Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं में एपोप्टोटिक बायोमार्कर का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62663
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Chemical Pathology, Faculty of Health Sciences, University of Pretoria, 2Tshwane Academic Division, National Health Laboratory Service

Summary

एपोप्टोसिस को प्रारंभिक और देर से एपोप्टोटिक बायोमार्कर के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा चिह्नित किया जा सकता है। सर्वाइकल कैंसर सेल लाइन, सिहा, का विश्लेषण बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके एक्टिनोमाइसिन डी के साथ उपचार के बाद एपोप्टोसिस बायोमार्कर के लिए किया गया था।

Abstract

एपोप्टोसिस बायोमाकर्स की जांच एक बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा गर्भाशय ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं में की गई थी। एपोप्टोसिस के प्रारंभिक बायोमाकर्स (एनेक्सिन वी और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता) और देर से बायोमाकर्स (कैसपेस 3 और 7, और डीएनए क्षति) को प्रयोगात्मक और नियंत्रण संस्कृतियों में मापा गया था। संस्कृतियों को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। कोशिकाओं को तब ट्रिप्सिन का उपयोग करके अलग किया गया था और प्रवाह साइटोमेट्रिक सेल काउंट परख का उपयोग करके गणना की गई थी। कोशिकाओं को एनेक्सिन वी परख, एक माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रोकेमिकल ट्रांसमेम्ब्रेन संभावित परख, एक कैसपेस 3/7 परख और एक डीएनए क्षति परख का उपयोग करके एपोप्टोसिस के लिए विश्लेषण किया गया था। यह लेख एपोप्टोसिस और पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री का अवलोकन प्रदान करता है, और एसआईएचए कोशिकाओं के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक प्रोटोकॉल को विस्तृत करता है। परिणाम सकारात्मक, नकारात्मक और उप-इष्टतम प्रयोगात्मक डेटा का वर्णन करते हैं। इस विश्लेषणात्मक मंच का उपयोग करके एपोप्टोसिस के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण करने में व्याख्या और चेतावनी पर भी चर्चा की गई है। फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण एपोप्टोसिस के लिए प्रारंभिक और देर से बायोमार्कर का सटीक माप प्रदान करता है।

Introduction

एपोप्टोसिस, टाइप 1 प्रोग्राम्ड सेल डेथ1 के रूप में वर्गीकृत, सेल प्रसार और सेल डेथ2 के बीच संतुलन सुनिश्चित करता है। एपोप्टोसिस मानव विकास के दौरान, चोट के बाद,और कैंसर जैसी बीमारियों की रोकथाम के लिए आवश्यक है। आंतरिक और बाह्य एपोप्टोटिक सेल डेथ सिग्नलिंग मार्ग4 अनुक्रमिक जैव रासायनिक और रूपात्मक इंट्रासेल्युलर परिवर्तन 2,5,6 का कारण बनता है। रूपात्मक एपोप्टोटिक विशेषताओं को माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जा सकता है, और जैव रासायनिक गड़बड़ी का विश्लेषण जैव रासायनिक परख द्वारा किया जा सकता है, जिसमें फ्लो साइटोमेट्री (एफसी)7 शामिल है।

एपोप्टोसिस की पहचान करने और संबंधित इंट्रासेल्युलर तंत्र को समझने के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण पिछलेदो दशकों में बढ़ गया है। एफसी एक वैज्ञानिक पद्धति है जो एक तरल पदार्थ में कोशिकाओं का विश्लेषण करती है जो एकल या बहु-चैनल लेजर (चित्रा 1)9,10,11 से गुजरती है। द्रव में कोशिकाओं को हाइड्रोडायनामिक फोकसिंग का उपयोग करके फ्लो साइटोमीटर की फ्लुइडिक्स प्रणाली द्वारा एक एकल फ़ाइल में केंद्रित किया जाता है। जैसे ही कोशिकाएं लेजर से गुजरती हैं, प्रकाश कोशिकाओं से बिखर जाता है या उत्सर्जित होता है। बिखरा हुआ प्रकाश आगे की दिशा (आगे स्कैटर) या साइड (साइड स्कैटर) की ओर हो सकता है और क्रमशः सेल के आकार, और सेल ग्रैन्यूलैरिटी या आंतरिक संरचनाओं के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

इसके अलावा, फ्लोरोसेंट अभिकर्मक, जैसे फ्लोरोसेंट रंजक या फ्लोरोफोर के साथ लेबल किए गए एंटीबॉडी, विशिष्ट सतह या इंट्रासेल्युलर संरचनाओं या अणुओं का पता लगाते हैं। जब लेजर फ्लोरोफोरेस को उत्तेजित करता है, तो प्रकाश एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर उत्सर्जित होता है। डिटेक्टर - आमतौर पर फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब - सेल नमूनों से बिखरे और उत्सर्जित प्रकाश की मात्रा निर्धारित करते हैं। डिटेक्टर एक मात्रात्मक धारा का उत्पादन करते हैं जो प्रकाश स्कैटर और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के आनुपातिक है। इलेक्ट्रॉनिक आउटपुट को सेल आकार, सेल ग्रैन्यूलैरिटी और फ्लोरोफोरे-लेबल अणुओं के सापेक्ष सेल फ्लोरेसेंस 9,12,13 के आधार पर सेल आबादी की पहचान करने के लिए कंप्यूटिंग सॉफ्टवेयर द्वारा डिजिटल सिग्नल में परिवर्तित किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री के तकनीकी संचालन और वर्कफ़्लो का वर्णन करने वाला योजनाबद्ध। कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों से दाग दिया जाता है और लेजर द्वारा जांच की जाती है। उत्पन्न प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाया जाता है और उन्हें इलेक्ट्रॉनिक आउटपुट में परिवर्तित किया जाता है, जिसे कंप्यूटर सॉफ्टवेयर और सांख्यिकीय कार्यक्रमों द्वारा आगे डिजिटाइज़ और विश्लेषण किया जाता है। संक्षेप: एफएससी = फॉरवर्ड स्कैटर; एसएससी = साइड स्कैटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एफसी का उपयोग अनुसंधान और स्वास्थ्य निदान दोनों में किया जाता है। नेक्रोबायोलॉजी में एफसी के दो लक्ष्य कोशिका मृत्यु के आणविक और कार्यात्मक गुणों की व्याख्या और कोशिका मृत्युके विभिन्न तरीकों के भेदभाव 14,15,16,17,18 हैं। एफसी अनुप्रयोगों में सेल गणना, सेल आबादी की छंटाई, इम्यूनोफेनोटाइपिंग, बायोमार्कर डिटेक्शन (जैसे, एपोप्टोसिस बायोमार्कर), विषाक्तता अध्ययन और प्रोटीन इंजीनियरिंग12 शामिल हैं। इसके अलावा, एफसी को आमतौर पर स्वास्थ्य निदान के लिए लागू किया जाता है ताकि हेमेटोलॉजिकल विकृतियों वाले रोगियों के निदान और निगरानी में सहायता मिल सके। इंस्ट्रूमेंटेशन, फ्लोरोफोरे डिटेक्शन और डिटेक्टर सिस्टम में प्रगति व्यापक अनुसंधान अनुप्रयोगों के साथ इमेजिंग साइटोमेट्री, मास साइटोमेट्री और स्पेक्ट्रल साइटोमेट्री को शामिल करने के लिएएफसी अनुप्रयोगों का विस्तार कर रही है।

