膵臓内イメージングウィンドウを用いたマウスモデルにおける膵臓の細胞レベル可視化におけるビ ボ における縦方向の安定化
Summary
インビボでは 膵臓の高解像度イメージングが膵臓のインビタルイメージングウィンドウで容易であった。
Abstract
生きた小動物モデルにおける膵臓の直接 生体細胞 分解能イメージングは技術的に困難であった。最近の生体内イメージング研究は、腹部イメージングウィンドウを用いて、生体内の腹部器官における細胞ダイナミクスの可視化を可能 にした。しかし、生理学的な動き(例えば、蠕動や呼吸)の影響を受けやすいマウス膵臓の柔らかいシート状のアーキテクチャにより、マウス膵 臓 の膵臓で膵島または癌細胞を同定、追跡、定量するために、細胞レベルで数週間にわたって細胞内で安定した縦方向のイメージングを行うことは困難であった。本明細書において、膵臓微細構造の経縦経時間経過インビトバイタルイメージングのために膵臓を腸から空間的に分離することができる新規支持基剤、統合された膵臓内脳イメージングウィンドウを移植する方法について説明する。画像化窓を用いた縦方向 インビボ イメージングは安定した可視化を可能にし、3週間にわたって膵島の追跡と微細構造の高解像度3次元画像化を可能にする、正形膵臓癌モデルでここに証明されるように。我々の方法により、さらに、細胞レベルで膵臓を含む様々な疾患の病態生理を解明することができる生体内イメージング研究。
Introduction
膵臓は、消化管の外分泌機能と血流中にホルモンを分泌する内分泌機能を有する腹部器官である。膵臓の高解像細胞イメージングは、膵炎、膵臓癌、および糖尿病を含む膵臓を含む様々な疾患の病態生理を明らかにすることができる1。コンピュータ断層撮影、磁気分解能画像、および超音波検査などの従来の画像診断ツールは、臨床分野1,2で広く利用可能である。しかし、これらのイメージングモダリティは構造的または解剖学的変化のみを視覚化することに制限されているが、細胞レベルまたは分子レベルでの変化は決定できない。ヒトにおける糖尿病や膵臓癌の分子変化が診断3、4の10年以上前に開始できることを考えると、潜伏期間中の分子転移から膵臓疾患を検出することは、早期診断とタイムリーな介入を提供する可能性を秘めている。したがって、分解能の限界を克服し、機能に関する貴重な洞察を提供するイメージングは、膵臓癌の早期診断または、糖尿病の進行期における膵島の改変の高度な同定を提供することによって顕著に注目を集める5。
特に島と共に、核イメージング、生物発光イメージング、および光コメレンストモグラフィーは、非侵襲的な島頭撮影技術6として示唆されている。しかし、これらの方法の分解能は、数十~数百マイクロメートルの典型的な値で、小島の細胞レベルでの変化を検出する限られた機能を提供する、実質的に低い。一方、以前の高解像研究では、ex vivo7,8(例えば、 膵臓のスライスまたは消化、非生理学的9(例えば、膵臓の外在化)および異所性状態10、11、12(例えば、腎臓カプセルの下、肝臓内、および眼の前房に移植)、解釈および臨床的意味を制限する。もし、高解像イメージングのin vivo、生理学、および異形性体モデルを確立できれば、膵島の調査に不可欠なプラットフォームとなるでしょう。
生体動物の微視的分解能レベルで病態生理を明らかにする生体内イメージングは、最近、大きな注目を集めています13.in vivo イメージング法のうち、マウスの腹部に窓を埋め込む腹部イメージングウィンドウ14の開発により、新しい知見(すなわち、早期肝転移15 の前微小転移段階および腸上皮16における幹細胞維持のメカニズム)の発見が可能になった。腹部イメージングウィンドウは貴重な結果をもたらすが、膵臓に対するこの窓の用途および膵臓を含む疾患に基づく結果として生じる生体内イメージング研究は、広範囲に調査されていない。
ヒト膵臓の固形器官特性とは異なり、マウスの膵臓は、拡散分散した軟組織様構造17である。したがって、蠕動や呼吸などの生理学的な動きによって絶え間なく影響を受けます。膵臓の腹部イメージングウィンドウの適用に関する以前の研究は、腸の動きによって誘発された動きアーティファクトのためにさまようことを実証した18.結果として得られた平均画像では重度のぼかしが観察され、マイクロスケール構造の視覚化と同定が妨げられていた。
ここでは、膵臓を含む疾患における縦方向細胞レベル事象を調べるため、生体内顕微鏡19,20と組み合わせた新規支持基盤統合膵臓生体内イメージングウィンドウの使用について説明する。前の研究18の方法論の詳細な説明に加えて、膵臓を含む様々な疾患に対する膵画像化窓の拡張応用について本論文で説明する。このプロトコルでは、カスタム構築されたビデオレートレーザースキャン共焦点顕微鏡システムを、生体内顕微鏡システムとして利用した。4つのレーザーモジュール(405、488、561、および640 nmの波長)が励起源として利用され、4つの発光信号がバンドパスフィルタ(BPF1:FF01-442/46)を介して光増倍管(PMT)によって検出されました。BPF2: FF02-525/50;BPF3: FF01-600/37;BPF4: FF01-685/40)。レーザースキャンは、回転する多角形ミラー(X軸)と、ビデオレートスキャン(30フレーム/秒)を可能にするガルバノの走査ミラー(Y軸)で構成されていました。生体内顕微鏡に関する詳細は、前の研究10、18、19、20、21、22、23に記載されている。
以前の島の調査18では、遺伝子導入マウスモデル(MIP-GFP)24を用いて、生きたマウスの中の小島をGFPでタグ付けした状態で安定した画像を作成することに成功しました。この方法により、1週間の間に小島の変化を高解像度で可視化することができました。また、最大3週間の同じ膵島のイメージングを促進し、これは、糖尿病の病因の病因の間に機能的追跡またはモニタリングのための膵島の長期研究の実現可能性を示唆する。さらに、蛍光膵臓癌細胞(PANC-1 NucLightRed)25をマウスの膵臓に直接移植する、正腸膵臓癌モデルを開発した。膵臓内イメージングウィンドウの適用により、このモデルは、膵臓癌の腫瘍微小環境における細胞および分子病態生理学を調査し、新しい薬剤候補の治療的モニタリングのためのプラットフォームとして利用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、腹部イメージングウィンドウから修飾された新しい支持基盤統合膵臓イントコールイメージングウィンドウを用いた膵臓の生体内画像化から構成される。上記のプロトコルの中で、第1の重要なステップは、マウスにおける膵臓内イメージングウィンドウの移植である。窓の接着剤の塗布のためには、窓の余白とカバーガラスの間に接着剤を塗布することが重要…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、SNUBH研究基金からの助成金第14-2020-002、韓国政府(MSIT)が出資する韓国国立研究財団(NRF)助成金(NRF-2020R1F1F1A1058381、NRF-2020R1A2C3005694)によって支援されました。
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
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