Summary
Melanom er en meget aggressiv sygdom, der hurtigt spredes til andre organer. Denne protokol beskriver anvendelsen af ultrahøjfrekvent ultralydsbilleddannelse kombineret med 3D-gengivelse for at overvåge volumenet af de indinale lymfeknuder i Braf / Pten-musemodellen af metastatisk melanom.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisk manipulerede mus (Braf/Pten mus) anvendes i vid udstrækning som en in vivo-model af metastatisk melanom. Når en primær tumor er blevet induceret ved tamoxifenbehandling, observeres en stigning i metastatisk byrde inden for 4-6 uger efter induktion. Dette papir viser, hvordan Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) billeddannelse kan udnyttes til at overvåge stigningen i metastatisk involvering af de indinale lymfeknuder ved at måle stigningen i deres volumen.
UHFUS-systemet bruges til at scanne anæstesierede mus med en UHFUS lineær sonde (22-55 MHz, aksial opløsning 40 μm). B-mode billeder fra de indinale lymfeknuder (både venstre og højre side) erhverves i en kortakse visning, der placerer dyrene i dorsal liggende. Ultralydsoptegnelser erhverves ved hjælp af en 44 μm trinstørrelse på en motoriseret mekanisk arm. Derefter importeres todimensionelle (2D) B-mode erhvervelser til softwareplatformen til ultralydsbilledefterbehandling, og inguinale lymfeknuder identificeres og segmenteres halvautomatisk i de erhvervede tværsnitsbilleder 2D. Endelig opnås en total rekonstruktion af det tredimensionelle (3D) volumen automatisk sammen med gengivelsen af lymfeknudevolumenet, som også udtrykkes som en absolut måling.
Denne ikke-invasive in vivo-teknik tolereres meget godt og tillader planlægning af flere billeddannelsessessioner på det samme forsøgsdyr over 2 uger. Det er derfor ideelt at vurdere virkningen af farmakologisk behandling på metastatisk sygdom.
Introduction
Melanom er en aggressiv form for hudkræft, der ofte spredes til andre hudsteder (subkutane metastaser) samt til lymfeknuder, lunger, lever, hjerne og knogler1. I det sidste årti er nye lægemidler blevet introduceret i klinisk praksis og har bidraget til at forbedre den forventede levetid for metastatiske melanompatienter. Der er dog fortsat begrænsninger, herunder variabel responstid og -grad, alvorlige bivirkninger og genopblussen af erhvervet resistens1. Derfor er det afgørende at opdage metastatisk spredning i sine tidlige stadier, dvs. når det kommer til de lokale lymfeknuder.
En biopsi af de lokale lymfeknuder (sentinel lymfeknuder) udføres normalt for at kontrollere tilstedeværelsen af melanomceller. Ultralydsbilleddannelse tager imidlertid fat som en ikke-invasiv metode til påvisning af metastatisk involvering, da den overgår klinisk evaluering og kan hjælpe med at undgå en unødvendig biopsi2,3,4. Desuden synes ultralydsbilleddannelse passende til lymfeknudeovervågning, især i tilfælde af fremskreden alder og / eller comorbiditeter5,6. De funktioner, der detekteres ved ultralydsanalyse og tillader differentiering mellem normale og metastatiske lymfeknuder, omfatter øget størrelse (volumen), ændring af form fra oval til rund, uregelmæssig margen, ændret ekkogent mønster og ændret (øget) vaskularisering7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisk manipulerede mus (Braf/Pten-mus) er for nylig blevet stillet til rådighed for det videnskabelige samfund som en vævsspecifik og inducerbar model for metastatisk melanom8. I denne dyremodel udvikler primære tumorer sig meget hurtigt: de bliver synlige inden for 2-3 uger efter induktionen af skiftet fra vildtype (wt) Braf til BrafV600E og af tabet af Pten, mens de når et volumen på 50-100 mm3 inden for 4 uger. I de følgende 2 uger ledsages væksten af den primære tumor af en progressiv stigning i metastatisk byrde på andre hudsteder, lymfeknuder og lunger.
Braf/Pten-mus er blevet anvendt i vid udstrækning til flere formål, herunder dissektion af signalveje involveret i melanomagenese9,10, identifikation af melanomceller af oprindelse11,12,13 og test af nye terapeutiske muligheder med hensyn til både målrettet terapi og immunterapi8,14,15,16 . Specifikt brugte vi Braf/Pten-mus til at demonstrere, at svækkede Listeria monocytogenes (Lmat) virker som en anti-melanomvaccine. Når Lmat administreres systemisk i den terapeutiske indstilling, er Lmat ikke forbundet med den samlede toksicitet, da den selektivt akkumuleres på tumorsteder. Desuden forårsager det et bemærkelsesværdigt fald i primær melanommasse og en reduktion i metastatisk byrde i lymfeknuder og lunger. På molekylært niveau forårsager Lmat apoptotisk drab på melanomceller, hvilket i det mindste delvist skyldes ikke-celleautonome aktiviteter (rekruttering på stedet af CD4 + og CD8 + T-lymfocytter)16.
