In vivo høyoppløselig bildebehandling av bukspyttkjertelen ble tilrettelagt med bukspyttkjertelen intravital bildebehandling vinduet.
Direkte in vivo cellulær oppløsningsavbildning av bukspyttkjertelen i en levende liten dyremodell har vært teknisk utfordrende. En nylig intravital avbildningsstudie, med et abdominal bildevindu, aktivert visualisering av cellulær dynamikk i bukorganer in vivo. På grunn av den myke arklignende arkitekturen til musens bukspyttkjertel som lett kan påvirkes av fysiologisk bevegelse (f.eks. peristaltikk og åndedrett), var det vanskelig å utføre stabiliserte langsgående in vivo-avbildning over flere uker på cellenivå for å identifisere, spore og kvantifisere holmer eller kreftceller i bukspyttkjertelen. Her beskriver vi en metode for implantering av en ny støttebase, et integrert intravitalt bildevindu i bukspyttkjertelen, som kan skille bukspyttkjertelen fra tarmen for langsgående tidsforløp intravital avbildning av bukspyttkjertelens mikrostruktur. Langsgående in vivo-avbildning med bildevinduet muliggjør stabil visualisering, noe som muliggjør sporing av holmer over en periode på 3 uker og høyoppløselig tredimensjonal bildebehandling av mikrostrukturen, som det fremgår her i en ortotopisk kreftmodell i bukspyttkjertelen. Med vår metode kan ytterligere intravitale avbildningsstudier belyse patofysiologien til ulike sykdommer som involverer bukspyttkjertelen på cellenivå.
Bukspyttkjertelen er et bukorgan med eksokrine funksjon i fordøyelseskanalen og en endokrine funksjon av utskillende hormoner i blodet. Høyoppløselig cellulær avbildning av bukspyttkjertelen kan avsløre patofysiologien til ulike sykdommer som involverer bukspyttkjertelen, inkludert pankreatitt, kreft i bukspyttkjertelen og diabetes mellitus1. Konvensjonelle diagnostiske bildebehandlingsverktøy som beregnet tomografi, magnetisk oppløsningsavbildning og ultrasonografi er allment tilgjengelig i det kliniske feltet1,2. Imidlertid er disse bildemodalitetene begrenset til å visualisere bare strukturelle eller anatomiske endringer, mens endringer på cellulært eller molekylært nivå ikke kan bestemmes. Gitt at molekylære endringer i diabetes mellitus eller bukspyttkjertelkreft hos mennesker kan initiere mer enn 10 år før diagnosen3,4, har påvisning av bukspyttkjertelsykdommer fra deres molekylære overgang i latent periode potensial til å gi en tidlig diagnose og en rettidig intervensjon. Dermed vil avbildning som vil overvinne oppløsningsbegrensningene og gi verdifull innsikt i funksjonen bemerkelsesverdig få oppmerksomhet ved å gi tidlig diagnose av bukspyttkjertelkreft eller avansert identifisering av endringen av holmene under progresjonen av diabetes mellitus5.
Spesielt med holmer, kjernefysisk avbildning, bioluminescensavbildning og optisk koherenstomografi har blitt foreslått som ikke-invasive holmeavbildningsteknikker6. Imidlertid er oppløsningen av disse metodene betydelig lav, med typiske verdier som spenner fra flere titalls til hundrevis av mikrometer, og tilbyr en begrenset evne til å oppdage endringer på mobilnivå i holmene. På den annen side ble tidligere høyoppløselige studier av holmer utført under ex vivo7,8 (f.eks. kutting eller fordøyelse av bukspyttkjertelen), ikke-fysiologisk9 (f.eks. eksteriørisering av bukspyttkjertelen) og heterotopiske forhold10,11,12 (f.eks. implantasjon under nyrekapselen, inne i leveren og i øyets fremre kammer), som begrenser deres tolkning og kliniske implikasjoner. Hvis in vivo, fysiologiske og ortotopiske modeller av høyoppløselig avbildning kan etableres, vil det være en kritisk plattform for undersøkelse av bukspyttkjertel holmer.
