Visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas
Summary
Las imágenes in vivo de alta resolución del páncreas se facilitaron con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas.
Abstract
Las imágenes directas de resolución celular in vivo del páncreas en un modelo de animal pequeño vivo han sido técnicamente desafiantes. Un reciente estudio de imagen intravital, con una ventana de imagen abdominal, permitió la visualización de la dinámica celular en los órganos abdominales in vivo. Sin embargo, debido a la arquitectura blanda en forma de lámina del páncreas del ratón que puede ser fácilmente influenciada por el movimiento fisiológico (por ejemplo, peristalsis y respiración), fue difícil realizar imágenes longitudinales estabilizadas in vivo durante varias semanas a nivel celular para identificar, rastrear y cuantificar islotes o células cancerosas en el páncreas del ratón. Aquí, describimos un método para implantar una nueva base de soporte, una ventana de imágenes intravitales pancreáticas integradas, que puede separar espacialmente el páncreas del intestino para obtener imágenes intravitales longitudinales de lapso de tiempo de la microestructura del páncreas. La obtención de imágenes longitudinales in vivo con la ventana de imágenes permite una visualización estable, lo que permite el seguimiento de los islotes durante un período de 3 semanas y la obtención de imágenes tridimensionales de alta resolución de la microestructura, como se evidencia aquí en un modelo de cáncer de páncreas ortotópico. Con nuestro método, otros estudios de imágenes intravitales pueden dilucidar la fisiopatología de diversas enfermedades que involucran el páncreas a nivel celular.
Introduction
El páncreas es un órgano abdominal con una función exocrina en el tracto digestivo y una función endocrina de secretar hormonas en el torrente sanguíneo. Las imágenes celulares de alta resolución del páncreas podrían revelar la fisiopatología de diversas enfermedades que involucran el páncreas, incluida la pancreatitis, el cáncer de páncreas y la diabetes mellitus1. Las herramientas de diagnóstico por imágenes convencionales, como la tomografía computarizada, las imágenes de resolución magnética y la ecografía, están ampliamente disponibles en el campo clínico1,2. Sin embargo, estas modalidades de imagen se limitan a visualizar solo cambios estructurales o anatómicos, mientras que las alteraciones a nivel celular o molecular no se pueden determinar. Dado que los cambios moleculares en la diabetes mellitus o el cáncer de páncreas en humanos pueden iniciarse más de 10 años antes del diagnóstico3,4,la detección de enfermedades pancreáticas a partir de su transición molecular durante el período latente tiene el potencial de proporcionar un diagnóstico temprano y una intervención oportuna. Por lo tanto, las imágenes que superarán las limitaciones de resolución y proporcionarán información valiosa sobre la función ganarán notablemente atención al proporcionar un diagnóstico temprano del cáncer de páncreas o la identificación avanzada de la alteración de los islotes durante la progresión de la diabetes mellitus5.
En particular con los islotes, la imagen nuclear, la imagen de bioluminiscencia y la tomografía de coherencia óptica se han sugerido como técnicas no invasivas de imagen de islotes6. Sin embargo, la resolución de estos métodos es sustancialmente baja, con valores típicos que van desde varias decenas hasta cientos de micrómetros, ofreciendo una capacidad limitada para detectar cambios a nivel celular en los islotes. Por otro lado, se realizaron estudios previos de alta resolución de islotes bajo condiciones ex vivo7,8 (por ejemplo, corte o digestión del páncreas), nofisiológicas 9 (por ejemplo, exteriorización del páncreas) y heterotópicas10,11,12 (por ejemplo, implantación debajo de la cápsula renal, dentro del hígado y en la cámara anterior del ojo), lo que restringe su interpretación e implicaciones clínicas. Si se puede establecer un modelo in vivo,fisiológico y ortotópico de imágenes de alta resolución, será una plataforma crítica para la investigación de los islotes pancreáticos.
Las imágenes intravitales, que revelan la fisiopatología a un nivel de resolución microscópica en un animal vivo, han recibido recientemente gran atención13. De los métodos de imagen in vivo, el desarrollo de una ventana de imagen abdominal14,que implanta una ventana en el abdomen de un ratón, ha permitido el descubrimiento de nuevos hallazgos (es decir, una etapa de pre-micrometástasis de metástasis hepática temprana15 y mecanismo de mantenimiento de células madre en el epitelio intestinal16). Aunque la ventana de imágenes abdominales proporciona resultados valiosos, las aplicaciones de esta ventana para el páncreas y la investigación de imágenes intravitales resultante basada en enfermedades que involucran el páncreas, no se han investigado ampliamente.
A diferencia de las características bien definidas de los órganos sólidos del páncreas humano, el páncreas de un ratón es una estructura similar a un tejido blando distribuida difusamente17. Por lo tanto, se ve afectado incesantemente por movimientos fisiológicos que incluyen peristalsis y respiración. Un estudio previo sobre la aplicación de una ventana de imagen abdominal para el páncreas demostró que la deambulación se produjo debido a artefactos de movimiento inducidos por los movimientos intestinales18. Se observó un desenfoque severo en la imagen promediada resultante, lo que impidió la visualización e identificación de las estructuras a microescala.
Aquí, describimos el uso de una nueva base de soporte integrada en la ventana de imágenes intravitales pancreáticas combinada con microscopía intravital19,20 para investigar los eventos a nivel celular longitudinal en enfermedades que involucran el páncreas. Además de una descripción detallada de la metodología en el estudio anterior18,en este trabajo se abordará la aplicación extendida de la ventana de imágenes pancreáticas para diversas enfermedades que involucran el páncreas. En este protocolo, se utilizó un sistema de microscopía confocal de escaneo láser de velocidad de video personalizado como un sistema de microscopía intravital. Se utilizaron cuatro módulos láser (longitudes de onda a 405, 488, 561 y 640 nm) como fuente de excitación, y se detectaron cuatro canales de señales de emisión mediante tubos fotomultiplicadores (PMT) a través de filtros de paso de banda (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). El escaneo láser consistió en un espejo poligonal giratorio (eje X) y un espejo de escaneo galvanómetro (eje Y) que permitió el escaneo de velocidad de video (30 cuadros por segundo). La información detallada sobre la microscopía intravital ha sido descrita en los estudios previos10,18,19,20,21,22,23.
En nuestro estudio anterior de islotes18,tomamos imágenes exitosas y estables de los islotes en ratones vivos utilizando un modelo de ratón transgénico (MIP-GFP)24 en el que los islotes fueron etiquetados con GFP. El método permitió la visualización de alta resolución de los cambios en los islotes durante un período de 1 semana. También facilitó la obtención de imágenes de los mismos islotes durante un máximo de 3 semanas, lo que sugiere la viabilidad de estudios a largo plazo de los islotes pancreáticos para el seguimiento o monitoreo funcional durante la patogénesis de la diabetes mellitus18. Además, desarrollamos un modelo de cáncer de páncreas ortotópico en el que las células fluorescentes de cáncer de páncreas (PANC-1 NucLight Red)25 se implantaron directamente en el páncreas del ratón. Con la aplicación de la ventana de imágenes intravitales pancreáticas, este modelo podría utilizarse como una plataforma para investigar la fisiopatología celular y molecular en el microambiente tumoral del cáncer de páncreas y para el monitoreo terapéutico de nuevos candidatos a fármacos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí consiste en imágenes intravitales del páncreas utilizando una nueva base de soporte integrada en la ventana de imágenes intravitales pancreáticas modificada desde una ventana de imágenes abdominales. Entre los protocolos descritos anteriormente, el primer paso crítico es la implantación de la ventana de imágenes pancreáticas intravitales en el ratón. Para la aplicación del pegamento en la ventana, es importante aplicar el pegamento entre el margen de la ventana y el vidrio de la cub…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la subvención No. 14-2020-002 del Fondo de Investigación SNUBH y por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
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