Når Braf/Pten-mus anvendes til melanommodellering, kan væksten af primære tumorer og subkutane metastaser overvåges ved hjælp af tykkelsesmålinger. Inddragelsen af lymfeknuder og lunger skal dog undersøges ved hjælp af en alternativ teknik, muligvis en ikke-invasiv, der gør det muligt for forskere at følge det samme dyr over tid. Dette papir beskriver brugen af ultralydsbilleddannelse (figur 1) kombineret med en efterfølgende 3D-volumetrisk analyse af de opnåede data til langsgående overvågning af stigningen i størrelse (volumen) af inguinale lymfeknuder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er godkendt af det italienske sundhedsministerium (dyreprotokol nr. 754/2015-PR og nr. 684/2018-PR).
1. Induktion af melanom
BEMÆRK: Seks uger gamle Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox mus [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] blev anvendt i denne undersøgelse (se materialetabellen).
- Behandl musene med 4-hydroxytamoxifen (4-HT) ved at påføre 3 μL 5 mM 4-HT på ~1 cm2 barberet hud på den øvre del af ryggen, som beskrevet tidligere11,16,17, i 3 dage i træk.
BEMÆRK: Dette vil aktivere Cre-enzymet og forårsage et skift fra wt Braf til Braf600E og tabet af Pten. Disse to hits er nok til at fremkalde dannelse af melanom. - Bemærk, at primære tumorer udvikler sig på stedet for hudmaleriet om 2-3 uger og når et volumen på 50-100 mm3 om 4 uger. Overhold også metastaser til andre hudsteder, lymfeknuder og lunger på dette tidspunkt (t0).
- Brug kalipre til at måle volumenet af den primære tumor og af subkutane metastaser og ultralydsbilleddannelse til at måle volumenet af de indinale lymfeknuder. Gentag disse målinger efter en uge (t1, 5 uger efter hudmaling) og efter to uger (t2, 6 uger efter hudmaling).
- På det sidste tidspunkt aflives musene ved overdosering med gasformig sevoran.
- Analyser de primære tumor- og lymfeknuder ved visuel inspektion, og udstævr dem derefter til histologiske undersøgelser, som rapporteret i16.
2. Billeddannelsesprocedure
- Placer musen i et induktionskammer til gasbedøvelse og tilfør 3% isofluran i rent ilt, indtil dyret er fuldt bedøvet. Kontroller dybden af anæstesi ved manglende reaktion på poteklemme.
- Overfør dyret til et opvarmet bord - en konstitutiv del af UHFUS-billeddannelsesstationen - og hold dyret i liggende stilling. Brug en rektal sonde smurt med vaselin til at måle kropstemperaturen. Juster boardtemperaturen for at holde musens kropstemperatur i det fysiologiske område (36 ± 1 °C).
- Fugt musens øjne med vet salve for at forhindre tørhed under anæstesi. Tilfør narkotisk gas (1,5% isofluran i ren ilt) gennem en musens næsemaske. Juster procentdelen af isofluran for at opretholde den korrekte dybde af anæstesi.
- Belæg for- og bagpoterne med ledende pasta og tape dem til EKG-pladeelektordenderne indlejret i brættet. Kontroller, at de fysiologiske parametre (puls, åndedrætssignal og kropstemperatur) er korrekt erhvervet og vist.
- Fjern hår fra begge lyskeområder ved at påføre et hårfjerningsmiddel og belæg dem med et akustisk koblingsmedium.
- Fastgør UHFUS lineær sonde (40 MHz centerfrekvens) i en specialiseret 3D-motor indlejret i UHFUS-billeddannelsesstationen, hvilket muliggør automatiseret og trinvis bevægelse af sonden.
- Korrekt orientere og justere placeringen af ultralydsonden for at opnå kortaksede billeder af den indinale lymfeknude (venstre / højre), og placer interesseområdet i brændzonen.
- Scan hele volumenet af lyskelymfeknuden som en sekvens af 2D B-mode billeder, som beskrevet tidligere18. Anskaf billeder på flere niveauer af lymfeknuden ved lineær bevægelse af transduceren med trinstørrelser på mikrometerskala for at generere 3D-data med hensyn til automatisk respirations- og hjerte-gated cine loops.
