Summary
Apoptose kan worden gekenmerkt door flowcytometrische analyse van vroege en late apoptotische biomarkers. De cervicale kankercellijn, SiHa, werd geanalyseerd op apoptosebiomarkers na behandeling met Actinomycine D met behulp van een benchtop flowcytometer.
Abstract
Apoptose biomarkers werden onderzocht in actinomycine D-behandelde SiHa baarmoederhalskankercellen met behulp van een benchtop flow cytometer. Vroege biomarkers (Annexine V en mitochondriaal membraanpotentiaal) en late biomarkers (caspasen 3 en 7, en DNA-schade) van apoptose werden gemeten in experimentele en controleculturen. Culturen werden gedurende 24 uur geïncubeerd in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2. De cellen werden vervolgens losgemaakt met behulp van trypsine en geïnventariseerd met behulp van een flowcytometrische celtellingstest. Cellen werden verder geanalyseerd op apoptose met behulp van een Annexin V-test, een mitochondriale elektrochemische transmembraanpotentiaaltest, een caspase 3/7-test en een DNA-schadetest. Dit artikel geeft een overzicht van apoptose en traditionele flowcytometrie en werkt flowcytometrische protocollen uit voor het verwerken en analyseren van SiHa-cellen. De resultaten beschrijven positieve, negatieve en suboptimale experimentele gegevens. Ook worden interpretatie en kanttekeningen besproken bij het uitvoeren van flowcytometrische analyse van apoptose met behulp van dit analytische platform. Flowcytometrische analyse biedt een nauwkeurige meting van vroege en late biomarkers voor apoptose.
Introduction
Apoptose, geclassificeerd als type 1 geprogrammeerde celdood1, zorgt voor een evenwicht tussen celproliferatie en celdood2. Apoptose is essentieel tijdens de menselijke ontwikkeling, na letsel en voor de preventie van ziekten zoals kanker3. Intrinsieke en extrinsieke apoptotische celdood signaleringsroutes4 veroorzaken sequentiële biochemische en morfologische intracellulaire veranderingen 2,5,6. Morfologische apoptotische kenmerken kunnen worden geïdentificeerd door microscopie en de biochemische verstoring kan worden geanalyseerd door biochemische assays, waaronder flowcytometrie (FC)7.
Flowcytometrische analyse om apoptose te identificeren en de bijbehorende intracellulaire mechanismen te begrijpen, is de afgelopen twee decennia gegroeid8. FC is een wetenschappelijke methodologie die cellen analyseert in een vloeistof die door een- of meerkanaalslasers gaat (figuur 1)9,10,11. De cellen in de vloeistof worden in één bestand geconcentreerd door het fluidics-systeem van de flowcytometer met behulp van hydrodynamische focus. Terwijl cellen door de laser gaan, wordt licht verstrooid of uitgezonden door de cellen. Het verstrooide licht kan zich in de voorwaartse richting (voorwaartse verstrooiing) of naar de zijkant (zijverstrooiing) bevinden en geeft informatie over respectievelijk de celgrootte en celgranulariteit of interne structuren.
Bovendien detecteren fluorescerende reagentia, zoals fluorescerende kleurstoffen of antilichamen gelabeld met fluoroforen, specifieke oppervlakte- of intracellulaire structuren of moleculen. Wanneer de laser de fluoroforen prikkelt, wordt licht uitgezonden op een specifieke golflengte. Detectoren - meestal fotomultiplicatorbuizen - kwantificeren het verstrooide en uitgezonden licht van celmonsters. De detectoren produceren een kwantificeerbare stroom die evenredig is met de lichtverstrooiing en fluorescentie-emissie. De elektronische uitvoer wordt door computersoftware omgezet in digitale signalen om celpopulaties te identificeren op basis van celgrootte, celgranulariteit en de relatieve celfluorescentie van fluorofoor-gelabelde moleculen 9,12,13.
Figuur 1: Schematische beschrijving van de technische werking en workflow van traditionele flowcytometrie. Cellen worden gekleurd met fluorescerende reagentia en onderzocht door een laser. De gegenereerde fluorescentiesignalen worden gedetecteerd en omgezet in een elektronische uitgang, die verder wordt gedigitaliseerd en geanalyseerd door computersoftware en statistische programma's. Afkortingen: FSC = forward scatter; SSC = zijverstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
FC wordt gebruikt in zowel onderzoek als gezondheidsdiagnostiek. De twee doelen van FC in de necrobiologie zijn de opheldering van moleculaire en functionele eigenschappen van celdood en de discriminatie van verschillende vormen van celdood 14,15,16,17,18. FC-toepassingen omvatten celinventarisatie, sortering van celpopulaties, immunofenotypering, biomarkerdetectie (bijv. Apoptose-biomarkers), toxiciteitsstudies en eiwittechnologie12. Bovendien wordt FC vaak toegepast op gezondheidsdiagnostiek om te helpen bij de diagnose en monitoring van patiënten met hematologische maligniteiten. Vooruitgang in instrumentatie, fluorofoordetectie en detectorsystemen breiden FC-toepassingen uit met beeldvormingscytometrie, massacytometrie en spectrale cytometrie met bredere onderzoekstoepassingen12.