एपोप्टोसिस का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण सेल स्वास्थ्य का आकलन करने में उपयोग की जाने वाली पारंपरिक तकनीकों पर लाभ प्रदान करता है। एफसी एपोप्टोसिस 3,5 का अनुमान लगाने के लिए एक हेटरोजेनस नमूने में कई एकल कोशिकाओं का तेजी से और पुन: विश्लेषण कर सकता है। व्यक्तिगत सेल आधार पर सेल फेनोटाइप्स पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने और थोक विश्लेषण से बचने के लिए एफसी की क्षमता, पश्चिमी सोख्ता, एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट एसेस (ईएलआईएसए), फ्लोरोमेट्री और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री तकनीकों के लिए बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करती है जो एपोप्टोसिस 8,19 के विश्लेषण में उपयोग की जाती हैं। इसके अलावा, पश्चिमी ब्लॉट्स और ईएलआईएसए के बोझिल और खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मैनुअल चरणों के विपरीत एफसी विश्लेषण की सापेक्ष आसानी फायदेमंद है। एफसी का प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सटीक और उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण इसलिए कैंसर अनुसंधानमें फायदेमंद है।

एफसी स्वस्थ और असामान्य एपोप्टोटिकसेल आबादी के लिए सेल चक्र मापदंडों के एक साथ विश्लेषण की भी अनुमति देता है। चूंकि एपोप्टोसिस एक गतिशील प्रक्रिया है, विभिन्न विधियां परिवर्तनीय परिणाम उत्पन्न कर सकती हैं और उस समय-बिंदु पर निर्भर होती हैं जिस पर कोशिकाओं कोकाटा जाता है। सेल फेनोटाइप के कई मापदंडों का एक साथ मात्रात्मक मूल्यांकन उच्च सटीकता के साथ मामूली उप-आबादी का पता लगाने की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, 0.01% की कम आवृत्ति वाले दुर्लभ सेल उपसमुच्चयका पता लगाया जा सकता है। मल्टी-पैरामीट्रिक एफसी विश्लेषण विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि एपोप्टोटिक मृत्यु एपोप्टोटिक निरंतरता के साथ विभिन्न बिंदुओं पर कोशिकाओं के साथ प्रारंभिक और देर से जैव रासायनिक परिवर्तनों के स्पेक्ट्रम के साथ होती है। उदाहरण के लिए, एपोप्टोटिक कोशिकाओं के एफसी विश्लेषण में एनेक्सिन वी और प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करके दोहरे धुंधलापन का उपयोग प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं, देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं और मृत कोशिकाओंके वर्गीकरण को सक्षम बनाता है। कई चरणों में एपोप्टोसिस का सटीक पता लगाने से गलत वर्गीकरण और गलत-नकारात्मक परिणामों से बचा जा सकता है। इस प्रकार, एफसी द्वारा मल्टीपैरामीट्रिक विश्लेषण सेल फेनोटाइप का पता लगाने की समग्र विशिष्टता में सुधार करता है और मामूली आबादी के गलत वर्गीकरण से बचता है। इसके अलावा, एफसी द्वारा सेल सॉर्टिंग बाद के विश्लेषण के लिए उच्च शुद्धता के साथ सेल आबादी के अलगाव की अनुमति देताहै।

एफसी के नुकसान में निलंबन में कोशिकाओं का उपयोग शामिल है, जो ऊतक विश्लेषण में चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि कोशिकाओं में ऊतक के विघटन से सेलुलर फ़ंक्शन19 बदल सकता है। इसके अलावा, एफसी उपकरण सेटअप, डेटा विश्लेषण और परख रिपोर्ट के मानकीकरण की कमी से परिणाम19 में भिन्नता हो सकती है, जिससे एफसी ऑपरेटरों को प्रदर्शन करने और डेटा का विश्लेषण और रिपोर्ट करने के लिए बेहतर प्रशिक्षण की आवश्यकता पर जोर दिया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एपोप्टोटिक नाभिक से सच्चे एपोप्टोटिक मलबे को अलग करने के लिए एफसी की क्षमता की आवश्यकता होती है i) उचित अधिग्रहण सेटिंग्स, ii) एक द्विगुणित डीएनए शिखर की पहचान करने के लिए अंशांकन मोतियों का उपयोग, और iii) नकारात्मक और सकारात्मक सेल नियंत्रण जो सेल-विशिष्टहैं 3। इसके अलावा, मल्टीपैरामीट्रिक विश्लेषण डिटेक्टरों की संख्या से सीमित है, और कई फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों25 का उपयोग करते समय गैर-विशिष्ट परिणामों और फ्लोरोसेंट उत्सर्जन के स्पिलओवर से बचने के लिए इष्टतम मुआवजा करने की आवश्यकता है। उपकरण और फ्लोरोफोरे प्रौद्योगिकी में प्रगति ने पैरामीटर का पता लगाने में 30 मापदंडों तक सुधार कियाहै।

एपोप्टोटिक सेल मृत्यु की पहचानहमेशा सरल नहीं होती है, और संवेदनशील और विशिष्ट बायोमार्कर पर विचार किया जाना चाहिए। कोशिका मृत्यु पर नामकरण समिति (एनसीसीडी) ने सिफारिश की है कि एपोप्टोसिस26 की प्रक्रिया का अध्ययन और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक से अधिक परख का उपयोग किया जाए। शास्त्रीय एपोप्टोटिक विशेषताओं26 के लिए माइक्रोस्कोपी विश्लेषण भी एपोप्टोसिस की पुष्टि करने और झूठे-सकारात्मकपरिणामों से बचने के लिए अनुशंसित है। चार कार्डिनल जैव रासायनिक विशेषताएं जो शुरुआती और देर से एपोप्टोटिक घटनाओं का विस्तार करती हैं, (1) कोशिका झिल्ली विषमता का नुकसान; (2) अपव्यय माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (त्रिभुज); (3) कैसपेस सक्रियण; और (4) डीएनए क्षति26.