- Indstil billedoptagelsen med følgende parametre: scanningsafstand på mellem 2 og 5 mm (afhængigt af lymfeknudestørrelse); trinstørrelse 44 μm, med et resultat på 46-114 scanningstrin/lymfeknudeskiver og en anskaffelsestid på 1-3 min pr. dyr. Gem de erhvervede billeder digitalt i raw-format (DICOM) til yderligere offlineanalyser.
- Ved afslutningen af billeddannelsessessionen skal du afbryde gasanæstesien og lade dyret komme sig på varmebrættet i sternal tilbagefald. Pas på dyret, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde den udsatte position.
3. Efterbehandling af ultralydsbilleder
- Åbn datasættet med DICOM 3D-billeder af venstre / højre inguinal lymfeknude i softwareplatformen til ultralydsbilledbehandling.
- Segmentering:
- Vælg Metode med flere udsnit for at visualisere både de aktuelle rammer og miniaturebilleder af alle rammer, der svarer til hvert billede, der er taget under 3D-anskaffelsen.
- Vælg miniaturebilledet af det første billede for at indlæse det i konturvisningen. I konturvisningen skal du venstreklik på musen for at slippe punkter langs lymfeknudens kant. Når det ønskede antal punkter er indstillet (område 10-15), skal du højreklikke for at fuldføre konturen.
- Når den første kontur er fuldført, skal du bruge miniaturevisningen til at vælge det næste billede til konturering. Hvis det er nødvendigt, skal du springe over flere billeder (i gennemsnit 3 billeder) mellem konturerne for at reducere antallet af manuelle spor, der er nødvendige for hver 3D-enhed.
BEMÆRK: Softwareplatformen til efterbehandling af ultralydsbilleder genererer automatisk konturer mellem manuelle spor og reducerer derved analysetiden. - Gentag denne proces, indtil hele lydstyrken er skitseret. Når du er færdig, skal du klikke på Udfør.
- Generering af 3D-wireframe og volumenmåling:
- Mens du er i arbejdsområdet i 3D-tilstandsvinduet , skal du klikke på ikonet Lydstyrkemåling under billedvisningsområdet for at aktivere overfladevisningen.
BEMÆRK: Overfladevisningen opretter en kompileringsvisning, der knytter den brugergenererede enhed til det erhvervede billede. Overfladevisningen kan drejes til en hvilken som helst ønsket position. - Vær opmærksom på den volumenmåling, der er angivet i nederste venstre hjørne af terningevisningen.
BEMÆRK: Segmentering og 3D-volumengenerering kan også opnås ved hjælp af specialudviklet software og / eller frit tilgængelig / kommerciel software til generel billedbehandling. Med udgangspunkt i manuel segmentering skal softwaren give en matematisk og/eller pixel-niveau beskrivelse af lymfeknudekonturerne. Disse konturer ville blive kombineret i et 3D-rum for at gengive den ydre overflade af lymfeknuder. Alle trin beskrevet i billeddannelsesproceduren og efterbehandlingen af ultralydsbilleder er opsummeret i figur 2.
- Mens du er i arbejdsområdet i 3D-tilstandsvinduet , skal du klikke på ikonet Lydstyrkemåling under billedvisningsområdet for at aktivere overfladevisningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter hudmaling af Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox-mus med 4-HT induceres Cre-aktivitet, hvorfor der sker et skift på genomisk niveau fra wt Braf til Braf600E, mens Pten går tabt (figur 3A). I 2-3 uger udvikler mus primære tumorer på stedet med 100% penetrans. Efter fire uger fra 4-HT-behandling (t0) når primære tumorer et volumen på 50-100 mm3, og deres vækst kan måles med kalibre i yderligere 2 uger ((t1 og t2; Figur 3B, øverste paneler). Senere tidspunkter kan ikke nås, fordi tumoren bliver så stor, at musene kræver eutanasi.
For så vidt angår den metastatiske byrde observeres en gradvis stigning i pigmentering i lyskens lymfeknuder inden for 4-6 uger fra 4-HT-behandling (figur 3B, nedre paneler). En sådan stigning i pigmentering skyldes tilstedeværelsen af melaninaflejringer, som det kan bekræftes ved hæmatoxylin og eosinfarvning udført uden at fjerne melaninet. Til gengæld skyldes melaninaflejringerne altid tilstedeværelsen af metastaserede melanomceller, som bekræftet ved immunohistokemisk (IHC) farvning af melanomantigenet MLANA og af BRAFV600E (figur 3C).
