेनिन का पता लगाने एच एंड ई धुंधला द्वारा 1% KOH और 3% H2O2 उपचार के बिना किया. (नीचे बाएँ) Immunoperoxidase धुंधला (डीएबी क्रोमोजेन सब्सट्रेट और hematoxylin counterstaining) द्वारा MLANA का पता लगाने. (नीचे दाएँ) BRAFV600E immunoperoxidase धुंधला (DAB क्रोमोजेन सब्सट्रेट और hematoxylin counterstaining) द्वारा पता लगाने. सभी पैनलों के लिए, मूल आवर्धन: 40x; स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षेप: wks = सप्ताह; wt = जंगली प्रकार; 4-HT = 4-hydroxytamoxifen; H&E = hematoxylin और eosin; DAB = 3,3'-diaminobenzidine. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र4: माउस में ऊतक-विशिष्ट और अपरिवर्तनीय Braf/Pten मेटास्टैटिक मेलेनोमा मॉडल में वंक्षण लिम्फ नोड्स की मात्रा के माप, विभाजन और 3D प्रतिपादन। (A) मैनुअल विभाजन द्वारा प्राप्त 4 प्रतिनिधि स्कैन किए गए वर्गों में सही वंक्षण लिम्फ नोड के बाहरी रूपरेखा का ओवरले। (B-D) सही वंक्षण लिम्फ नोड की 3 डी मात्रा का प्रतिपादन, जैसा कि 4-एचटी उपचार के बाद 4, 5 और 6 सप्ताह में मापा जाता है (क्रमशः टी 0, टी 1, और टी 2 समय बिंदु)। आयतन का संख्यात्मक मान भी बताया गया है (मिमी 3 में)। (ई) बाएं (काले वृत्त) और दाएं (सफेद सर्कल) की मात्रा टी 0, टी 1 और टी 2 समय बिंदुओं पर एक ही जानवर के वंक्षण लिम्फ नोड। संक्षिप्त रूप: 3 डी = तीन आयामी; 4-HT = 4-hydroxytamoxifen. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस अध्ययन में प्राप्त डेटा मेटास्टैटिक मेलेनोमा के ब्रैफ / पीटीएन माउस मॉडल के वंक्षण लिम्फ नोड्स की मेटास्टेटिक भागीदारी की निगरानी करने के लिए अल्ट्रासाउंड इमेजिंग की क्षमता को प्रमाणित करता है। जैसा कि पहले दिखाया गया है16, यह तकनीक दवा उपचार की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। ऐसा इसलिए है क्योंकि यह समय के साथ एक ही जानवर में लिम्फ नोड की मात्रा में परिवर्तन की निगरानी की अनुमति देता है, टी 1 और टी 2 पर एकत्र किए गए मापों की तुलना करके टी 0 पर एकत्र किए गए लोगों के साथ। यह, बदले में, प्राप्त परिणामों की मजबूती में वृद्धि में योगदान देता है, क्योंकि अंतर-माउस परिवर्तनशीलता और अन्य कारक जो बेसल लिम्फ नोड आकार को प्रभावित कर सकते हैं, वे सभी के लिए जिम्मेदार हैं। इसके अलावा, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रति प्रयोगात्मक समूह जानवरों की संख्या को कम करके 3आर सिद्धांत के अनुपालन की अनुमति देता है।
Braf / Pten चूहों में, न केवल वंक्षण, बल्कि ब्रैचियल और एक्सिलरी लिम्फ नोड्स भी मेटास्टैटिक प्रसार की साइटें हैं। हालांकि, वंक्षण लिम्फ नोड्स पर ध्यान केंद्रित करने की सलाह दी जाती है क्योंकि अन्य प्राथमिक ट्यूमर साइट के बहुत करीब होते हैं, जो आमतौर पर प्राथमिक ट्यूमर के विकास के दौरान उनके स्थानीयकरण और आकृति विज्ञान को बदल देता है। वैकल्पिक रूप से, ब्रेकियल और एक्सिलरी लिम्फ नोड्स अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए उपयुक्त हो सकते हैं यदि ट्यूमर प्रेरण की एक अलग साइट चुनी जाती है, जैसे कि कान या पंजे 8। जहां तक अन्य मेटास्टैटिक साइटों का संबंध है, ऊतक में हवा की उपस्थिति के कारण अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग करके फेफड़ों का अध्ययन नहीं किया जा सकता है। सैद्धांतिक रूप से, फुफ्फुस इंटरफ़ेस तक पहुंचने वाले केवल सतही फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस को इस तकनीक के साथ कल्पना की जा सकती है। हालांकि इसके बजाय माइक्रो कम्प्यूटेड टोमोग्राफी / पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (सीटी / पीईटी) का उपयोग किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण में कई कमियां हैं, जिनमें उच्च लागत और सीमित उपलब्धता शामिल है। इसके अलावा, आयनीकरण विकिरणों पर आधारित होने के नाते, माइक्रो सीटी / पीईटी शायद ही कई समय बिंदुओं पर अनुदैर्ध्य माप के साथ संगत है। इसके विपरीत, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग को आसानी से चमड़े के नीचे मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है और वॉल्यूम और संवहनीकरण दोनों के माप की अनुमति देता है।
यदि अध्ययन के तहत दवा के प्रभावों की सराहना करने के लिए 2 सप्ताह की समय सीमा बहुत कम है, तो एक अधिक परिधीय प्रेरण साइट (उदाहरण के लिए, पूंछ 9,11 की नोक) या कम ट्यूमर-प्रवण जीनोटाइप (टायर: : CreER +, BrafCA / + , Ptenlox / + चूहों के बजाय Tyr: : CreER + , BrafCA / + , Ptenlox / lox चूहों) का चयन किया जा सकता है। . दोनों मामलों में, प्राथमिक ट्यूमर की वृद्धि बहुत धीमी होने की उम्मीद है, जिससे 4-एचटी के साथ प्रेरण के बाद 6 सप्ताह से अधिक समय तक मेटास्टेसिस की निगरानी की अनुमति मिलती है।
अधिक तकनीकी दृष्टिकोण से, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अल्ट्रासाउंड छवियों का 2 डी विभाजन इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि यह 3 डी वॉल्यूम के माप को प्रभावित कर सकता है। सौभाग्य से, ब्रैफ / पीटीएन पशु मॉडल में, लिम्फ नोड्स और आसपास के ऊतकों के बीच के विपरीत काफी चिह्नित है, ताकि मैन्युअल विभाजन द्वारा लिम्फ नोड सीमाओं की रूपरेखा अपेक्षाकृत सरल हो। हालांकि, विभाजन प्रक्रिया को सोनोग्राफर द्वारा अधिग्रहित अल्ट्रासाउंड छवियों की उच्च गुणवत्ता द्वारा सुविधाजनक बनाया जाना चाहिए, जो बदले में, अत्यधिक अनुभवी होना चाहिए और लिम्फ नोड के एक ही अल्ट्रासाउंड प्रक्षेपण को प्राप्त करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए, यहां तक कि स्कैन सत्रों में भी अलग-अलग समय बिंदुओं पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
बी-मोड अल्ट्रासाउंड इमेजिंग सीधे कैंसर कोशिकाओं को उजागर नहीं कर सकती है; इसके बजाय, यह वंक्षण लिम्फ नोड्स की मात्रा में वृद्धि से उनकी उपस्थिति के अनुमान की अनुमति देता है। इस जानकारी के प्रकाश में, यह सिफारिश की जाती है कि अल्ट्रासाउंड इमेजिंग को लिम्फ नोड्स के उचित आईएचसी स्टेनिंग के साथ जोड़ा जाए, ताकि कैंसर कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि आणविक स्तर पर की जा सके। हालांकि, एक प्रेरित Braf / Pten माउस में मनाया जाने वाला लिम्फ नोड इज़ाफ़ा आमतौर पर कैंसर के प्रसार के लिए जिम्मेदार होता है और किसी अन्य कारण से नहीं, उदाहरण के लिए, एक चल रहा संक्रमण। यह संभावना है क्योंकि अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक चूहों को नियंत्रित स्थितियों में पैदा किया जाता है और नियमित रूप से सैनिटरी स्क्रीनिंग के अधीन किया जाता है, ताकि बीमारी को तुरंत देखा और इलाज किया जा सके।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों को पशु प्रक्रियाओं के साथ उसकी सहायता के लिए एस Burchielli (FTGM, Pisa) धन्यवाद करना चाहते हैं. इस काम को ISPRO-Istituto प्रति lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica संस्थागत वित्त पोषण द्वारा LP के लिए समर्थित किया गया था; MFAG # 17095 AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro द्वारा LP को सम्मानित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