प्रारंभिक एपोप्टोसिस के दौरान, फॉस्फेटिडिलसेरिन को बाहरी कोशिका झिल्ली 27 में बाहरी रूप दिया जाता है और एनेक्सीन वी फ्लोरोसेंटली द्वारा फाइकोएरिथ्रिन27,28,29 के साथ लेबल किया जा सकता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट डीएनए-बाइंडिंग डाई, 7-एमिनोएक्टिनोमाइसिन डी (7-एएडी) के साथ दोहरी धुंधलापन, जीवित, देर से एपोप्टोटिक और मृत कोशिकाओं को अलग करता है। इसलिए, शुरुआती-एपोप्टोटिक कोशिकाएं एनेक्सीन वी के लिए सकारात्मक और 7-एएडी के लिए नकारात्मक दाग लगाती हैं, देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं के विपरीत, जो दोनों रंगों के लिए सकारात्मक दागलगाती हैं।

आंतरिक एपोप्टोटिक संकेत माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता के अपव्यय को प्रेरित करते हैं ।. बाधित त्रिभुज माइटोकॉन्ड्रियल इंटरमेम्ब्रेन स्पेस से साइटोसोल 27,29,30 में प्रारंभिक प्रो-एपोप्टोटिक प्रोटीन की रिहाई का कारण बनता है। सकारात्मक रूप से चार्ज, लिपोफिलिक डाई, टेट्रामेथिलरोडामाइन एथिल एस्टर, टीएमआरई, और 7-एएडी के साथ दोहरे धुंधलापन द्वारा त्रिभुज में परिवर्तन का आकलन किया जा सकता है। टीएमआरई डाई बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया की आंतरिक झिल्ली के भीतर जमा होती है जब झिल्ली क्षमता अधिक होती है। विध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया प्रतिदीप्ति में कमी का प्रदर्शन करते हैं। ध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया (बरकरार माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली) के साथ जीवित कोशिकाएं टीएमआरई के लिए सकारात्मक और 7-एएडी के लिए नकारात्मक दाग देती हैं। विध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया के साथ मृत कोशिकाएं टीएमआरई के लिए नकारात्मक और 7-एएडी31 के लिए सकारात्मक हैं।

कैसपेस इंट्रासेल्युलर प्रोटीज का एक परिवार है, जो सक्रिय होने पर, एपोप्टोसिस26,27 को संकेत और निष्पादित करता है। टर्मिनल निष्पादक कैसपेस (3,6,7) देर से एपोप्टोसिस 29,32,33 को प्रभावित करता है। कैसपेस -3 और -7 गतिविधियों को फ्लोरोसेंटली लेबल सब्सट्रेट द्वारा मापा जा सकता है, जो जब क्लीवर किया जाता है, तो डीएनए को बांधता है और एक फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्सर्जित करता है। इसके अलावा, कोशिका झिल्ली अखंडता के लिए किसी भी समझौते का मूल्यांकन 7-एएडी के साथ धुंधला करके किया जा सकता है। एपोप्टोटिक कोशिकाएं डीएनए-बाइंडिंग डाई के लिए सकारात्मक दाग देती हैं लेकिन 7-एएडी के लिए नकारात्मक होती हैं। लेट-एपोप्टोटिक और मृत कोशिकाएं दोनों रंगों के लिए सकारात्मक दागलगाती हैं।

देर से एपोप्टोसिस को डीएनए क्षति27,29,35 की विशेषता है, जिसका मूल्यांकन फॉस्फोराइलेटेड एटैक्सिएटेलेंजिक्टेसिया उत्परिवर्तित किनेज (एटीएम) और हिस्टोन एच 2 ए.एक्स द्वारा किया जा सकता है। एक्स डीएनए क्षति निर्धारित कर सकता है। एटीएम और एच 2 ए दोनों का नकारात्मक पता लगाना। एक्स कोई डीएनए क्षति का संकेत नहीं देता है, जबकि दोनों रंगों का पता लगाने से डीएनए36 में डबल-स्ट्रैंड ब्रेक की उपस्थिति का संकेत मिलता है।

एक्टिनोमाइसिन डी एपोप्टोसिस का एक शक्तिशाली प्रेरक है और प्रतिलेखन औरअनुवाद घटनाओं को अवरुद्ध करने के लिए डीएनए से बंधकर कार्य करता है। इस अध्ययन का उद्देश्य एपोप्टोसिस के शुरुआती और अंतिम चरण के बायोमार्कर का विश्लेषण करके सिहा सेल लाइन में एक्टिनोमाइसिन डी द्वारा प्रेरित जैव रासायनिक एपोप्टोसिस का आकलन करना था। एपोप्टोसिस के चार जैव रासायनिक बायोमाकर्स ने एपोप्टोटिक कैस्केड में अनुक्रमिक चरणों का आकलन किया जिसमें कोशिका झिल्ली विषमता का नुकसान, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में परिवर्तन, टर्मिनल कैसपेस की सक्रियता और डीएनए क्षति शामिल थी।

Protocol

नोट: यह प्रोटोकॉल सेल तैयारी, सेल गणना, सेल धुंधला, और एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा कोशिकाओं के विश्लेषण में चरणों का वर्णन करता है, जो फ्लो साइटोमेट्रिक वाणिज्यिक परख का उपयोग करके बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर (चित्रा 2) पर मापा और विश्लेषण किया जाता है।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लो साइटोमेट्री द्वारा जैव रासायनिक एपोप्टोटिक बायोमार्कर का पता लगाने के लिए वर्कफ़्लो। प्रोटोकॉल चरण 1.1 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को सुसंस्कृत और इलाज किया जाता है। (1) कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जाता है, (2) गणना की जाती है और (3) फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों से सना होता है, और (4) एक बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर द्वारा विश्लेषण किया जाता है। डेटा को आगे गेट किया जाता है, और सांख्यिकीय रूप से विश्लेषण किया जाता है। संक्षेप: 7-एएडी = 7-एमिनोएक्टिनोमाइसिन डी; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; टीएमआरई = टेट्रामेथिलरोडामाइन एथिल एस्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. फ्लो साइटोमेट्री के लिए सेल कल्चर और उपचार की तैयारी

नोट: सुनिश्चित करें कि सेल संस्कृतियों को संभालते समय सड़न रोकनेवाला तकनीक का पालन किया जाता है।

  1. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर सीओ2 वातावरण में सेल कल्चर विकसित करें। सुनिश्चित करें कि प्रयोगों के लिए कोशिकाओं को पास करने से पहले मूल फ्लास्क में सेल कल्चर लगभग 70% कंफ्लुएंट है।
  2. फ्लास्क से माध्यम निकालें, 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धोएं और कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्रिप्सिन के 500 μL जोड़ें। जब कोशिकाएं फ्लास्क से गोल और अलग होने लगती हैं, तो कोशिकाओं को अलग करने के लिए बेंच पर फ्लास्क के आधार को तेजी से खटखटाएं। फिर कोशिकाओं की गिनती से पहले 10% भ्रूण बछड़े के सीरम के साथ पूरक लगभग 5 एमएल ताजा कल्चर माध्यम जोड़कर ट्रिप्सिन को बेअसर करें।
  3. 6-वेल सेल कल्चर प्लेट में 3 एमएल सेल कल्चर माध्यम में 15,000 कोशिकाओं / एमएल पर बीज कोशिकाएं। 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कल्चर प्लेटों को इनक्यूबेट करें ताकि कोशिकाओं को कुएं के तल से जोड़ा जा सके।
  4. प्रायोगिक संस्कृतियों को 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी और मध्यम और विलायक नियंत्रण के साथ क्रमशः ताजा संस्कृति माध्यम और डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ 24 घंटे के लिए इलाज करें। खर्च किए गए माध्यम को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें और 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं। इसके बाद, ट्यूब में 1x PBS वॉश जोड़ें, और फिर कुएं में ट्रिप्सिन के 500 μL जोड़ें। इसके बाद, ताजा संस्कृति माध्यम के 5 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन को बेअसर करें।
    नोट: (1) लंबे समय तक ट्रिप्सिन इनक्यूबेशन या अपूर्ण न्यूट्रलाइजेशन कोशिकाओं को पचा सकता है और उनकी कोशिका झिल्ली से समझौता कर सकता है, जो परिणामों को तिरछा कर सकता है। इसके अलावा, यह कोशिका झिल्ली विषमता को भी बदल सकता है और इस प्रकार, फॉस्फेटिडिलसेरिन तक पहुंच। (2) जो कोशिकाएं अलग हो गई हैं और सतह पर तैर गई हैं, उन्हें बाद के विश्लेषण में 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर हटाए गए माध्यम को सेंट्रीफ्यूज करके और ताजा संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करके शामिल किया जा सकता है।

