Pankreas intravital görüntüleme penceresine sahip bir Murine Modelinde Pankreasın Stabilize Boyuna In Vivo Hücresel Düzey Görselleştirmesi
Summary
Pankreasın in vivo yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi pankreas intravital görüntüleme penceresi ile kolaylaştırıldı.
Abstract
Pankreasın canlı bir küçük hayvan modelinde doğrudan in vivo hücresel çözünürlüklü görüntülenmesi teknik olarak zorlayıcı olmuştur. Yeni bir intravital görüntüleme çalışması, bir abdominal görüntüleme penceresi ile, karın organlarındaki hücresel dinamiklerin in vivoolarak görselleştirilmesini sağladı. Bununla birlikte, fare pankreasının fizyolojik hareketten (örneğin peristalsis ve solunum) kolayca etkilenebilen yumuşak tabaka benzeri mimarisi nedeniyle, fare pankreasındaki adacıkları veya kanser hücrelerini tanımlamak, izlemek ve ölçmek için hücresel düzeyde birkaç hafta boyunca stabilize uzunlamasına in vivo görüntüleme yapmak zordu. Burada, pankreasın mikro yapısının boyuna zaman atlamalı intravital görüntülemesi için pankreası bağırsaktan mekansal olarak ayırabilen yeni bir destek tabanı, entegre bir pankreas intravital görüntüleme penceresi yerleştirme yöntemini açıklıyoruz. Görüntüleme penceresi ile uzunlamasına in vivo görüntüleme, kararlı görselleştirme sağlar, 3 haftalık bir süre boyunca adacıkların izlenmesine ve burada bir ortopedik pankreas kanseri modelinde kanıt olduğu gibi mikroyapının yüksek çözünürlüklü üç boyutlu görüntülenmesine izin verir. Yöntemimizle, daha fazla intravital görüntüleme çalışması, pankreası içeren çeşitli hastalıkların patofizyolojisini hücresel düzeyde aydınlatabilir.
Introduction
Pankreas, sindirim sisteminde ekzokrin bir işleve ve kan dolaşımına hormon salgılamanın endokrin işlevine sahip bir karın organıdır. Pankreasın yüksek çözünürlüklü hücresel görüntülemesi, pankreatit, pankreas kanseri ve diabetes mellitus1dahil olmak üzere pankreası içeren çeşitli hastalıkların patofizyolojisini ortaya çıkarabilir. Bilgisayarlı tomografi, manyetik çözünürlüklü görüntüleme ve ultrasonografi gibi geleneksel tanısal görüntüleme araçları klinik alanda yaygın olarak mevcuttur1,2. Bununla birlikte, bu görüntüleme yöntemleri sadece yapısal veya anatomik değişiklikleri görselleştirmekle sınırlıdır, hücresel veya moleküler düzeydeki değişiklikler belirlenemez. İnsanlarda diabetes mellitus veya pankreas kanserindeki moleküler değişikliklerin tanıdan 10 yıldan daha önce başlatabileceği göz önüne alındığında3,4, pankreas hastalıklarının gizli dönemde moleküler geçişlerinden tespit edilmesi erken tanı ve zamanında müdahale sağlama potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, çözünürlük sınırlamalarını aşacak ve işlev hakkında değerli içgörüler sağlayacak görüntüleme, pankreas kanserinin erken teşhisini veya diabetes mellitus5’inilerlemesi sırasında adacıkların değiştirilmesinin ileri düzeyde tanımlanmasını sağlayarak dikkat çekici bir şekilde dikkat kazanacaktır.
Özellikle adacıklarda nükleer görüntüleme, biyolüminesans görüntüleme ve optik koherens tomografi invaziv olmayan adacık görüntüleme teknikleri olarak öne sürlenmiştir6. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çözünürlüğü, birkaç on ila yüzlerce mikrometre arasında değişen tipik değerlerle önemli ölçüde düşüktür ve adacıklardaki hücresel düzeydeki değişiklikleri tespit etmek için sınırlı bir yetenek sunar. Öte yandan, daha önce ex vivo7,8 (örneğin, pankreasın dilimlenmesi veya sindirimi), fizyolojik olmayan9 (örneğin, pankreasın dışsallaştırılması) ve heterotopik durumlar10,11,12 (örneğin, böbrek kapsülü altında, karaciğerin içinde ve gözün ön odasında implantasyon), bu da yorumlarını ve klinik etkilerini kısıtlar. Yüksek çözünürlüklü görüntülemenin in vivo,fizyolojik ve ortotopik modeli kurulabilirse, pankreas adacıklarının araştırılması için kritik bir platform olacaktır.