Intravital avbildning, som avslører patofysiologien på et mikroskopisk oppløsningsnivå i et levende dyr, har nylig fått stor oppmerksomhet13. Av in vivo-avbildningsmetodene har utviklingen av et abdominal bildevindu14, som implanterer et vindu inn i magen til en mus, tillatt oppdagelsen av nye funn (dvs. et pre-mikrometastasis stadium av tidlig levermetastase15 og mekanisme for stamcellevedlikehold i tarmepitelet16). Selv om abdominal avbildningsvinduet gir verdifulle resultater, har applikasjonene til dette vinduet for bukspyttkjertelen og den resulterende intravitale bildeforskningen basert på sykdommer som involverer bukspyttkjertelen, ikke blitt grundig undersøkt.
I motsetning til de veldefinerte faste organegenskapene til den menneskelige bukspyttkjertelen, er bukspyttkjertelen til en mus en diffust fordelt bløtvevslignende struktur17. Derfor påvirkes det uopphørlig av fysiologiske bevegelser, inkludert peristaltikk og åndedrett. En tidligere studie om anvendelsen av et abdominal bildevindu for bukspyttkjertelen viste at vandring skjedde på grunn av bevegelsesartefakter indusert av avføring18. Alvorlig uskarphet ble observert i det resulterende gjennomsnittlige bildet, noe som hindret visualisering og identifisering av mikroskalastrukturene.
Her beskriver vi bruken av en ny støttebase integrert bukspyttkjertel intravital bildebehandlingsvindu kombinert med intravital mikroskopi19,20 for å undersøke langsgående cellulære nivå hendelser i sykdommer som involverer bukspyttkjertelen. I tillegg til en detaljert beskrivelse av metodikken i forrige studie18, vil den utvidede anvendelsen av bukspyttkjertelavbildningsvindu for ulike sykdommer som involverer bukspyttkjertelen bli adressert i dette dokumentet. I denne protokollen ble et spesialbygd laserskanningssystem for videohastighet brukt som et intravitalt mikroskopisystem. Fire lasermoduler (bølgelengder ved 405, 488, 561 og 640 nm) ble brukt som eksitasjonskilde, og fire kanaler med utslippssignaler ble oppdaget av fotomultiplierrør (PMT) gjennom bandpassfiltre (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserskanning besto av et roterende polygonalt speil (X-akse) og et galvanometerskanningsspeil (Y-akse) som aktiverte videohastighetsskanning (30 bilder per sekund). Detaljert informasjon om intravital mikroskopi er beskrevet i de tidligere studiene10,18,19,20,21,22,23.
I vår forrige holmestudie18, vi vellykket og stabilt avbildet holmene i levende mus ved hjelp av en transgen musemodell (MIP-GFP)24 der holmene ble merket med GFP. Metoden aktiverte høyoppløselig visualisering av endringene i holmene over en periode på 1 uke. Det forenklet også avbildning av de samme holmene i opptil 3 uker, noe som antyder muligheten for langsiktige studier av bukspyttkjertel holmer for funksjonell sporing eller overvåking under patogenesen av diabetes mellitus18. Videre utviklet vi en ortotopisk kreftmodell i bukspyttkjertelen der fluorescerende kreftceller i bukspyttkjertelen (PANC-1 NucLight Red)25 ble direkte implantert i musens bukspyttkjertel. Med anvendelsen av bukspyttkjertelen intravital avbildningsvindu, kan denne modellen brukes som en plattform for å undersøke cellulær og molekylær patofysiologi i tumormikromiljøet av bukspyttkjertelkreft og for terapeutisk overvåking av nye legemiddelkandidater.
Protokollen som er beskrevet her består av intravital avbildning av bukspyttkjertelen ved hjelp av en ny støttebase integrert bukspyttkjertel intravital bildebehandling vindu modifisert fra et abdominal bildevindu. Blant protokollene beskrevet ovenfor er det første kritiske trinnet implantasjonen av det intravitale bukspyttkjertelavbildningsvinduet i musen. For påføring av limet i vinduet er det viktig å bruke limet mellom vinduets margin og dekkglasset, men ikke på bukspyttkjertelen vev, da det kan forstyrre intr…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av grant No. 14-2020-002 fra SNUBH Research Fund og av National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea regjeringen (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |