췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화
Summary
췌장의 생체 내 고해상도 이미징은 췌장 내 생체 내 이미징 창으로 촉진되었다.
Abstract
살아있는 작은 동물 모형에 있는 췌장의 생체 내 세포 분해능 화상 진찰은 기술적으로 도전적이고 있습니다. 복부 화상 진찰 창이 있는 최근 인트라바이탈 화상 진찰 연구 결과는 생체내 복부 기관에 있는 세포 역학의 시각화를 가능하게 했습니다. 그러나, 생리적 운동(예를 들어, 연동성 및 호흡)에 의해 쉽게 영향을 받을 수 있는 마우스 췌장의 연약한 시트 와 같은 아키텍처로 인해, 마우스 췌장에 있는 섬 또는 암세포를 식별, 추적 및 정량화하기 위해 세포 수준에서 몇 주 동안 생체 내 이미징에서 안정화된 세로를 수행하기가 어려웠다. 본명, 췌장 미세구조의 경도 경과 내인스탈 이미징을 위해 췌장을 창자로부터 공간적으로 분리할 수 있는 새로운 지지기반, 통합췌장 내 인트라바탈 이미징 창을 이식하는 방법을 설명한다. 이미징 창을 가진 생체 내 생체 내 이미징은 안정적인 시각화를 가능하게 하여 3주 동안 의 섬 추적과 미세 구조의 고해상도 3차원 이미징을 허용하며, 여기서 입증된 바와 같이 치열토성 췌장암 모델에서 입증된다. 우리의 방법을 사용하여, 추가 인트라바이탈 이미징 연구는 세포 수준에서 췌장을 포함하는 각종 질병의 병생리학을 해명할 수 있습니다.
Introduction
췌장은 소화관에 있는 외분 염 기능 및 혈 류로 호르몬을 분비의 내 분 비 기능을 가진 복 기관. 췌장의 고해상도 세포 화상 진찰은 췌장염, 췌장암 및 당뇨병 mellitus1을포함하여 췌장을 관련시키는 각종 질병의 병리생리학을 드러낼 수 있었습니다. 컴퓨터 단층 촬영, 자기 분해영상 및 초음파와 같은 기존의 진단 영상 도구는 임상 분야1,2에서널리 이용된다. 그러나, 이러한 이미징 양식은 구조적 또는 해부학적 변화만을 시각화하는 것으로 제한되며, 세포 또는 분자 수준에서의 변화는 결정될 수 없다. 인간내 당뇨병 또는 췌장암의 분자 변화가 진단3,4전에 10년 이상 시작할 수 있다는 점을 감안할 때, 잠기 기간 동안 분자 전환에서 췌장질환의 검출은 조기 진단과 적시개입을 제공할 가능성이 있다. 따라서, 해상도의 한계를 극복하고 기능에 대한 귀중한 통찰력을 제공하는 이미징은 당뇨병의 진행 중에 췌장암의 조기 진단 또는 섬 변경의 고급 식별을 제공함으로써 현저하게 주의를 얻을 것이다5.
특히 섬, 핵 이미징, 생물 발광 이미징 및 광학 일관성 단층 촬영과 함께 비침습적 섬 이미징 기술6으로제안되었다. 그러나 이러한 방법의 해상도는 수십 에서 수백 마이크로미터에 이르는 일반적인 값으로 실질적으로 낮으며, 섬내 셀룰러 수준에서 변화를 감지하는 제한된 기능을 제공합니다. 다른 한편으로는, 이전 의 고해상도 연구는 전 생체7,8 (예를 들어, 췌장의 슬라이스 또는 소화), 비 생리9 (예를 들어, 췌장의 외부화) 및 이성피 조건10,11,12 (예를 들어, 신장 캡슐 아래 이식, 간 내, 및 안과 의 안팎의 방안하에 이식) 및 안과 의 안하에 있는 안팎의 해석하에 수행되었다. 고해상도 이미징의 생체 내,생리학적 및 직교 모델을 확립할 수 있다면 췌장 섬 조사를 위한 중요한 플랫폼이 될 것이다.