2. व्यवहार्यता परख का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करना।

  1. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रोपिडियम आयोडाइड का 450 μL। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल सस्पेंशन के 50 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं की गणना करें (अनुभाग 4 देखें)।
  2. एपोप्टोसिस परख पर आगे बढ़ने से पहले सेल कल्चर माध्यम के साथ सभी नमूनों को 1 ×10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें।

3. फ्लो साइटोमेट्री के लिए धुंधला कोशिकाएं।

नोट: प्रोटोकॉल के इस भाग के लिए बाँझ स्थितियों की आवश्यकता नहीं है।

  1. एनेक्सीन वी का उपयोग करके फॉस्फेटिडिलसेरिन बाहरीकरण का पता लगाना
    1. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल सस्पेंशन के 100 μL जोड़ें। फ्लोरोसेंट संयुग्मित एनेक्सिन वी और 7-एएडी अभिकर्मक के 1: 1 मिश्रण के 100 μL जोड़ें। प्रकाश से सुरक्षित 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  2. माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली विध्रुवण का विश्लेषण
    1. 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेल सस्पेंशन के 100 μL सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
    2. 1x PBS के 1 mL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, प्रत्येक नमूने में 100 μL TMRE धुंधला घोल जोड़ें, और कोमल बैक-पाइपिंग द्वारा निलंबन मिलाएं।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर सीओ2 वातावरण में 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। प्रकाश से बचाने के लिए नमूनों को साफ एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें।
      नोट: माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता एक कार्यात्मक मार्कर है जो कोशिका पर्यावरण में मामूली परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील है। इसलिए, प्रजनन क्षमता बनाए रखने के लिए नमूनों को समान परिस्थितियों (तापमान, पीएच, और इनक्यूबेशन और फ्लोरोसेंट माप की शुरुआत के बीच बीतने वाला समय) के तहत इनक्यूबेट और मापा जाना चाहिए। इसके अलावा, ध्यान दें कि प्रकाश से नमूनों की अपर्याप्त सुरक्षा फ्लोरोफोरे के फोटोब्लीचिंग का कारण बनती है जिसके परिणामस्वरूप गलत तरीके से कम उत्सर्जित प्रतिदीप्ति होती है।
    4. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक नमूने में 7-एएडी धुंधला समाधान के 5 μL जोड़ें और मिलाएं। प्रकाश से सुरक्षित, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. कैसपेज़ सब्सट्रेट डीईवीडी का उपयोग करके सक्रिय टर्मिनल कैसपेज़ -3 और -7 का पता लगाना।
    नोट: इस परख को करने से पहले निम्नलिखित समाधान तैयार किए जाते हैं।
    1. डीएमएसओ में डीईवीडी-बाउंड डीएनए-बाइंडिंग पेप्टाइड को 1: 8 के अनुपात में बाँझ 1x पीबीएस के साथ पतला करें ताकि कैसपेज़-डिटेक्शन वर्किंग सॉल्यूशन बनाया जा सके। समाधान को बर्फ पर या 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जो प्रकाश से संरक्षित है।
      नोट: प्रत्येक नमूने को इस समाधान के 5 μL की आवश्यकता होगी।
    2. 7-एएडी कार्यशील समाधान बनाने के लिए 1x PBS के 148 μL में 7-AAD स्टॉक समाधान के 2 μL जोड़ें। समाधान को बर्फ पर या 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जो प्रकाश से संरक्षित है।
      नोट: प्रत्येक नमूने को इस समाधान के 150 μL की आवश्यकता होगी।
    3. 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन के सेंट्रीफ्यूज 50 μL। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। 1x PBS के 50 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, इसके बाद कैसपेज़-डिटेक्शन वर्किंग सॉल्यूशन के 5 μL हों। अच्छी तरह मिलाएं।
    4. ट्यूबों की टोपी को ढीला करें और प्रकाश से संरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर सीओ2 वातावरण में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रत्येक नमूने में 7-AAD कार्यशील समाधान के 150 μL जोड़ें और मिलाएं। प्रकाश से सुरक्षित, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. डबल-स्ट्रैंड डीएनए टूटने और कुल डीएनए क्षति का पता लगाना
    1. 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन के सेंट्रीफ्यूज 50 μL। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    2. 1x PBS के 500 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। फॉर्मलाडेहाइड-आधारित निर्धारण बफर के 500 μL जोड़ें और मिलाएं। 10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने को इनक्यूबेट करें।
    3. 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1x PBS के 90 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एंटीबॉडी समाधान के 10 μL जोड़ें। अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. 1x PBS के 100 μL जोड़ें और 300 × g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। 1x PBS के 200 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।

