Analisi del volume dei linfonodi mediante imaging ecografico ad altissima frequenza nel modello murino geneticamente modificato braf/Pten del melanoma

Sommario

Il melanoma è una malattia molto aggressiva che si diffonde rapidamente ad altri organi. Questo protocollo descrive l'applicazione dell'imaging ecografico ad altissima frequenza, abbinato al rendering 3D, per monitorare il volume dei linfonodi inguinali nel modello murino Braf/Pten del melanoma metastatico.

Abstract

Tyr::CreER+,^{BrafCA/+,Ptenlox/lox} topi geneticamente modificati (topi Braf/Pten) sono ampiamente usati come modello in vivo di melanoma metastatico. Una volta che un tumore primario è stato indotto dal trattamento con tamoxifene, si osserva un aumento del carico metastatico entro 4-6 settimane dall'induzione. Questo documento mostra come l'imaging Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) può essere sfruttato per monitorare l'aumento del coinvolgimento metastatico dei linfonodi inguinali misurando l'aumento del loro volume.

Il sistema UHFUS viene utilizzato per scansionare topi anestetizzati con una sonda lineare UHFUS (22-55 MHz, risoluzione assiale 40 μm). Le immagini in modalità B dei linfonodi inguinali (sia a sinistra che a destra) vengono acquisite in una vista ad asse corto, posizionando gli animali in reclinazione dorsale. I record di ultrasuoni vengono acquisiti utilizzando una dimensione del gradino di 44 μm su un braccio meccanico motorizzato. Successivamente, le acquisizioni bidimensionali (2D) in modalità B vengono importate nella piattaforma software per la post-elaborazione delle immagini a ultrasuoni e i linfonodi inguinali vengono identificati e segmentati semi-automaticamente nelle immagini 2D trasversali acquisite. Infine, si ottiene automaticamente una ricostruzione totale del volume tridimensionale (3D) insieme alla resa del volume linfonodale, che viene anche espresso come misura assoluta.

Questa tecnica in vivo non invasiva è molto ben tollerata e consente la programmazione di più sessioni di imaging sullo stesso animale sperimentale nell'arco di 2 settimane. È, quindi, ideale per valutare l'impatto del trattamento farmacologico sulla malattia metastatica.

Introduzione

Il melanoma è una forma aggressiva di cancro della pelle che spesso si diffonde ad altri siti cutanei (metastasi sottocutanee), nonché a linfonodi, polmoni, fegato, cervello e ^ossa1. Nell'ultimo decennio, nuovi farmaci sono stati introdotti nella pratica clinica e hanno contribuito a migliorare l'aspettativa di vita dei pazienti con melanoma metastatico. Tuttavia, permangono limitazioni, tra cui il tempo e il grado di risposta variabili, gravi effetti collaterali e l'insorgenza di resistenza ^acquisita1. Pertanto, è fondamentale rilevare la diffusione metastatica nelle sue fasi iniziali, cioè quando arriva ai linfonodi lo....

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano (protocolli animali #754/2015-PR e #684/2018-PR).

1. Induzione del melanoma

NOTA: In questo studio sono stati utilizzati topi Tyr::CreER+^{,BrafCA/+,Ptenlox/lox} di sei settimane [B6.Cg-Braftm1Mmcm ^Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] (vedere la Tabella dei materiali).

1. Trattare i topi con 4-idrossitamoxifene (4-HT) applicando 3 μL di 5 mM 4-HT su ~ 1 ^cm2 di pelle rasata della parte superiore della schiena, come descritt....

Risultati

Dopo la verniciatura cutanea di topi Tyr::CreER+,^BrafCA/+,Ptenlox^/lox con 4-HT, viene indotta l'attività cre, grazie alla quale c'è un passaggio a livello genomico da wt Braf a BrafV600E, mentre Pten viene perso (Figura 3A). In 2-3 settimane, i topi sviluppano tumori primari in loco con penetranza al 100%. Dopo quattro settimane dal trattamento 4-HT (_t0), i tumori primari raggiungono un volume di 50-100 ^mm3 e la loro crescita può .......

Discussione

I dati ottenuti in questo studio attestano la capacità dell'ecografia di monitorare il coinvolgimento metastatico dei linfonodi inguinali del modello murino Braf/Pten di melanoma metastatico. Come mostrato in ^precedenza16, questa tecnica è particolarmente utile per valutare l'efficacia del trattamento farmacologico. Questo perché permette il monitoraggio della variazione del volume linfonodale nello stesso animale nel tempo, confrontando le misurazioni raccolte a _{t1 et2 .......}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4-idrossitamoxifene	Merck	H6278	farmaco utilizzato per l'induzione del tumore
B6. Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) topi	The Jackson Laboratory	013590
Blu gel	Sooft Ialia		soluzione oftalmica gel
BRAFV600E anticorpo	Spring Bioscience Corporation	E19290
IsoFlo (isoflorane)	Zoetis		liquido per anestesia gassosa
MLANA anticorpo Thermo	Fisher Scientific	M2-7C10
Sigma gel	elettrodi	Parker
Gel transonico trasparente	Telic SAU		gel per ultrasuoni
Veet	Reckitt Benckiser IT		crema depilatoria
Compact Dual Anesthesia System	Fujifilm, Visualsonics Inc.		Sistema di anestesia a base di isoflurano dotato di cono nasale e camera di induzione
MX550S	Fujifilm, Visualsonics Inc.		Sonda lineare UHFUS
Vevo 3100	Fujifilm, Visualsonics Inc.		Sistema UHFUS
Vevo Imaging Station	Fujifilm, Visualsonics Inc.		Stazione di imaging UHFUS e unità di monitoraggio fisiologico avanzato dotate di scheda riscaldata
Vevo Lab	Fujifilm, Visualsonics Inc.		Piattaforma software per la post-elaborazione delle immagini ecografiche

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