Canlı bir hayvanda patofizyolojiyi mikroskobik çözünürlük seviyesinde ortaya çıkaran intravital görüntüleme, son zamanlarda büyük ilgi gördü13. In vivo görüntüleme yöntemlerinden, bir farenin karnına bir pencere yerleştiren bir abdominal görüntülemepenceresinin geliştirilmesi 14, yeni bulguların keşfine izin sağlamıştır (yani, erken karaciğer metastazının mikrometaz öncesi aşaması15 ve bağırsak epitelinde kök hücre bakım mekanizması16). Abdominal görüntüleme penceresi değerli sonuçlar sağlasa da bu pencerenin pankreas için uygulamaları ve pankreas içeren hastalıklara dayalı sonuçlanan intravital görüntüleme araştırmaları kapsamlı bir şekilde araştırılmamıştır.
İnsan pankreasının iyi tanımlanmış katı organ özelliklerinin aksine, bir farenin pankreası yaygın olarak dağılmış yumuşak doku benzeri bir yapıdır17. Bu nedenle peristalsis ve solunum gibi fizyolojik hareketlerden sürekli etkilenir. Pankreas için abdominal görüntüleme penceresinin uygulanması üzerine daha önce yapılan bir çalışma, dolaşmanın bağırsak hareketlerinin neden olduğu hareket eserleri nedeniyle meydana geldiğinigöstermiştir 18. Elde edilen ortalama görüntüde, mikro ölçekli yapıların görselleştirilmesine ve tanımlanmasına engel olan ciddi bulanıklık gözlendi.
Burada, pankreası içeren hastalıklarda boyuna hücresel düzeydeki olayları araştırmak için intravital mikroskopi19,20 ile birlikte yeni bir destekleyici baz entegre pankreas intravital görüntüleme penceresinin kullanımını anlatıyoruz. Önceki çalışmada metodolojinin ayrıntılı bir açıklamasına ek olarak18Pankreası içeren çeşitli hastalıklar için pankreas görüntüleme penceresinin genişletilmiş uygulaması bu makalede ele alınacaktır. Bu protokolde intravital mikroskopi sistemi olarak özel yapım video-oranlı lazer taramalı konfokal mikroskopi sistemi kullanılmıştır. Dört lazer modülü (405, 488, 561 ve 640 nm’deki dalga boyları) bir heyecan kaynağı olarak kullanılmıştır ve fotomultiplier tüpler (PMT) tarafından bant geçiş filtreleri (BPF1: FF01-442/46) aracılığıyla dört kanal emisyon sinyali tespit edilmiştir; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Lazer tarama, dönen çokgen ayna (X ekseni) ve video hızı taramasını (saniyede 30 kare) sağlayan bir galvanometre tarama aynası (Y ekseni) oluşuyordu. İntravital mikroskopi hakkında detaylı bilgi önceki çalışmalardaaçıklanmıştır 10,18,19,20,21,22,23.
Önceki adacık çalışmamızda18, adacıkların GFP ile etiketlendiğini transgenik bir fare modeli (MIP-GFP)24 kullanarak canlı farelerdeki adacıkları başarıyla ve kararlılıkla görüntüledik. Yöntem, adacıklardaki değişikliklerin 1 haftalık bir süre içinde yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini sağladı. Ayrıca aynı adacıkların 3 haftaya kadar görüntülenmesini kolaylaştırdı, bu da diyabet mellitus patogenez sırasında fonksiyonel izleme veya izleme için pankreas adacıklarının uzun süreli çalışmalarının fizibilitesini düşündürmektedir18. Ayrıca, floresan pankreas kanseri hücrelerinin (PANC-1 NucLight Red)25’in doğrudan farenin pankreasına yerleştirildiği bir ortotopik pankreas kanseri modeli geliştirdik. Pankreas intravital görüntüleme penceresinin uygulanması ile bu model, pankreas kanserinin tümör mikroçevreslerindeki hücresel ve moleküler patofizyolojinin araştırılması ve yeni ilaç adaylarının terapötik takibi için bir platform olarak kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, karın görüntüleme penceresinden modifiye edilmiş yeni bir destekleyici taban entegre pankreas intravital görüntüleme penceresi kullanılarak pankreasın intravital görüntülemesinden oluşur. Yukarıda açıklanan protokoller arasında ilk kritik adım fareye intravital pankreas görüntüleme penceresinin yerleştirilmesidir. Tutkalın pencerede uygulanması için, tutkalın pencerenin kenar boşluğu ile kapak camı arasına uygulanması önemlidir, ancak pankreas dokusuna uygulan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, SNUBH Araştırma Fonu’ndan (14-2020-002) ve Kore hükümeti (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. Imaging in pancreatic disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
- Feig, C., et al. The pancreas cancer microenvironment. Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