살아있는 동물의 현미경 해상도 수준에서 병리학을 드러내는 인트라바이탈 이미징은 최근 큰 관심을 받고 있다13. 생체 내 이미징 방법 중, 마우스의 복부에 창을 이식하는 복부 이미징창(14)의개발은 새로운 발견(즉, 초기 간 전이의 사전 미세메타증 단계및 장 상피16)에서줄기 세포 유지 장치의 메커니즘을 발견할 수 있게 하였다. 복부 화상 진찰 창은 귀중한 결과를 제공하지만, 췌장에 대한이 창의 응용 프로그램과 췌장을 포함하는 질병에 기초한 그 결과 중요한 화상 진찰 연구는 광범위하게 조사되지 않았습니다.
인간 췌장의 잘 정의된 고체 장기 특성과는 달리, 마우스의 췌장은 확산분포된 연조직형구조(17)이다. 따라서 연동 및 호흡을 포함한 생리적 움직임에 끊임없이 영향을 받습니다. 췌장에 대한 복부 이미징 창의 적용에 대한 이전 연구는 배회가 배변(18)에의해 유도된 운동 유물로 인해 발생한다는 것을 입증했다. 심한 흐림은 마이크로 스케일 구조의 시각화 및 식별을 방해하는 결과 평균 이미지에서 관찰되었다.
본명, 췌장과 관련된 질병의 종방향 세포 수준 사건을 조사하기 위해19,20의 인포탈 현미경 검사법과 결합된 새로운 지지 기체 통합 췌장 내 인트라바이탈 이미징 창의 사용을 설명한다. 이전 연구18의방법론에 대한 상세한 설명 외에도 췌장과 관련된 다양한 질병에 대한 췌장 이미징 창의 확장된 적용이 이 논문에서 해결될 것이다. 이 프로토콜에서는 맞춤형 비디오 속도 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템을 중요한 현미경 시스템으로 활용했습니다. 4개의 레이저 모듈(405, 488, 561, 640 nm의 파장)이 여기원으로 활용되었고, 밴드패스 필터(BPF1: FF01:FF01-442/46)를 통해 광증관(PMT)에 의해 4개의 방출 신호 채널이 검출되었다. BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). 레이저 스캐닝은 회전다각형 거울(X축)과 갈바노미터 스캐닝 미러(Y축)로 구성되어 비디오 속도 스캔(초당 30프레임)을 가능하게 했습니다. 인트라바이탈 현미경 검사법에 대한 자세한 정보는 이전 연구에서 기재되어있다(10,18,19,20,21,22,23).
우리의 이전 섬 연구18에서,우리는 성공적으로 안정적으로 섬이 GFP로 태그된 형질 마우스 모델 (MIP-GFP)24를 사용하여 살아있는 마우스에서 섬을 이미지화. 이 방법을 사용하면 1주일 동안 섬의 변경 내용을 고해상도 시각화할 수 있었습니다. 또한 당뇨병의 발병기 동안 기능 추적 또는 모니터링을 위한 췌장 섬의 장기 연구의 타당성을 건의하는 최대 3주 동안 동일한 섬의 이미징을 촉진했다18. 더욱이, 우리는 형광 췌장암세포(PANC-1 NucLight Red)25가 마우스의 췌장에 직접 이식되는 직소 췌장암 모델을 개발하였다. 췌장 내 인트라베이시브 이미징 창의 적용으로, 이 모형은 췌장암의 종양 미세 환경에서 세포 및 분자 병생리학을 조사하고 새로운 약 후보의 치료 감시를 위한 플랫폼으로 이용될 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 설명된 프로토콜은 복부 화상 진찰 창에서 변형된 새로운 지지 기지 통합췌장 내 화상 진찰 창을 사용하여 췌장의 인트라비티 이미징으로 이루어져 있습니다. 위에서 설명한 프로토콜 중, 첫 번째 중요한 단계는 마우스에 있는 중요한 췌장 화상 진찰 창의 이식입니다. 창에 접착제를 적용하기 위해, 창의 여백과 커버 유리 사이에 접착제를 적용하는 것이 중요하지만 췌장 조직에는 그렇지 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 SNUBH 연구 기금에서 14-2020-002호를 지원하고 한국정부(MSIT)가 지원하는 한국연구재단(NRF) 보조금(NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C305694)에 의해 지원되었다.
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
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