4. प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने चलाएं।

  1. उपकरण की सिस्टम चेक किट चलाकर फ्लो साइटोमीटर के विश्लेषणात्मक प्रदर्शन को सत्यापित करें। जब तक सभी जांच पूरी नहीं हो जाती और पारित नहीं हो जाती, तब तक नमूने चलाने के साथ आगे न बढ़ें।
  2. उपकरण पर पूर्व-प्रोग्राम किए गए परखों की सूची के माध्यम से ब्राउज़ करके वांछित परख का पता लगाएं और रन परख का चयन करें।
    1. प्रवाह साइटोमीटर पर नमूना लोड करने से पहले धीरे से बैक-पाइपिंग करके नमूना मिलाएं।
      नोट: पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करता है कि कोशिकाएं निलंबन में रहें और कम सेल गिनती को रोकती हैं।
    2. सबसे पहले, प्रवाह साइटोमीटर पर एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना लोड करें, और चलाएं (सेटिंग्स समायोजित करें) का चयन करें ताकि उपकरण नमूने को एस्पिरेट करना शुरू कर दे और पता लगाई गई घटनाओं का वास्तविक समय पूर्वावलोकन प्रदान करे। उपकरण के नाम और विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    3. लाइव पूर्वावलोकन का उपयोग करके, प्रतिदीप्ति और सेल आकार के लिए थ्रेसहोल्ड समायोजित करें और सेल आबादी के चारों ओर एक आयताकार गेट खींचें। सेलुलर मलबे को बाहर करने के लिए थ्रेशोल्ड मार्कर को खींचें। आगे बढ़ने के लिए अगला (स्वास्थ्य प्रोफ़ाइल सेट करें) का चयन करें।
      नोट: कोशिकाओं के आकार को जानना महत्वपूर्ण है। स्लाइडर्स को खींचें और वास्तविक समय पूर्वावलोकन पर पता लगाए गए ईवेंट को प्लॉट करने के तरीके में परिवर्तन ों का निरीक्षण करें, क्योंकि यह थ्रेसहोल्ड के सटीक चयन को सूचित करेगा। यदि सेलुलर मलबे को इस स्तर पर बाहर नहीं रखा गया है, तो इसे अधिग्रहण के बाद के विश्लेषणों में नहीं हटाया जा सकता है।
    4. सेल आबादी को अलग करने के लिए क्वाड्रंट मार्करों को टैप करें और खींचें और ताकि उपकरण वास्तविक समय में घटनाओं का पता लगा सके। क्वाड्रंट मार्करों के उपयुक्त प्लेसमेंट पर अंतिम-उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करने के लिए इन भूखंडों का उपयोग करें। आगे बढ़ने के लिए अगला (नमूने सत्यापित करें) का चयन करें ताकि उपकरण सेटिंग्स का सारांश प्रदर्शित करे। सेटिंग्स की समीक्षा करने के बाद, प्रयोग के भीतर सभी नमूनों के लिए इन सेटिंग्स को लागू करने के लिए अगला (सेटिंग्स सत्यापित करें) का चयन करें।
      नोट: उपकरण उपकरण की सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं का 2-मिनट का लाइव पूर्वावलोकन प्रदान करता है। यदि यह समय सीमा समाप्त हो जाती है, तो उपकरण नमूना जारी करेगा, और चरण 4.2.2-4.2.4 को दोहराना होगा। नमूना निकालें और फिर से लोड करने और जारी रखने से पहले अच्छी तरह मिलाएं।
    5. सेल आबादी के चारों ओर एक क्षेत्र खींचकर कोशिकाओं की आबादी को गेट करें। लाइव पूर्वावलोकन के एक्स- और वाई-अक्ष पर स्थित स्लाइडर्स का उपयोग करके प्रतिदीप्ति और सेल आकार के लिए थ्रेसहोल्ड समायोजित करें। प्रयोग के भीतर सभी नमूनों के लिए इन सेटिंग्स को लागू करें।
    6. पहले नमूने को धीरे से बैक-पाइपिंग करके मिलाएं और पहले नमूने को फ्लो साइटोमीटर पर लोड करें और अगला चुनें। नमूने को नाम दें और चलाएँ का चयन करें ताकि सिस्टम नमूना चलाना शुरू कर दे.
      नोट: उपकरण एक समय में केवल एक नमूना चला सकता है।
    7. एक बार सभी नमूने चलाए जाने के बाद, प्रयोग को एक उपयुक्त शीर्षक देकर सहेजें। भविष्य के रन (वैकल्पिक) में पुनर्प्राप्ति के लिए वर्तमान प्रयोग की सेटिंग्स सहेजें।

5. अधिग्रहण के बाद विश्लेषण

  1. यदि आवश्यक हो, तो अधिग्रहण के बाद गेट या क्वाड्रंट मार्करों की बारीक-ट्यूनिंग करें।
  2. उस प्रयोग की स्थिति जानें जिसे सिस्टम के फ़ाइल ब्राउज़र को नेविगेट करके समायोजन की आवश्यकता है और प्रयोग खोलें।
  3. प्लॉट को बड़ा करने के लिए इसके थंबनेल पूर्वावलोकन पर टैप करें। गेट के आयामों को समायोजित करने के लिए सेल गेट के ऊपरी-बाएं या नीचे-दाएं कोनों पर टैप करें। क्वाड्रंट मार्करों को समायोजित करने के लिए, मार्करों को स्थानांतरित करने के लिए ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज रेखाओं के चौराहे पर टैप करें। किसी भी पंक्ति के कोण को समायोजित करने के लिए, लाइन पर टैप करें और हैंडल को खींचें।
  4. मार्करों को समायोजित करें (जैसा कि पहले चरण 4.1.3-4.1.4 में वर्णित है) और चेक-मार्क आइकन का चयन करके, सभी नमूनों को चिह्नित करके और स्वीकार करें का चयन करके प्रयोग में सभी नमूनों पर इन सेटिंग्स को लागू करें।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. तीन प्रतियों में परीक्षण चलाएं और उपचारित नमूनों और नियंत्रणों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का आकलन करने के लिए पोस्ट-हॉक बोनफेरोनी परीक्षण के साथ विचरण (एनोवा) का विश्लेषण चलाएं।
    नोट: पसंद का सांख्यिकीय परीक्षण अन्वेषक और विश्लेषण किए जा रहे चर पर निर्भर है।

Representative Results

सेल गिनती और व्यवहार्यता (चित्रा 3) के परिणामों से पता चला है कि नमूने में 95.2% कोशिकाएं जीवित थीं, और 4.8% मृत थीं। मूल नमूने में कुल सेल एकाग्रता 6.20 x 106 सेल / एमएल थी।

एनेक्सीन वी और सेल डेथ परख (चित्रा 4) ने नियंत्रण की तुलना में 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज किए गए सिहा कोशिकाओं में एपोप्टोटिक कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण वृद्धि (पी < 0.0001) दिखाई। चूंकि प्रारंभिक चरण एपोप्टोसिस के दौरान कोशिकाओं में एनेक्सिन वी धुंधला बढ़ जाता है, इस खोज से पता चलता है कि 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी ने सिहा कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित किया।

माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रोकेमिकल ट्रांसमेम्ब्रेन संभावित परख (चित्रा 5) ने एक्टिनोमाइसिन डी, मध्यम नियंत्रण और विलायक नियंत्रण के बीच सेल स्वास्थ्य प्रोफाइल (जीवित, विध्रुवीकृत और जीवित, विध्रुवीकृत और मृत, मृत) में एक महत्वपूर्ण कमी (पी < 0.0001) का प्रदर्शन किया। इन आंकड़ों से पता चलता है कि 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी ने सिहा कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल विध्रुवण को प्रेरित किया।

कैसपेस 3/7 परख (चित्रा 6) ने नियंत्रण की तुलना में 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज किए गए सिहा कोशिकाओं में कैसपेस 3 और 7 के महत्वपूर्ण (पी < 0.0001) सक्रियण का प्रदर्शन किया। ये खोज दर्शाती है कि 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी ने सिहा कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित किया।

डीएनए क्षति परख (चित्रा 7) से पता चला है कि 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी काफी (पी < 0.0001) ने डीएनए क्षति मार्करों, एटीएम और एच 2 ए को प्रेरित किया। एक्स, सिहा कोशिकाओं में। यह खोज एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज किए गए सिहा कोशिकाओं में डीएनए क्षति में महत्वपूर्ण वृद्धि का सुझाव देती है।

उप-मानक प्रयोगों के परिणाम (चित्रा 8) सभी परखों में विश्लेषणात्मक विचारों को प्रदर्शित करते हैं। सेल एकाग्रता डेटा की सटीकता को प्रभावित करती है। चित्रा 8 ए में, सेल गिनती अस्वीकार्य रूप से कम है। डॉट प्लॉट के सभी 4 क्वाड्रेंट्स में गेटेड सेल आबादी में कम सिग्नल तीव्रता होती है। निर्माता अंतिम नमूना मात्रा में 300-700 कोशिकाओं / μL के लिए परख का अनुकूलन करता है। यह उदाहरण निर्माता द्वारा निर्धारित सही नमूना एकाग्रता का उपयोग करने के महत्व को दर्शाता है।

इसके अलावा, उच्च सेल सांद्रता ने भी गलत परिणाम दिए (चित्रा 8 बी)। मध्यम और प्रयोगात्मक संस्कृतियों ने क्रमशः 99.95% और 100% जीवित कोशिकाओं का प्रदर्शन किया। दोनों परखों के लिए प्रवाह दर निर्माता की 100-500 कोशिकाओं / μL की अनुकूलित एकाग्रता से अधिक थी और गलत विश्लेषण से बचने के लिए 1x परख बफर के साथ कमजोर पड़ने की आवश्यकता थी।

प्रयोगात्मक संस्कृतियों की तैयारी के दौरान सेल क्लंपिंग से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह सेल आकार सूचकांक में वृद्धि के कारण गलत परिणाम पैदा करता है, जैसा कि एनेक्सिन वी परख में दिखाया गया है। चित्रा 8 सी उच्च सेल एकाग्रता की दोहरी समस्या को दर्शाता है जो निर्माता के निर्देश और सेल क्लंपिंग से अधिक है, जैसा कि सिहा मध्यम नियंत्रण में 4 से अधिक सेल आकार सूचकांक से स्पष्ट है। उच्च कोशिका एकाग्रता को मध्यम संस्कृतियों में कोशिकाओं के एक उज्ज्वल लाल विमान बनाने वाली कोशिकाओं की शीट िंग द्वारा चित्रित किया जाता है, जो उच्च एपोप्टोटिक सेल आबादी का प्रदर्शन करता है।

संस्कृतियों के लंबे समय तक धुंधला होने से प्रोटीन का गैर-विशिष्ट बंधन हो सकता है और इसके परिणामस्वरूप गलत परिणाम हो सकते हैं, जैसा कि एनेक्सिन वी परख द्वारा प्रदर्शित किया गया है। चित्रा 8 डी लंबे समय तक धुंधला होने के कारण मध्यम और प्रयोगात्मक संस्कृतियों के लिए समान परिणाम प्रदर्शित करता है।

खराब नमूना हैंडलिंग, अनुयायी कोशिकाओं के विस्तारित ट्रिप्सिनीकरण, धोने के चरणों के दौरान जोरदार पाइपिंग, और उच्च गति और लंबे समय तक सेंट्रीफ्यूजेशन कदम सेल लाइसिस और सेल मलबे की उच्च मात्रा का कारण बनते हैं। चित्रा 8 ई में, कैसपेस 3/7 परख द्वारा विश्लेषण की गई संस्कृतियां एक छोटे सेल आकार सूचकांक (<2.2 सेल आकार सूचकांक) द्वारा प्रमाणित सेल मलबे में वृद्धि का प्रदर्शन करती हैं। इसलिए डेटा अधिग्रहण के लिए नमूने तैयार करते समय सावधानी बरतनी चाहिए।

Figure 3
चित्रा 3: सेल गिनती और व्यवहार्यता परख। जनसंख्या प्रोफ़ाइल मलबे को जीवित और मृत कोशिकाओं से अलग करती है। दो-आयामी डॉट प्लॉट गेटेड है और जीवित और मृत कोशिका आबादी को विभाजित करता है। सूचना पैनल सेल गिनती, कुल व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत, और नमूने में व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है। इन आंकड़ों का उपयोग बाद के एपोप्टोसिस विश्लेषण के लिए सभी नमूनों में सेल गिनती को मानकीकृत करने के लिए किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एनेक्सिन वी परख। सभी नमूने समान गेटिंग पैरामीटर दिखाते हैं, और प्रत्येक उप-आबादी के सांख्यिकीय विश्लेषण से एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में एपोप्टोसिस में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चलता है। सभी परखों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के रूप में किया गया था, और प्रत्येक प्रयोग को तीन प्रतियों में परख लिया गया था। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। पी < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रोकेमिकल ट्रांसमेम्ब्रेन संभावित परख। सभी नमूने समान गेटिंग पैरामीटर दिखाते हैं, और प्रत्येक उप-आबादी के सांख्यिकीय विश्लेषण से एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में महत्वपूर्ण गड़बड़ी का पता चलता है। सभी परखों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के रूप में किया गया था, और प्रत्येक प्रयोग को तीन प्रतियों में परख लिया गया था। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। पी < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: कैसपेस 3/7 पहचान परख। सभी नमूने समान गेटिंग पैरामीटर दिखाते हैं, और प्रत्येक उप-आबादी के सांख्यिकीय विश्लेषण से एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में कैसपेस 3/7 गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चलता है। सभी परखों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के रूप में किया गया था, और प्रत्येक प्रयोग को तीन प्रतियों में परख लिया गया था। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। पी < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: डीएनए क्षति परख। सभी नमूने समान गेटिंग पैरामीटर दिखाते हैं, और प्रत्येक उप-आबादी के सांख्यिकीय विश्लेषण से एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में डबल-स्ट्रैंड डीएनए क्षति और कुल डीएनए क्षति में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चलता है। सभी परख तीन स्वतंत्र प्रयोगों पर किए गए थे, और प्रत्येक प्रयोग को तीन प्रतियों में परख लिया गया था। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। * पी < 0.05; पी < 0.001; पी < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: उप-इष्टतम प्रयोगात्मक स्थितियां खराब परिणाम देती हैं । (ए) कोशिकाओं की कम सांद्रता, (बी) कोशिकाओं की उच्च सांद्रता, (सी) सेल क्लंपिंग और एकत्रीकरण उच्च सेल आकार सूचकांक द्वारा स्पष्ट है, (डी) दोनों नमूनों में सकारात्मक धुंधलापन में वृद्धि से स्पष्ट सेल नमूनों का लंबे समय तक धुंधलापन, और (ई) सेलुलर मलबे में वृद्धि (सेल आकार सूचकांक < 2.2) से स्पष्ट खराब नमूना हैंडलिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस अध्ययन में, एफसी द्वारा विश्लेषण किए गए एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा कोशिकाओं ने एपोप्टोसिस के लिए महत्वपूर्ण प्रारंभिक और देर से बायोमार्कर का खुलासा किया। सेल की तैयारी, गणना और धुंधला करने के लिए उप-इष्टतम स्थितियों ने गलत परिणामों की पहचान की, एफसी प्रदर्शन करते समय निर्माता के निर्देशों के निकट पालन की आवश्यकता पर जोर दिया।