Akkumuleringen af pigmenterede melanomceller inde i lyskelymfeknuder ledsages af en progressiv stigning i deres volumen, som det fremgår af visuel inspektion (figur 3B, nedre paneler). Ultralydsbilleddannelse giver den unikke mulighed for at kvantificere en sådan stigning i længderetningen i hver eksperimentel mus som beskrevet tidligere16. Volumetriske målinger, segmenteringsresultater og 3D-gengivelse, der alle henviser til et repræsentativt tilfælde, er vist i figur 4. Volumenet af hver lymfeknude opnås ved manuel segmentering af de aksiale sektioner erhvervet under en 3D-scanning.
I slutningen af segmenteringsfasen viser alle sektionerne overlejringen af lymfeknudens ydre kontur (figur 4A). Disse konturer er forbundet ramme for ramme i gengivelsesfasen, og den ydre overflade af hele lymfeknuden projiceres i 3D-rummet. Som et repræsentativt eksempel er 3D-gengivelsen af en højre lyskelymfeknude analyseret ved t0, t1 og t2 vist i henholdsvis figur 4B, figur 4C og figur 4D. Grafen i figur 4E kvantificerer stigningen i volumen, der vises af venstre og højre inguinale lymfeknuder af det samme dyr over tid.
Figur 1: Ultralydsbilleddannelsessystemet, der bruges til at overvåge stigningen i volumen af de indinale lymfeknuder i Braf / Pten genetisk manipuleret musemodel af melanom. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Trin-for-trin resumé af billeddannelsesproceduren og efterbehandlingen af ultralydsbilleder.
Figur 3: Visuel inspektion og histologiske analyser af lyskelymfeknuder i den vævsspecifikke og inducerbare Braf/Pten metastatiske melanommodel i musen. (A) Cre-enzymet forårsager skiftet af wt Braf til Braf600E og tab af Pten (excision af exons 4 og 5). Dette system er melanocytspecifikt, fordi ekspressionen af Cre-enzymet er under kontrol af promotoren af tyrosinase, et enzym involveret i melaninsyntese. Derfor er de to onkogene hits begrænset til den melanocytiske slægt. Dette system er også inducerbart, fordi Cre udtrykkes som et fusionsprotein med østrogenreceptoren og kræver, at hudmaling med 4-HT translokeres ind i kernen, hvor det kan udøve sin funktion. (B) Udseendet af primære melanomtumorer (øvre billeder) og lyskelymfeknuder (nedre billeder) efter 4, 5 og 6 uger efter 4-HT-behandling (henholdsvis t0, t1 og t2). I lymfeknuder påvises stigningen i melaninakkumulering og størrelse ved visuel inspektion. Skalastænger = 0,5 cm (øverste billeder); 0,2 cm (nederste billeder). C) Histologiske analyser af lyskelymfeknuder 6 uger efter 4-HT-behandling. (øverst til venstre) H & E-farvning: melaninaflejringer fjernes ved at inkubere skiver med 1% KOH og 3% H2O2. (øverst til højre) Melanindetektion udført ved H&E-farvning uden 1 % KOH og 3 % H2O2-behandling. (nederst til venstre) MLANA-påvisning ved immunoperoxidasefarvning (DAB-kromogensubstrat og hæmatoxylinmodfarvning). (nederst til højre) BRAFV600E-detektion ved immunoperoxidasefarvning (DAB-kromogensubstrat og hæmatoxylinmodfarvning). For alle paneler, original forstørrelse: 40x; skalastænger = 20 μm. Forkortelser: wks = uger; wt = vildtype; 4-HT = 4-hydroxytamoxifen; H&E = hæmatoxylin og eosin; DAB = 3,3'-diaminobenzidin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Målinger, segmentering og 3D-gengivelse af volumenet af de lyske lymfeknuder i den vævsspecifikke og inducerbare Braf/Pten metastatiske melanommodel i musen. (A) Overlejring af de ydre konturer af den højre lyske lymfeknude i 4 repræsentative scannede sektioner opnået ved manuel segmentering. (B-D) Gengivelse af 3D-volumenet af den højre lyskelymfeknude målt ved 4, 5 og 6 uger efter 4-HT-behandling (henholdsvis t0, t1 og t2 tidspunkter). Den numeriske værdi af volumenet rapporteres også (i mm3). (E) Volumenet af venstre (sort cirkel) og højre (hvid cirkel) lyskelymfeknude for det samme dyr ved t0, t1 og t2 tidspunkter. Forkortelser: 3D = tredimensionel; 4-HT = 4-hydroxytamoxifen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De data, der er opnået i denne undersøgelse, attesterer ultralydsbilleddannelsens evne til at overvåge den metastatiske involvering af indinale lymfeknuder i Braf / Pten-musemodellen for metastatisk melanom. Som vist tidligere16 er denne teknik især nyttig til at vurdere effekten af lægemiddelbehandling. Dette skyldes, at det gør det muligt at overvåge ændringen i lymfeknudevolumen i det samme dyr over tid ved at sammenligne de målinger, der indsamles ved t1 andt2 , med dem, der indsamles ved t0. Dette bidrager igen til en stigning i robustheden af de opnåede resultater, fordi variation mellem mus og andre faktorer, der kan påvirke basal lymfeknudestørrelse, alle er redegjort for. Derudover tillader ultralydsbilleddannelse overholdelse af 3R-princippet ved at reducere antallet af dyr pr. Eksperimentel gruppe.