De flowcytometrische analyse van apoptose biedt voordelen ten opzichte van traditionele technieken die worden gebruikt bij het beoordelen van de gezondheid van cellen. FC kan veel afzonderlijke cellen in een heterogeen monster snel en reproduceerbaar analyseren om apoptose 3,5 te schatten. Het vermogen van FC om kwantitatieve informatie te verstrekken over celfenotypes op individuele celbasis en bulkanalyse te vermijden, biedt een superieure gevoeligheid voor Western blotting, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's), fluorometrie en spectrofotometrietechnieken die worden gebruikt bij de analyse van apoptose 8,19. Bovendien is het relatieve gemak van FC-analyse in tegenstelling tot de omslachtige en slecht reproduceerbare handmatige stappen van Western blots en ELISA's voordelig. De reproduceerbare, nauwkeurige en high-throughput analyse van FC is daarom gunstig in kankeronderzoek20.
FC maakt ook de gelijktijdige analyse van celcyclusparameters voor gezonde en abnormale apoptotische celpopulatiesmogelijk 21. Omdat apoptose een dynamisch proces is, kunnen verschillende methoden variabele resultaten opleveren en zijn ze afhankelijk van het tijdstip waarop de cellen worden geoogst22. De gelijktijdige kwantitatieve beoordeling van meerdere parameters van het celfenotype maakt de detectie van kleine subpopulaties met hoge nauwkeurigheid mogelijk, bijvoorbeeld zeldzame celsubsets met een lage frequentie van 0,01% kunnen worden gedetecteerd23. Multiparametrische FC-analyse is vooral nuttig omdat apoptotische dood optreedt langs een spectrum van vroege en late biochemische veranderingen met cellen op verschillende punten langs het apoptotische continuüm. Het gebruik van dubbele kleuring met behulp van Annexine V en propidiumjodide in FC-analyse van apoptotische cellen maakt bijvoorbeeld de categorisering van vroege apoptotische cellen, late apoptotische cellen en dode cellenmogelijk 24. De nauwkeurige detectie van apoptose in meerdere stadia voorkomt verkeerde classificatie en vals-negatieve resultaten. Multiparametrische analyse door FC verbetert dus de algemene specificiteit van het detecteren van celfenotypen en voorkomt de verkeerde classificatie van kleine populaties. Bovendien maakt celsortering op FC de isolatie van celpopulaties met een hoge zuiverheid mogelijk voor latere analyse7.
Het nadeel van FC omvat het gebruik van cellen in suspensie, wat een uitdaging kan zijn bij weefselanalyse, omdat desaggregatie van weefsel in cellen de cellulaire functie kan veranderen19. Bovendien kan het gebrek aan standaardisatie van FC-instrumentinstellingen, gegevensanalyse en testrapporten variatie in resultatenveroorzaken 19, wat de noodzaak benadrukt om FC-operators optimaal te trainen om te presteren en gegevens te analyseren en te rapporteren. Het vermogen van FC om echt apoptotisch puin van apoptotische kernen te onderscheiden, vereist bijvoorbeeld i) de juiste acquisitie-instellingen, ii) het gebruik van kalibratieparels om een diploïde DNA-piek te identificeren, en iii) negatieve en positieve celcontroles die celspecifiek zijn3. Bovendien wordt multiparametrische analyse beperkt door het aantal detectoren en moet optimale compensatie worden uitgevoerd om niet-specifieke resultaten en overloop van fluorescerende emissie bij gebruik van meerdere fluorescerende reagentiate voorkomen 25. Vooruitgang in instrument- en fluorofoortechnologie heeft de parameterdetectie verbeterd tot 30 parameters12.
De identificatie van apoptotische celdood is niet altijd eenvoudig7, en gevoelige en specifieke biomarkers moeten worden overwogen. Het Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD) beveelt aan dat meer dan één test wordt gebruikt om het proces van apoptose te bestuderen en te kwantificeren26. Microscopie-analyse voor klassieke apoptotische kenmerken26 wordt ook aanbevolen om apoptose te bevestigen en vals-positieve resultaten te voorkomen7. Vier kardinale biochemische kenmerken die vroege en late apoptotische gebeurtenissen omvatten, zijn (1) verlies van celmembraanasymmetrie; (2) dissipatie mitochondriaal membraanpotentiaal (ΔΨm); (3) caspase-activering; en (4) DNA-schade26.
Tijdens vroege apoptose wordt fosfatidylserine geëxternaliseerd naar het buitenste celmembraan 27 en kan worden gedetecteerd door Annexine V fluorescerend gelabeld met fycoerythrin27,28,29. Bovendien onderscheidt dubbele kleuring met de fluorescerende DNA-bindende kleurstof, 7-aminoactinomycine D (7-AAD), levende, laat-apoptotische en dode cellen. Daarom kleuren vroege apoptotische cellen positief voor Annexine V en negatief voor 7-AAD, in tegenstelling tot laat-apoptotische cellen, die positief kleuren voor beide kleurstoffen24.
Intrinsieke apoptotische signalen induceren dissipatie van de mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm). Het verstoorde ΔΨm veroorzaakt de afgifte van vroege pro-apoptotische eiwitten uit de mitochondriale intermembraanruimte in het cytosol27,29,30. Verandering in ΔΨm kan worden beoordeeld door dubbele kleuring met de positief geladen, lipofiele kleurstof, tetramethylrhodamine ethylester, TMRE en 7-AAD. De TMRE-kleurstof hoopt zich op in het binnenmembraan van intacte mitochondriën wanneer het membraanpotentiaal hoog is. Gedepolariseerde mitochondriën vertonen verminderde fluorescentie. Levende cellen met gepolariseerde mitochondriën (intact mitochondriaal membraan) kleuren positief voor TMRE en negatief voor 7-AAD. Dode cellen met gedepolariseerde mitochondriën kleuren negatief voor TMRE en positief voor 7-AAD31.
De caspasen zijn een familie van intracellulaire proteasen die, wanneer geactiveerd, apoptose26,27 signaleren en uitvoeren. De terminale beul caspasen (3,6,7) effect late apoptose 29,32,33. Caspase-3- en -7-activiteiten kunnen worden gemeten door een fluorescerend gelabeld substraat, dat, wanneer het wordt gesplitst, zich bindt aan DNA en een fluorescerend signaal uitzendt. Bovendien kan elk compromis aan de integriteit van het celmembraan worden beoordeeld door kleuring met 7-AAD. Apoptotische cellen kleuren positief voor de DNA-bindende kleurstof, maar negatief voor 7-AAD. Laat-apoptotische en dode cellen kleuren positief voor beide kleurstoffen34.
Late apoptose wordt gekenmerkt door DNA-schade27,29,35, die kan worden geëvalueerd door gefosforyleerde ataxiatelangiectasia gemuteerd kinase (ATM) en histon H2A.X. Dubbelstrengs DNA-breuken (DSB's) veroorzaken fosforylering van H2A.X. Fluorescerend gelabelde antilichamen tegen ATM en H2A. X kan DNA-schade vaststellen. Negatieve detectie van zowel ATM als H2A. X duidt niet op DNA-schade, terwijl detectie van beide kleurstoffen wijst op de aanwezigheid van dubbelstrengsbreuken in het DNA36.
Actinomycine D is een krachtige inductor van apoptose en werkt door binding aan DNA om transcriptie- en translatiegebeurtenissen te blokkeren37. Deze studie was gericht op het beoordelen van biochemische apoptose geïnduceerd door actinomycine D in de SiHa-cellijn door biomarkers van apoptose in een vroeg en laat stadium te analyseren. Vier biochemische biomarkers van apoptose beoordeelden de sequentiële stappen in de apoptotische cascade, waaronder verlies van celmembraanasymmetrie, verandering in mitochondriaal membraanpotentiaal, activering van terminale caspasen en DNA-schade.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol beschrijft stappen in de celvoorbereiding, celinventarisatie, celkleuring en analyse van met actinomycine D behandelde SiHa-cellen met behulp van flowcytometrische commerciële assays gemeten en geanalyseerd op een benchtop flowcytometer (figuur 2).
Figuur 2: Workflow voor de detectie van biochemische apoptotische biomarkers door flowcytometrie. Cellen worden gekweekt en behandeld zoals beschreven in protocolstap 1.1. (1) Cellen worden gekweekt, (2) geïnventariseerd en (3) gekleurd met fluorescerende reagentia, en (4) geanalyseerd door een benchtop flowcytometer. Gegevens worden verder omheind en statistisch geanalyseerd. Afkortingen: 7-AAD = 7-aminoactinomycine D; PBS = fosfaat gebufferde zoutoplossing; PE = Phycoerythrin; TMRE = tetramethylrhodamine-ethylester. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Voorbereiding van celkweek en behandelingen voor flowcytometrie
OPMERKING: Zorg ervoor dat de aseptische techniek wordt gevolgd bij het hanteren van celculturen.
- Kweek celculturen in een bevochtigde CO 2-omgeving bij 37 °C met 5% CO2. Zorg ervoor dat de celkweek voor ongeveer 70% samenvloeit in de ouderkolf voordat u cellen passeert voor experimenten.
- Haal het medium uit de kolf, was de cellen met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 500 μL trypsine toe om de cellen los te maken. Nadat de cellen beginnen te ronden en los te komen van de kolf, slaat u de basis van de kolf scherp op de bank om de cellen los te maken. Neutraliseer vervolgens de trypsine door ongeveer 5 ml vers kweekmedium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum toe te voegen voordat de cellen worden geteld.
- Zaadcellen bij 15.000 cellen/ml in 3 ml celkweekmedium in een celkweekplaat met 6 putten. Incubeer de kweekplaten een nacht bij 37 °C met 5% CO2 om de bevestiging van de cellen aan de bodem van de put mogelijk te maken.
- Behandel de experimentele culturen met 100 ng/ml actinomycine D en het medium en de oplosmiddelcontroles met respectievelijk vers kweekmedium en dimethylsulfoxide (DMSO) gedurende 24 uur. Verzamel het gebruikte medium in een tube van 15 ml en was cellen met 1x PBS. Voeg daarna de 1x PBS-wassing toe aan de tube en voeg vervolgens 500 μL trypsine toe aan de put. Neutraliseer vervolgens de trypsine door 5 ml vers kweekmedium toe te voegen.
OPMERKING: (1) Langdurige trypsine-incubatie of onvolledige neutralisatie kan de cellen verteren en hun celmembraan in gevaar brengen, wat de resultaten kan vertekenen. Bovendien kan het ook de asymmetrie van het celmembraan en dus de toegankelijkheid tot fosfatidylserine veranderen. (2) Cellen die zijn losgemaakt en naar het oppervlak zijn gedreven, kunnen in de daaropvolgende analyse worden opgenomen door het verwijderde medium gedurende 5 minuten bij 300 × g te centrifugeren en de cellen in vers kweekmedium te suspenseren.