प्रारंभिक और देर से बायोमार्कर पहचान द्वारा एपोप्टोसिस का यह अध्ययन एपोप्टोसिस की जांच के लिए एनसीसीडी दिशानिर्देशों1 के अनुरूप है। एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा संस्कृतियों ने शुरुआती और देर से एपोप्टोटिक चरणों के लिए सकारात्मक बायोमार्कर का प्रदर्शन किया। पीआई परख और माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता परख से पता चला है कि एक्टिनोमाइसिन डी ने क्रमशः पीएस-फ्लिप पैटर्न और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संक्रमण के अपव्यय को प्रेरित किया। एक बार जब एपोप्टोटिक कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल गड़बड़ी से प्रेरित कोई वापसी के बिंदु तक पहुंच जाती हैं, तो टर्मिनल कैसपेस 3,7 सक्रिय होते हैं। इस अध्ययन में देखे गए टर्मिनल कैसपेस 3 और 7 की सक्रियता देर से चरण एपोप्टोसिस को इंगित करती है। इसके अलावा, टर्मिनल कैसपेस सक्रियण इंटरन्यूक्लियोसोमल डीएनए दरार और व्यापक डीएनए विखंडन का कारण बनता है, जिसे शास्त्रीय रूप से जेल वैद्युतकणसंचलन28,38 द्वारा देखे गए चरण-सीढ़ी पैटर्न के रूप में रिपोर्ट किया गया है।

एटीएम और एच 2 ए के साथ परमाणु क्षति। एक्स एफसी डीएनए क्षति परख ने डीएनए और कुल डीएनए क्षति में डबल-स्ट्रैंड ब्रेक दिखाया। इन परिणामों ने प्रयोगात्मक संस्कृतियों में शास्त्रीय डाउनस्ट्रीम कैसपेज़-प्रेरित एपोप्टोटिक परमाणु क्षति (कैरियोरहेक्सिस और कैरियोरिलिसिस) की पुष्टि की। इस प्रकार कई प्रवाह साइटोमेट्रिक बायोमाकर्स के उपयोग ने एपोप्टोसिस में अनुक्रमिक मल्टीस्टेज घटनाओं का पता लगाया और प्रारंभिक और देर से एपोप्टोटिक चरणों में सटीक और पुन: पहचान की गई सेल आबादी की पहचान की। ये निष्कर्ष मनुष्यों में कैंसर के उपचार में एक्टिनोमाइसिन डी की ज्ञात प्रो-एपोप्टोटिक विशेषताओं के अनुरूप हैं 37,39,40,41 और एपोप्टोसिस की जांच करने वाले एफसी सेल कल्चर प्रयोगों में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक्टिनोमाइसिन डी के उपयोग का समर्थन करते हैं।

इस अध्ययन में सेल आबादी की गेटिंग को नकारात्मक माध्यम और विलायक नियंत्रणों द्वारा सूचित किया गया था, जिसने स्वस्थ कोशिकाओं से एपोप्टोटिक को अलग किया था। वैकल्पिक रूप से, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों की आबादी के मिश्रण का उपयोग सेल जनसंख्या गेट 7,9 सेट करने के लिए जीवित और एपोप्टोटिक सेल आबादी को परिभाषित करने के लिए भी किया जा सकता है। एक बार रोगग्रस्त और स्वस्थ सेलुलर राज्यों को परिभाषित और गेट किया जाता है, तो टेम्पलेट सेटिंग्स को बाद के सभी प्रयोगात्मक और नियंत्रण संस्कृतियों पर लागू किया जा सकता है।

झूठे परिणामों से बचने के लिए एफसी प्रोटोकॉल का सख्ती से पालन आवश्यक है। प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान, निम्नलिखित समस्याएं देखी गईं: (1) कम सेल एकाग्रता, (2) उच्च सेल एकाग्रता, (3) सेल क्लंपिंग, (4) लंबे समय तक धुंधलापन, और (5) खराब नमूना हैंडलिंग। अनुकूलित प्रोटोकॉल आवश्यकताओं के सख्त पालन से इन समस्याओं को रोका जा सकता है। यह सटीक डेटा प्राप्त करने के लिए एफसी के लिए पूर्व-विश्लेषणात्मक और विश्लेषणात्मक चरणों की महत्वपूर्ण प्रकृति पर जोर देता है। सेल की तैयारी के दौरान, ट्रिप्सिनाइजेशन, पाइपटिंग, सेंट्रीफ्यूजेशन और कमजोर पड़ने को देखभाल के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। ओवर-ट्रिप्सिनाइजेशन और जोरदार पाइपिंग के परिणामस्वरूप क्रमशः कोशिकाओं के रासायनिक और यांत्रिक कतरनी हो सकते हैं। लंबे समय तक और उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन के परिणामस्वरूप सेल टूटने और उच्च सेलुलर मलबे की गिनती हो सकती है। सेल घटनाओं के गलत अधिग्रहण को कम करने के लिए इष्टतम सेल एकाग्रता की आवश्यकता होती है। इसलिए, इष्टतम सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्राथमिक सेल निलंबन को पतला किया जाना चाहिए।

इसके अलावा, नमूनों को संभालते समय, सेल क्लंपिंग और सेल विखंडन को रोकने के लिए देखभाल की जानी चाहिए और यह सुनिश्चित करना चाहिए कि विश्लेषण के दौरान कोशिकाएं निलंबन में रहें। सेल क्लंपिंग को रोकने के लिए नमूना हैंडलिंग एकल लामिनर सेल प्रवाह की अनुमति देता है, उपकरण के केशिका ट्यूबिंग के यांत्रिक अवरोध को रोकता है, और नकली बड़े सेल आकार इंडेक्स को रोकता है। एक और चेतावनी प्रकाश के खिलाफ संस्कृतियों की रक्षा कर रही है ताकि फोटो-ऑक्सीकरण से बचा जा सके और गलत-नकारात्मक परिणामों को रोकने के लिए परख में फ्लोरोफोर े के शमन को रोका जा सके। कोशिकाओं के धुंधला चरण और बाद के प्रसंस्करण चरणों में न्यूनतम प्रकाश जोखिम सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इसके अलावा, लंबे समय तक इम्यूनोस्टेनिंग समय के परिणामस्वरूप गलत-सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं क्योंकि प्रोटीन गैर-विशेष रूप से दागदार होते हैं। इसलिए, निर्माता-निर्धारित इनक्यूबेशन धुंधला अवधि का पालन महत्वपूर्ण है।