I Braf / Pten mus er ikke kun inguinal, men også brachiale og aksillære lymfeknuder steder for metastatisk spredning. Det er dog tilrådeligt at fokusere på inguinale lymfeknuder, fordi de andre er for tæt på det primære tumorsted, hvilket normalt ændrer deres lokalisering og morfologi under udviklingen af selve den primære tumor. Alternativt kan brachiale og aksillære lymfeknuder blive egnede til ultralydsbilleddannelse, hvis der vælges et andet sted for tumorinduktion, såsom ører eller poter8. For så vidt angår andre metastatiske steder, kan lungerne ikke studeres ved hjælp af ultralydsbilleddannelse på grund af tilstedeværelsen af luft i vævet. Teoretisk set kunne kun overfladiske lungemetastaser, der når pleuralgrænsefladen, visualiseres med denne teknik. Selv om mikrocomputertomografi/positronemissionstomografi (CT/PET) kunne anvendes i stedet, har denne tilgang flere ulemper, herunder høje omkostninger og begrænset tilgængelighed. Desuden er mikro-CT/PET, der er baseret på ioniserende strålinger, næppe kompatibel med langsgående målinger på flere tidspunkter. Omvendt kan ultralydsbilleddannelse let anvendes til undersøgelse af subkutane metastaser og tillader måling af både volumen og vaskularisering16.
Hvis en 2-ugers tidsramme er for kort til at forstå virkningerne af det undersøgte lægemiddel, kan der vælges et mere perifert induktionssted (f.eks. spidsen af halen9,11) eller en mindre tumorudsat genotype (Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/+ mus i stedet for Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox-mus)9 . I begge tilfælde forventes væksten af den primære tumor at være meget langsommere, hvilket muliggør metastaseovervågning i langt mere end 6 uger efter induktion med 4-HT.
Fra et mere teknisk synspunkt er det vigtigt at bemærke, at 2D-segmentering af ultralydsbilleder er det mest kritiske trin i denne protokol, fordi det kan påvirke målingen af 3D-volumen. Heldigvis er kontrasten mellem lymfeknuder og omgivende væv i Braf/Pten-dyremodellen ret markant, så skitseringen af lymfeknudegrænserne ved manuel segmentering er relativt enkel. Segmenteringsprocessen bør imidlertid lettes af den høje kvalitet af ultralydsbillederne erhvervet af sonografen, som igen skal være meget erfaren og fokuseret på at erhverve den samme ultralydsprojektion af lymfeknuden, selv i scanningssessioner udført på forskellige tidspunkter.
B-mode ultralydsbilleddannelse kan ikke fremhæve kræftceller direkte; i stedet tillader det slutningen af deres tilstedeværelse fra stigningen i mængden af indinale lymfeknuder. I lyset af disse oplysninger anbefales det, at ultralydsbilleddannelse kombineres med passende IHC-farvning af lymfeknuderne, således at tilstedeværelsen af kræftceller kan bekræftes på molekylært niveau. Imidlertid kan en lymfeknudeforstørrelse observeret i en induceret Braf/ Pten-mus typisk tilskrives kræftspredning og ikke en anden årsag, f.eks. En igangværende infektion. Dette skyldes sandsynligvis, at forsøgsmus, der anvendes til ultralydsbilleddannelse, opdrættes under kontrollerede forhold og rutinemæssigt udsættes for sanitær screening, så sygdom straks opdages og behandles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke S. Burchielli (FTGM, Pisa) for hendes hjælp med dyreforsøg. Dette arbejde blev støttet af ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutionel finansiering til LP; MFAG #17095 tildelt af AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro til LP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