2. Cellen inventariseren met behulp van de levensvatbaarheidstest
- Pipetteer 450 μL propidiumjodide in een microcentrifugebuis. Voeg 50 μL van de celsuspensie toe aan de microcentrifugebuis. Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Inventariseer de cellen door middel van flowcytometrie (zie rubriek 4).
- Verdun alle monsters tot een concentratie van 1 × 106 cellen/ml met celkweekmedium voordat u overgaat tot de apoptosetests.
3. Kleurcellen voor flowcytometrie
OPMERKING: Steriele omstandigheden zijn niet vereist voor dit deel van het protocol.
- Detectie van fosfatidylserine externalisatie met behulp van bijlage V
- Voeg 100 μL celsuspensie toe aan een microcentrifugebuis. Voeg 100 μL van een 1:1 mengsel van fluorescerend geconjugeerd Annexine V en 7-AAD reagens toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, beschermd tegen licht.
- Analyse van mitochondriale membraandepolarisatie
- Centrifugeer 100 μL van de celsuspensie bij 300 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml 1x PBS, voeg 100 μL TMRE-kleuringsoplossing toe aan elk monster en meng de suspensie door voorzichtig terug te pipetteren.
- Incubeer de cellen gedurende 20 minuten in een bevochtigde CO2-omgeving bij 37 °C. Wikkel de monsters in schone aluminiumfolie ter bescherming tegen licht.
OPMERKING: Mitochondriaal membraanpotentiaal is een functionele marker die gevoelig is voor kleine veranderingen in de celomgeving. Daarom moeten monsters worden geïncubeerd en gemeten onder identieke omstandigheden (temperatuur, pH en tijd verstreken tussen het begin van de incubatie en fluorescerende meting) om de reproduceerbaarheid te behouden). Merk ook op dat onvoldoende bescherming van monsters tegen licht fotobleking van fluoroforen veroorzaakt, wat resulteert in ten onrechte laag uitgestraalde fluorescentie. - Voeg na incubatie 5 μL van de 7-AAD-kleuringsoplossing toe aan elk monster en meng. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Detectie van geactiveerde terminale caspase-3 en -7 met behulp van caspasesubstraat DEVD
OPMERKING: De volgende oplossingen worden voorbereid voordat deze test wordt uitgevoerd.- Verdun het DEVD-gebonden DNA-bindende peptide in DMSO tot een verhouding van 1:8 met steriele 1x PBS om de caspase-detectie werkende oplossing te maken. Bewaar de oplossing op ijs of bij 2-8 °C, beschermd tegen licht.
OPMERKING: Elk monster vereist 5 μL van deze oplossing. - Voeg 2 μL van een 7-AAD stockoplossing toe aan 148 μL van 1x PBS om de 7-AAD werkende oplossing te maken. Bewaar de oplossing op ijs of bij 2-8 °C, beschermd tegen licht.
OPMERKING: Elk monster vereist 150 μL van deze oplossing. - Centrifugeer 50 μL van de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 × g. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 50 μL 1x PBS, gevolgd door 5 μL van de caspase-detectie werkoplossing. Meng.
- Maak de dop van de buizen los en incubeer gedurende 30 minuten in een bevochtigde CO2-omgeving bij 37 °C, beschermd tegen licht. Voeg 150 μL van de 7-AAD werkoplossing toe aan elk monster en meng. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Verdun het DEVD-gebonden DNA-bindende peptide in DMSO tot een verhouding van 1:8 met steriele 1x PBS om de caspase-detectie werkende oplossing te maken. Bewaar de oplossing op ijs of bij 2-8 °C, beschermd tegen licht.
- Detectie van dubbelstrengs DNA-breuken en totale DNA-schade
- Centrifugeer 50 μL van de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 × g. Gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de cellen in 500 μL van 1x PBS. Voeg 500 μL van een op formaldehyde gebaseerde fixatiebuffer toe en meng. Incubeer de monsters op ijs gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g en gooi het supernatant weg. Resuspendie van de cellen in 90 μL of 1x PBS in een microcentrifugebuis. Voeg 10 μL van de antilichaamoplossing toe aan de microcentrifugebuis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.
- Voeg 100 μL 1x PBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 200 μL van 1x PBS.
4. Voer monsters uit op de flowcytometer.
- Controleer de analytische prestaties van de flowcytometer door de systeemcontrolekit van het instrument uit te voeren. Ga niet verder met het uitvoeren van monsters totdat alle controles zijn voltooid en geslaagd.
- Zoek de gewenste test door door de catalogus van voorgeprogrammeerde assays op het instrument te bladeren en selecteer Run Assay.
- Meng het monster door voorzichtig terug te pipetteren voordat u het monster op de flowcytometer laadt.
OPMERKING: Voldoende mengen zorgt ervoor dat cellen in suspensie blijven en voorkomt een laag celgetal. - Laad eerst een negatief controlemonster op de flowcytometer en selecteer Uitvoeren (instellingen aanpassen) zodat het instrument het monster begint te zuigen en een realtime voorbeeld van gedetecteerde gebeurtenissen biedt. Raadpleeg de materiaaltabel voor de naam en details van het instrument.