सारांश में, एफसी एपोप्टोसिस का सटीक रूप से पता लगा सकता है और सेल संस्कृति में शुरुआती और देर से एपोप्टोसिस बायोमार्कर के बीच भेदभाव कर सकता है। इसके अलावा, प्रौद्योगिकी में प्रगति ने सेल स्वास्थ्य और जटिल इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों का अध्ययन करने के लिए गैर-विशेषज्ञ वैज्ञानिकों के लिए बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर के निर्माण को जन्म दिया है।

Disclosures

ल्यूमिनेक्स® कॉर्पोरेशन ने कृपया लेख प्रसंस्करण शुल्क प्रदान किया।

Acknowledgments

अध्ययन को राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) और दक्षिण अफ्रीकी चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एसएएमआरसी) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। हम अमरूद म्यूज़ सेल विश्लेषक की खरीद के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य प्रयोगशाला सेवा (एनएचएलएस) को स्वीकार करना चाहते हैं। इस प्रकाशन के सभी आंकड़े Biorender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plates Lasec P1PLA044C-000006
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
DMEM ThermoFisher 41966052
Glutamine Sigma-Aldrich P10-040500
Guava Muse Cell Analyzer Luminex 0500-3115
Microcentrifuge tubes/Eppendorf Merck EP0030122208-200EA
Muse Annexin V kit Merck MCH100105
Muse Caspase-3/7 kit Merck MCH100108
Muse Count and Viability kit Merck MCH600103
Muse DNA Damage kit Merck MCH200107
Muse MitoPotential kit Merck MCH100110
PBS Buffer ThermoFisher 70013065
Pen-strep Sigma-Aldrich P4333
SiHa cells ATCC CRL-1550
T25 culture flasks Sigma-Aldrich C6231
Trypsin Pan Biotech P10-040500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  2. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  3. Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).
  4. Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16 (6), 663-669 (2004).
  5. Arends, M. J., Morris, R. G., Wyllie, A. H. Apoptosis. The role of the endonuclease. The American journal of pathology. 136 (3), 593-608 (1990).
  6. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).
  7. Darzynkiewicz, Z., Traganos, F. Apoptosis. Al-Rubeai, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 33-73 (1998).
  8. Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. Flow cytometry-based apoptosis detection. Methods in molecular biology. 559, Clifton, N.J. 19-32 (2009).
  9. Bio-Rad Laboratories. Introduction to Flow Cytometry Basics. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html (2021).
  10. Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Detection of localized caspase activity in early apoptotic cells by laser scanning cytometry. Cytometry. 47 (2), 81-88 (2002).
  11. Castedo, M., et al. Quantitation of mitochondrial alterations associated with apoptosis. J Immunol Methods. 265 (1-2), 39-47 (2002).
  12. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current protocols in immunology. 120, 1-11 (2018).
  13. Macey, M. G. Flow cytometry: principles and clinical applications. Med Lab Sci. 45 (2), 165-173 (1988).
  14. Darzynkiewicz, Z., et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).
  15. Darzynkiewicz, Z., et al. Cytometry in cell necrobiology: Analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis). Cytometry. 27 (1), 1-20 (1997).
  16. Ormerod, M. G. The study of apoptotic cells by flow cytometry. Leukemia. 12 (7), 1013-1025 (1998).
  17. van Engeland, M., Nieland, L. J., Ramaekers, F. C., Schutte, B., Reutelingsperger, C. P. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry. 31 (1), 1-9 (1998).
  18. Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. Journal of Immunological Methods. 243 (1), 167-190 (2000).
  19. Jahan-Tigh, R. R., Ryan, C., Obermoser, G., Schwarzenberger, K. Flow cytometry. J Invest Dermatol. 132 (10), 1-6 (2012).
  20. Lövborg, H., Gullbo, J., Larsson, R. Screening for apoptosis-classical and emerging techniques. Anti-cancer drugs. 16 (6), 593-599 (2005).
  21. Vorobjev, I. A., Barteneva, N. S. Multi-parametric imaging of cell heterogeneity in apoptosis analysis. Methods. 112, 105-123 (2017).
  22. Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods in molecular biology. 263, Clifton, N.J. 141-160 (2004).
  23. Kagami, S., Rizzo, H. L., Lee, J. J., Koguchi, Y., Blauvelt, A. Circulating Th17, Th22, and Th1 cells are increased in psoriasis. J Invest Dermatol. 130 (5), 1373-1383 (2010).
  24. Luminex Corporation. Muse® Annexin V & Dead Cell Kit. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-annexin-v-dead-cell-kit/ (2019).
  25. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  26. Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 1463-1467 (2005).
  27. Apoptosis assays and markers guide. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/kits/apoptosis-assays (2021).
  28. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  29. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  30. Saelens, X., et al. Toxic proteins released from mitochondria in cell death. Oncogene. 23 (16), 2861-2874 (2004).
  31. Muse™ MitoPotential Kit User's Guide. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-mitopotential-kit (2013).
  32. McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (4), 008656 (2013).
  33. Wigdal, S. S., Kirkland, R. A., Franklin, J. L., Haak-Frendscho, M. Cytochrome c release precedes mitochondrial membrane potential loss in cerebellar granule neuron apoptosis: lack of mitochondrial swelling. Journal of Neurochemistry. 82 (5), 1029-1038 (2002).
  34. Muse® Caspase-3/7 Kit. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-caspase-3-7-kit/#overview (2019).
  35. Häcker, G. The morphology of apoptosis. Cell and Tissue Research. 301 (1), 5-17 (2000).
  36. Muse® Multi-Color DNA Damage Kit User's Guide. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-multi-color-dna-damage-kit/#overview (2020).
  37. Kleeff, J., Kornmann, M., Sawhney, H., Korc, M. Actinomycin D induces apoptosis and inhibits growth of pancreatic cancer cells. International journal of cancer. 86 (3), 399-407 (2000).
  38. Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances. Experimental oncology. 34 (3), 255-262 (2012).
  39. Szeberenyi, J. The effect of actinomycin D on RNA metabolism in human cells. Biochem Mol Biol Educ. 34 (1), 50-51 (2006).
  40. Ginell, S., Lessinger, L., Berman, H. M. The crystal and molecular structure of the anticancer drug actinomycin D--some explanations for its unusual properties. Biopolymers. 27 (5), 843-864 (1988).
  41. Hou, M. H., Robinson, H., Gao, Y. G., Wang, A. H. Crystal structure of actinomycin D bound to the CTG triplet repeat sequences linked to neurological diseases. Nucleic Acids Res. 30 (22), 4910-4917 (2002).

Tags

वापसी मुद्दा 174 एपोप्टोसिस फ्लो साइटोमेट्री सिहा एक्टिनोमाइसिन डी।
एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं में एपोप्टोटिक बायोमार्कर का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Punchoo, R., Zhou, E., Bhoora, S.… More

Punchoo, R., Zhou, E., Bhoora, S. Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells. J. Vis. Exp. (174), e62663, doi:10.3791/62663 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter