In vivo högupplösta imaging av bukspottkörteln underlättades med bukspottskörteln intravital imaging fönster.
Direkt in vivo cellulär upplösning av bukspottkörteln i en levande liten djurmodell har varit tekniskt utmanande. En nyligen intravital imaging studie, med en buken imaging fönster, möjliggjorde visualisering av cellulära dynamiken i buken organ in vivo. Men på grund av den mjuka arkliknande arkitekturen hos mus bukspottkörteln som lätt kan påverkas av fysiologisk rörelse (t.ex. peristalsis och andning), var det svårt att utföra stabiliserad longitudinell in vivo imaging under flera veckor på cellulär nivå för att identifiera, spåra och kvantifiera holmar eller cancerceller i mus bukspottkörteln. Häri beskriver vi en metod för att implantera en ny stödjande bas, ett integrerat intravitalt avbildningsfönster i bukspottskörteln, som rumsligt kan separera bukspottkörteln från tarmen för longitudinell tidsfördröjning intravital avbildning av bukspottkörtelmikrostrukturen. Longitudinell in vivo imaging med bildframställning fönstret möjliggör stabil visualisering, vilket möjliggör spårning av holmar under en period av 3 veckor och högupplöst tredimensionell avbildning av mikrostrukturen, vilket framgår här i en ortopisk bukspottskörtelcancer modell. Med vår metod kan ytterligare intravitala avbildningsstudier belysa patofysiologin hos olika sjukdomar som involverar bukspottkörteln på cellnivå.
Bukspottkörteln är ett bukorgan med exokrin funktion i mag-tarmkanalen och en endokrin funktion av att utsöndra hormoner i blodomloppet. Högupplöst cellulär avbildning av bukspottkörteln kan avslöja patofysiologi av olika sjukdomar som omfattar bukspottkörteln, inklusive bukspottkörtelinflammation, bukspottskörtelcancer och diabetes mellitus1. Konventionella diagnostiska bildverktyg som datortomografi, magnetisk upplösning imaging och ultrasonography är allmänt tillgängliga inom det kliniska området1,2. Dessa bildframställningsmetoder är dock begränsade till att visualisera endast strukturella eller anatomiska förändringar, medan förändringar på cellulär eller molekylär nivå inte kan bestämmas. Med tanke på att molekylära förändringar i diabetes mellitus eller bukspottskörtelcancer hos människor kan initiera mer än 10 år före diagnosen3,4, har upptäckten av bukspottskörtelsjukdomar från deras molekylära övergång under den latenta perioden potential att ge en tidig diagnos och en snabb intervention. Således kommer avbildning som kommer att övervinna upplösningsbegränsningarna och ge värdefulla insikter i funktionen anmärkningsvärt få uppmärksamhet genom att ge tidig diagnos av bukspottskörtelcancer eller avancerad identifiering av förändringen av holmarna under utvecklingen av diabetes mellitus5.
Särskilt med holmar, kärnavbildning, bioluminescens imaging och optisk koherens tomografi har föreslagits som icke-invasiva holme imaging tekniker6. Upplösningen av dessa metoder är dock betydligt låg, med typiska värden som sträcker sig från flera tiotals till hundratals mikrometer, vilket ger en begränsad förmåga att upptäcka förändringar på cellnivå på holmarna. Å andra sidan utfördes tidigare högupplösta studier av holmar under ex vivo7,8 (t.ex. skivning eller matsmältning av bukspottkörteln), icke-fysiologiska9 (t.ex. utmattning av bukspottkörteln) och heterotopiskatillstånd 10,11,12 (t.ex. implantation under njurkapseln, inuti levern och i ögats främre kammare), vilket begränsar deras tolkning och kliniska konsekvenser. Om in vivo,fysiologisk och ortopisk modell av högupplöst bildbehandling kan fastställas, kommer det att vara en kritisk plattform för undersökning av bukspottskörtel holmar.