- Pas met behulp van het live voorbeeld de drempelwaarden voor fluorescentie en celgrootte aan en teken een rechthoekige poort rond de celpopulatie. Sleep de drempelmarkering om cellulair afval uit te sluiten. Selecteer Volgende (Statusprofiel instellen) om door te gaan.
OPMERKING: Het is belangrijk om de grootte van de cellen te kennen. Sleep de schuifregelaars en observeer wijzigingen in de manier waarop gedetecteerde gebeurtenissen worden uitgezet in de real-time preview, omdat dit een nauwkeurige selectie van de drempels zal informeren. Als cellulair puin in dit stadium niet wordt uitgesloten, kan het niet worden verwijderd in analyses na acquisitie. - Tik en sleep de kwadrantmarkeringen om de celpopulaties te scheiden en zodat het instrument gedetecteerde gebeurtenissen in realtime plot. Gebruik deze plots om de eindgebruiker te begeleiden bij de juiste plaatsing van de kwadrantmarkeringen. Selecteer Volgende (Voorbeelden controleren) om door te gaan, zodat het instrument een overzicht van de instellingen weergeeft. Nadat u de instellingen hebt gecontroleerd, selecteert u Volgende (Instellingen verifiëren) om deze instellingen toe te passen op alle voorbeelden in het experiment.
OPMERKING: Het instrument biedt een live preview van 2 minuten van cellen die worden gebruikt om de instellingen van het instrument aan te passen. Als deze tijdslimiet is verstreken, geeft het instrument het monster vrij en moeten stappen 4.2.2-4.2.4 worden herhaald. Verwijder het monster en meng goed voordat u opnieuw laadt en doorgaat. - Sluit een populatie cellen af door een gebied rond de celpopulatie te tekenen. Pas drempels voor fluorescentie en celgrootte aan met de schuifregelaars op de x- en y-as van de live voorvertoning. Pas deze instellingen toe op alle voorbeelden in het experiment.
- Meng het eerste monster door voorzichtig terug te pipetteren en laad het eerste monster op de flowcytometer en selecteer Volgende. Geef het voorbeeld een naam en selecteer Uitvoeren zodat het systeem het voorbeeld begint uit te voeren.
OPMERKING: Het instrument kan slechts één sample tegelijk uitvoeren. - Zodra alle voorbeelden zijn uitgevoerd, slaat u het experiment op door het een toepasselijke titel te geven. Sla de instellingen van het huidige experiment op voor ophalen in toekomstige uitvoeringen (optioneel).
- Meng het monster door voorzichtig terug te pipetteren voordat u het monster op de flowcytometer laadt.
5. Analyse na overname
- Voer indien nodig na de acquisitie een fijnafstelling van poorten of kwadrantmarkeringen uit.
- Zoek het experiment dat moet worden aangepast door door de bestandsbrowser van het systeem te navigeren en het experiment te openen.
- Tik op het miniatuurvoorbeeld van het plot om het te vergroten. Tik op de linkerbovenhoek of rechterbenedenhoek van de celpoort om de afmetingen van de poort aan te passen. Als u de kwadrantmarkeringen wilt aanpassen, tikt u op het snijpunt van de verticale en horizontale lijnen om de markeringen te verplaatsen zoals ze zijn. Als u de hoek van een van beide lijnen wilt aanpassen, tikt u op de lijn en sleept u de greep.
- Pas de markeringen (zoals eerder beschreven in de stappen 4.1.3-4.1.4) naar wens aan en pas deze instellingen toe op alle voorbeelden in het experiment door het vinkje te selecteren, alle voorbeelden te markeren en Accepteren te selecteren.
6. Statistische analyse
- Voer tests uit in drievoud en voer een variantieanalyse (ANOVA) uit met een post-hoc Bonferroni-test om significante verschillen tussen de behandelde monsters en controles te beoordelen.
OPMERKING: De statistische test van keuze is afhankelijk van de onderzoeker en de variabelen die worden geanalyseerd.
Representative Results
De resultaten van het celgetal en de levensvatbaarheid (figuur 3) toonden aan dat 95,2% van de cellen in het monster levend was en 4,8% dood. De totale celconcentratie in het oorspronkelijke monster was 6,20 x 106 cellen/ml.
De annexine V- en celdoodtest (figuur 4) toonden een significante toename (p < 0,0001) in apoptotische cellen in SiHa-cellen behandeld met 100 ng / ml actinomycine D in vergelijking met de controles. Omdat Annexine V-kleuring in cellen tijdens apoptose in een vroeg stadium wordt verhoogd, suggereert deze bevinding dat 100 ng / ml actinomycine D apoptose in SiHa-cellen heeft geïnduceerd.
De mitochondriale elektrochemische transmembraanpotentiaaltest (figuur 5) toonde een significante afname (p < 0,0001) in celgezondheidsprofielen (levend, gedepolariseerd en levend, gedepolariseerd en dood, dood) tussen actinomycine D, mediumcontrole en oplosmiddelcontrole. Deze gegevens suggereren dat 100 ng / ml actinomycine D mitochondriale depolarisatie in SiHa-cellen veroorzaakte.
De caspase 3/7-test (figuur 6) toonde significante (p < 0,0001) activering van caspasen 3 en 7 in SiHa-cellen behandeld met 100 ng / ml actinomycine D in vergelijking met de controles. Deze bevinding toont aan dat 100 ng / ml actinomycine D apoptose in SiHa-cellen veroorzaakte.
De DNA-schadetest (figuur 7) toonde aan dat 100 ng / ml actinomycine D significant (p < 0,0001) DNA-schademarkers, ATM en H2A veroorzaakte. X, in SiHa-cellen. Deze bevinding suggereert een significante toename van DNA-schade in SiHa-cellen die zijn behandeld met actinomycine D.
De resultaten van suboptimale experimenten (figuur 8) tonen analytische overwegingen voor alle assays. Celconcentratie beïnvloedt de nauwkeurigheid van gegevens. In figuur 8A is het celgetal onaanvaardbaar laag. De gated celpopulaties in alle 4 kwadranten van de dot plot hebben een lage signaalintensiteit. De fabrikant optimaliseert de test voor 300-700 cellen/μL in het uiteindelijke monstervolume. Dit voorbeeld illustreert het belang van het gebruik van de juiste monsterconcentratie die door de fabrikant is voorgeschreven.
Daarnaast zorgden hoge celconcentraties ook voor foutieve resultaten (figuur 8B). Middelgrote en experimentele culturen toonden respectievelijk 99,95% en 100% levende cellen. De stroomsnelheid voor beide assays overschreed de door de fabrikant geoptimaliseerde concentratie van 100-500 cellen/μL en vereiste verdunning met 1x Assay Buffer om onnauwkeurige analyse te voorkomen.
Celklontering moet worden vermeden tijdens de bereiding van experimentele culturen, omdat dit valse resultaten oplevert als gevolg van verhoogde celgrootte-indices, zoals geïllustreerd in de bijlage V-test. Figuur 8C toont een dubbel probleem van hoge celconcentratie dat de instructies van de fabrikant overschrijdt en celklontering, zoals blijkt uit celgrootte-indices van meer dan 4 in de SiHa-mediumcontrole. De hoge celconcentratie wordt geïllustreerd door de velling van cellen die een felrood vlak van cellen vormen in middelgrote culturen, wat dissonant hoge apoptotische celpopulaties aantoont.
Langdurige kleuring van culturen kan leiden tot niet-specifieke binding van eiwitten en resulteren in valse resultaten, zoals aangetoond door de bijlage in V-test. Figuur 8D toont vergelijkbare resultaten voor middelgrote en experimentele culturen als gevolg van langdurige kleuring.
Slechte monsterbehandeling, uitgebreide trypsinisatie van aanhangende cellen, krachtig pipetteren tijdens wasstappen en snelle en langdurige centrifugatiestappen veroorzaken cellysis en grote hoeveelheden celresten. In figuur 8E tonen culturen geanalyseerd met de caspase 3/7-test een verhoogd celpuin aan, wat blijkt uit een kleine celgrootte-index (< 2,2 celgrootte-index). Daarom moet voorzichtigheid worden betracht bij het voorbereiden van monsters voor gegevensverzameling.
Figuur 3: Celtelling en levensvatbaarheidstest. Het populatieprofiel scheidt puin van levende en dode cellen. De tweedimensionale dot plot is gated en verdeelt levende en dode celpopulaties. Het informatiepaneel biedt kwantitatieve gegevens over het aantal cellen, het percentage totale levensvatbare cellen en het totale aantal levensvatbare cellen in het monster. Deze gegevens kunnen worden gebruikt om het celgetal in alle monsters te standaardiseren voor latere apoptose-analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bijlage V-gehalte. Alle monsters tonen identieke gatingparameters en statistische analyse van elke subpopulatie onthult een significante toename van apoptose in cellen behandeld met actinomycine D. Alle assays werden uitgevoerd als drie onafhankelijke experimenten en elk experiment werd in drievoud getest. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD en p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Mitochondriale elektrochemische transmembraanpotentiaaltest. Alle monsters tonen identieke gatingparameters en statistische analyse van elke subpopulatie onthult significante verstoring van mitochondriaal membraanpotentiaal in cellen behandeld met actinomycine D. Alle assays werden uitgevoerd als drie onafhankelijke experimenten en elk experiment werd in drievoud getest. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD en p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Caspase 3/7 detectietest. Alle monsters tonen identieke gatingparameters en statistische analyse van elke subpopulatie onthult een significante toename van caspase 3/7-activiteit in cellen behandeld met actinomycine D. Alle assays werden uitgevoerd als drie onafhankelijke experimenten en elk experiment werd in drievoud getest. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD en p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: DNA-schadetest. Alle monsters tonen identieke gatingparameters en statistische analyse van elke subpopulatie onthult een significante toename van dubbelstrengs DNA-schade en totale DNA-schade in cellen behandeld met actinomycine D. Alle testen werden uitgevoerd op drie onafhankelijke experimenten en elk experiment werd in drievoud getest. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD en p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Suboptimale experimentele omstandigheden leveren slechte resultaten op . (A) Lage concentratie cellen, (B) hoge concentratie cellen, (C) celklontering en aggregatie duidelijk door hoge celgrootte-index, (D) langdurige kleuring van celmonsters duidelijk door verhoogde positieve kleuring in beide monsters, en (E) slechte monsterbehandeling duidelijk door verhoogd cellulair puin (celgrootte-index < 2.2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
In deze studie onthulden actinomycine D-behandelde SiHa-cellen geanalyseerd door FC significante vroege en late biomarkers voor apoptose. Suboptimale omstandigheden voor celvoorbereiding, inventarisatie en kleuring identificeerden onnauwkeurige resultaten, waarbij de nadruk werd gelegd op de noodzaak van nauwe naleving van de instructies van de fabrikant bij het uitvoeren van FC.
Deze studie van apoptose door vroege en late biomarkeridentificatie voldoet aan de NCCD-richtlijnen1 voor het onderzoeken van apoptose. Actinomycine D-behandelde SiHa-culturen toonden positieve biomarkers voor vroege en late apoptotische stadia. De Annexin V/PI-test en de mitochondriale permeabiliteitstest toonden aan dat actinomycine D respectievelijk een PS-flip-patroon en dissipatie van de mitochondriale membraanovergang induceerde. Zodra apoptotische cellen het point of no return bereiken, geïnduceerd door mitochondriale verstoring, worden de terminale caspasen geactiveerd 3,7. De activering van de terminale caspasen 3 en 7 die in deze studie zijn waargenomen, duidt op apoptose in een laat stadium. Bovendien veroorzaakt terminale caspase-activering internucleosomale DNA-splitsing en uitgebreide DNA-fragmentatie, die klassiek is gerapporteerd als een trapladderpatroon waargenomen door gel-elektroforese28,38.
De nucleaire schade met de ATM en H2A. X FC DNA-schadetest toonde dubbelstrengsbreuken in DNA en totale DNA-schade. Deze resultaten bevestigden klassieke downstream caspase-geïnduceerde apoptotische nucleaire schade (karyoorrhexis en karyorrlyse) in experimentele culturen. Het gebruik van meerdere flowcytometrische biomarkers detecteerde dus de sequentiële meertrapsgebeurtenissen in apoptose en nauwkeurig en reproduceerbaar geïdentificeerde celpopulaties in vroege en late apoptotische stadia. Deze bevindingen komen overeen met de bekende pro-apoptotische kenmerken van actinomycine D bij de behandeling van kanker bij mensen 37,39,40,41 en ondersteunen verder het gebruik van actinomycine D als een positieve controle in FC-celkweekexperimenten die apoptose onderzoeken.
De gating van celpopulaties in deze studie werd geïnformeerd door negatieve medium- en oplosmiddelcontroles, die apoptotische van gezonde cellen scheidden. Als alternatief kan een mengsel van populaties van positieve en negatieve controles ook worden gebruikt om levende en apoptotische celpopulaties te definiëren om celpopulatiepoorten 7,9 in te stellen. Zodra zieke en gezonde cellulaire toestanden zijn gedefinieerd en afgeschermd, kunnen de sjablooninstellingen worden toegepast op alle volgende experimentele en controleculturen.
Strikte naleving van het FC-protocol is essentieel om valse resultaten te voorkomen. Tijdens de optimalisatie van het protocol werden de volgende problemen waargenomen: (1) lage celconcentratie, (2) hoge celconcentratie, (3) celklontering, (4) langdurige kleuring en (5) slechte monsterbehandeling. Deze problemen kunnen worden voorkomen door strikte naleving van geoptimaliseerde protocolvereisten. Dit benadrukt de cruciale aard van pre-analytische en analytische stappen voor FC om nauwkeurige gegevens te verkrijgen. Tijdens de celvoorbereiding moeten trypsinisatie, pipetteren, centrifugeren en verdunningen met zorg worden uitgevoerd. Over-trypsinisatie en krachtig pipetteren kunnen resulteren in respectievelijk chemische en mechanische afschuiving van cellen. Langdurige en snelle centrifugatie kan leiden tot celafbraak en hoge cellulaire puintellingen. Optimale celconcentratie is vereist om de onjuiste verwerving van celgebeurtenissen te minimaliseren. Daarom moeten primaire celsuspensies worden verdund om een optimale celconcentratie te verkrijgen.
Bovendien moet er bij het hanteren van monsters op worden gelet dat celklontering en celfragmentatie worden voorkomen en dat cellen tijdens de analyse in suspensie blijven. Monsterbehandeling om celklontering te voorkomen, maakt een enkele laminaire celstroom mogelijk, voorkomt mechanische blokkering van de capillaire buizen van het instrument en beteugelt valse grote celgrootte-indexen. Een ander voorbehoud is het beschermen van culturen tegen licht om foto-oxidatie te voorkomen en het blussen van de fluoroforen in de testen om vals-negatieve resultaten te voorkomen. Er moet voor worden gezorgd dat er een minimale blootstelling aan licht is bij de kleuringsstap van de cellen en de daaropvolgende verwerkingsstappen. Bovendien kunnen langdurige immunostainingtijden resulteren in vals-positieve resultaten omdat eiwitten niet-specifiek gekleurd zijn. Daarom is het belangrijk om zich te houden aan door de fabrikant voorgeschreven incubatiekleuringsperioden.
Samenvattend kan FC apoptose nauwkeurig detecteren en onderscheid maken tussen vroege en late apoptosebiomarkers in celkweek. Bovendien heeft technologische vooruitgang geleid tot de productie van benchtop flowcytometers voor niet-deskundige wetenschappers om celgezondheid en complexe intracellulaire signaleringsroutes te bestuderen.
Disclosures
Luminex® Corporation was zo vriendelijk om artikelverwerkingskosten te verstrekken.
Acknowledgments
De studie werd financieel ondersteund door de National Research Foundation (NRF) en de South African Medical Research Council (SAMRC). We willen graag de National Health Laboratory Service (NHLS) bedanken voor de aankoop van de Guava Muse Cell Analyzer. Alle figuren in deze publicatie zijn gemaakt met Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plates | Lasec | P1PLA044C-000006 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM | ThermoFisher | 41966052 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | P10-040500 | |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | |
| Microcentrifuge tubes/Eppendorf | Merck | EP0030122208-200EA | |
| Muse Annexin V kit | Merck | MCH100105 | |
| Muse Caspase-3/7 kit | Merck | MCH100108 | |
| Muse Count and Viability kit | Merck | MCH600103 | |
| Muse DNA Damage kit | Merck | MCH200107 | |
| Muse MitoPotential kit | Merck | MCH100110 | |
| PBS Buffer | ThermoFisher | 70013065 | |
| Pen-strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| SiHa cells | ATCC | CRL-1550 | |
| T25 culture flasks | Sigma-Aldrich | C6231 | |
| Trypsin | Pan Biotech | P10-040500 |
References
- Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
- Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).
- Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16 (6), 663-669 (2004).
- Arends, M. J., Morris, R. G., Wyllie, A. H.
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).
- Darzynkiewicz, Z., Traganos, F. Apoptosis. Al-Rubeai, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 33-73 (1998).
- Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z.
- Bio-Rad Laboratories. Introduction to Flow Cytometry Basics. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html (2021).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Detection of localized caspase activity in early apoptotic cells by laser scanning cytometry. Cytometry. 47 (2), 81-88 (2002).
- Castedo, M., et al. Quantitation of mitochondrial alterations associated with apoptosis. J Immunol Methods. 265 (1-2), 39-47 (2002).
- McKinnon, K. M.
- Macey, M. G. Flow cytometry: principles and clinical applications. Med Lab Sci. 45 (2), 165-173 (1988).
- Darzynkiewicz, Z., et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).
- Darzynkiewicz, Z., et al. Cytometry in cell necrobiology: Analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis). Cytometry. 27 (1), 1-20 (1997).
- Ormerod, M. G. The study of apoptotic cells by flow cytometry. Leukemia. 12 (7), 1013-1025 (1998).
- van Engeland, M., Nieland, L. J., Ramaekers, F. C., Schutte, B., Reutelingsperger, C. P. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry. 31 (1), 1-9 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. Journal of Immunological Methods. 243 (1), 167-190 (2000).
- Jahan-Tigh, R. R., Ryan, C., Obermoser, G., Schwarzenberger, K.
- Lövborg, H., Gullbo, J., Larsson, R. Screening for apoptosis-classical and emerging techniques. Anti-cancer drugs. 16 (6), 593-599 (2005).
- Vorobjev, I. A., Barteneva, N. S. Multi-parametric imaging of cell heterogeneity in apoptosis analysis. Methods. 112, 105-123 (2017).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods in molecular biology. 263, Clifton, N.J. 141-160 (2004).
- Kagami, S., Rizzo, H. L., Lee, J. J., Koguchi, Y., Blauvelt, A. Circulating Th17, Th22, and Th1 cells are increased in psoriasis. J Invest Dermatol. 130 (5), 1373-1383 (2010).
- Luminex Corporation. Muse® Annexin V & Dead Cell Kit. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-annexin-v-dead-cell-kit/ (2019).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
- Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 1463-1467 (2005).
- Apoptosis assays and markers guide. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/kits/apoptosis-assays (2021).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Saelens, X., et al. Toxic proteins released from mitochondria in cell death. Oncogene. 23 (16), 2861-2874 (2004).
- Muse™ MitoPotential Kit User's Guide. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-mitopotential-kit (2013).
- McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (4), 008656 (2013).
- Wigdal, S. S., Kirkland, R. A., Franklin, J. L., Haak-Frendscho, M. Cytochrome c release precedes mitochondrial membrane potential loss in cerebellar granule neuron apoptosis: lack of mitochondrial swelling. Journal of Neurochemistry. 82 (5), 1029-1038 (2002).
- Muse® Caspase-3/7 Kit. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-caspase-3-7-kit/#overview (2019).
- Häcker, G.
- Muse® Multi-Color DNA Damage Kit User's Guide. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-multi-color-dna-damage-kit/#overview (2020).
- Kleeff, J., Kornmann, M., Sawhney, H., Korc, M. Actinomycin D induces apoptosis and inhibits growth of pancreatic cancer cells. International journal of cancer. 86 (3), 399-407 (2000).
- Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances. Experimental oncology. 34 (3), 255-262 (2012).
- Szeberenyi, J. The effect of actinomycin D on RNA metabolism in human cells. Biochem Mol Biol Educ. 34 (1), 50-51 (2006).
- Ginell, S., Lessinger, L., Berman, H. M. The crystal and molecular structure of the anticancer drug actinomycin D--some explanations for its unusual properties. Biopolymers. 27 (5), 843-864 (1988).
- Hou, M. H., Robinson, H., Gao, Y. G., Wang, A. H. Crystal structure of actinomycin D bound to the CTG triplet repeat sequences linked to neurological diseases. Nucleic Acids Res. 30 (22), 4910-4917 (2002).