Intravital imaging, som avslöjar patofysiologin på mikroskopisk upplösningsnivå i ett levande djur, har nyligen fått stor uppmärksamhet13. Av in vivo-avbildningsmetoderna har utvecklingen av ett bukavbildningsfönster14, som implanterar ett fönster i musens buk, tillåtit upptäckten av nya fynd (dvs. ett pre-mikrometastasstadium av tidig levermetastas15 och mekanism för stamcellsunderhåll i tarmepiteel16). Även om buken imaging fönstret ger värdefulla resultat, har tillämpningarna av detta fönster för bukspottkörteln och den resulterande intravital imaging forskning baserat på sjukdomar som omfattar bukspottkörtel, inte undersökts i stor utsträckning.
Till skillnad från de väldefinierade fasta organegenskaperna hos den mänskliga bukspottkörteln är en mus bukspottkörtel en diffust fördelad mjukvävnadsliknande struktur17. Därför påverkas det oupphörligt av fysiologiska rörelser inklusive peristalsis och andning. En tidigare studie om tillämpningen av ett buken imaging fönster för bukspottkörteln visat att vandring inträffade på grund av rörelse-artefakter framkallas av tarm rörelser18. Allvarlig suddighet observerades i den resulterande genomsnittliga bilden, vilket hindrade visualisering och identifiering av mikroskala strukturer.
Häri beskriver vi användningen av en ny stödjande bas integrerad bukspottskörtel intravital bildframställning fönster kombinerat med intravital mikroskopi19,20 att undersöka longitudinella cellulära nivå händelser i sjukdomar som omfattar bukspottkörteln. Förutom en detaljerad beskrivning av metoden i den tidigare studien18kommer den utökade tillämpningen av avbildningsfönstret för bukspottskörteln för olika sjukdomar i bukspottkörteln att behandlas i detta dokument. I detta protokoll användes ett specialbyggt videohastighetslaserskanning confocal mikroskopi system som ett intravitalt mikroskopi system. Fyra lasermoduler (våglängder vid 405, 488, 561 och 640 nm) användes som excitationskälla, och fyra kanaler med emissionssignaler upptäcktes av fotomultiplierrör (PMT) genom bandpassfilter (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserskanning bestod av en roterande polygonspegel (X-axel) och en galvanometerskanningsspegel (Y-axel) som aktiverade videohastighetsskanningen (30 bilder per sekund). Detaljerad information om intravital mikroskopi har beskrivits i de tidigarestudierna 10,18,19,20,21,22,23.
I vår tidigare holmestudie18,vi framgångsrikt och stabilt avbildade holmarna i levande möss med hjälp av en transgen musmodell (MIP-GFP)24 där holmarna taggades med GFP. Metoden möjliggjorde högupplöst visualisering av förändringarna i holmarna under en period av 1 vecka. Det underlättade också avbildning av samma holmar i upp till 3 veckor, vilket tyder på genomförbarheten av långsiktiga studier av bukspottskörteln holmar för funktionell spårning eller övervakning under patogenesen vid diabetes mellitus18. Dessutom utvecklade vi en ortopisk bukspottskörtelcancer modell där fluorescerande bukspottskörteln cancerceller (PANC-1 NucLight Red)25 implanterades direkt i bukspottkörteln av musen. Med tillämpningen av bukspottskörteln intravital imaging fönster, denna modell kan användas som en plattform för att undersöka cellulära och molekylära patofysiologi i tumör microenvironment av bukspottskörteln cancer och för terapeutisk övervakning av nya läkemedelskandidater.
Protokollet som beskrivs här består av intravital imaging av bukspottkörteln med hjälp av en ny stödjande bas integrerad bukspottskörteln intravital imaging fönster ändras från en buken imaging fönster. Bland de protokoll som beskrivs ovan är det första kritiska steget implantationen av det intravitala bukspottskörteln imaging fönstret i musen. För applicering av limet i fönstret är det viktigt att applicera limet mellan fönstrets marginal och täckglaset, men inte på bukspottskörtelvävnaden, efterso…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av bidrag nr 14–2020–002 från SNUBH:s forskningsfond och av det nationella forskningsstiftelse i Korea (NRF) som finansierades av Koreas regering (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |