Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Flowcytometrisk analyse av apoptotiske biomarkører i Actinomycin D-behandlede SiHa livmorhalskreftceller

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62663
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Chemical Pathology, Faculty of Health Sciences, University of Pretoria, 2Tshwane Academic Division, National Health Laboratory Service

Summary

Apoptose kan karakteriseres ved flowcytometrisk analyse av tidlige og sene apoptotiske biomarkører. Cellelinjen for livmorhalskreft, SiHa, ble analysert for apoptosebiomarkører etter behandling med Actinomycin D ved hjelp av et benchtop flow cytometer.

Abstract

Biomarkører for apoptose ble undersøkt i actinomycin D-behandlede SiHa livmorhalskreftceller ved hjelp av et benkestrømcytometer. Tidlige biomarkører (vedlegg V og mitokondriemembranpotensial) og sene biomarkører (caspases 3 og 7, og DNA-skade) av apoptose ble målt i eksperimentelle og kontrollkulturer. Dyrkning ble inkubert i 24 timer i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2. Cellene ble deretter løsrevet ved hjelp av trypsin og oppregnet ved hjelp av en flowcytometrisk celletellingsanalyse. Celler ble videre analysert for apoptose ved hjelp av en vedlegg V-analyse, en mitokondriell elektrokjemisk transmembranpotensialanalyse, en caspase 3/7-analyse og en DNA-skadeanalyse. Denne artikkelen gir en oversikt over apoptose og tradisjonell flowcytometri, og utdyper flowcytometriske protokoller for prosessering og analyse av SiHa-celler. Resultatene beskriver positive, negative og suboptimale eksperimentelle data. Det diskuteres også tolkning og forbehold ved utførelse av flowcytometrisk analyse av apoptose ved hjelp av denne analytiske plattformen. Flowcytometrisk analyse gir nøyaktig måling av tidlige og sene biomarkører for apoptose.

Introduction

Apoptose, klassifisert som type 1 programmert celledød1, sikrer en likevekt mellom celleproliferasjon og celledød2. Apoptose er viktig under menneskelig utvikling, etter skade og for forebygging av sykdommer som kreft3. Intrinsiske og ekstrinsiske apoptotiske signalveier for celledød4 forårsaker sekvensielle biokjemiske og morfologiske intracellulære endringer 2,5,6. Morfologiske apoptotiske trekk kan identifiseres ved mikroskopi, og den biokjemiske forstyrrelsen kan analyseres ved biokjemiske analyser, inkludert flowcytometri (FC)7.

Flowcytometrisk analyse for å identifisere apoptose og forstå de tilhørende intracellulære mekanismene har blomstret de siste to tiårene8. FC er en vitenskapelig metodikk som analyserer celler i en væske som passerer gjennom enkelt- eller flerkanalslasere (figur 1) 9,10,11. Cellene i væsken er fokusert i en enkelt fil av fluidikksystemet til strømningscytometeret ved hjelp av hydrodynamisk fokusering. Når celler passerer gjennom laseren, blir lyset spredt eller sendt ut fra cellene. Det spredte lyset kan være i fremoverretningen (fremoverpunkt) eller mot siden (sidespredning) og gir informasjon om henholdsvis cellestørrelsen og cellegranulariteten eller indre strukturer.

I tillegg oppdager fluorescerende reagenser, som fluorescerende fargestoffer eller antistoffer merket med fluoroforer, spesifikke overflate- eller intracellulære strukturer eller molekyler. Når laseren begeistrer fluoroforene, sendes lys ut ved en bestemt bølgelengde. Detektorer - ofte fotomultiplikatorrør - kvantifiserer det spredte og utsendte lyset fra celleprøver. Detektorene produserer en kvantifiserbar strøm som er proporsjonal med lysspredningen og fluorescensutslippet. Den elektroniske utgangen konverteres til digitale signaler ved hjelp av databehandlingsprogramvare for å identifisere cellepopulasjoner basert på cellestørrelse, cellegranularitet og den relative cellefluorescensen av fluoroformerkede molekyler 9,12,13.

Figure 1
Figur 1 Skjematisk beskrivelse av teknisk virkemåte og arbeidsflyt for tradisjonell flowcytometri. Cellene er farget med fluorescerende reagenser og undersøkt av en laser. Fluorescenssignalene som genereres, oppdages og konverteres til en elektronisk utgang, som videre digitaliseres og analyseres av dataprogramvare og statistiske programmer. Forkortelser: FSC = fremoverspredning; SSC = sidespredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

FC brukes i både forskning og helsediagnostikk. De to målene for FC i nekrobiologi er å klargjøre molekylære og funksjonelle egenskaper ved celledød og diskriminering av ulike moduser for celledød 14,15,16,17,18. FC-applikasjoner inkluderer celleoppregning, sortering av cellepopulasjoner, immunfenotyping, biomarkørdeteksjon (f.eks. Apoptosebiomarkører), toksisitetsstudier og proteinteknikk12. I tillegg brukes FC vanligvis til helsediagnostikk for å bistå med diagnostisering og overvåking av pasienter med hematologiske maligniteter. Fremskritt innen instrumentering, fluorofordeteksjon og detektorsystemer utvider FC-applikasjoner til å omfatte bildecytometri, massecytometri og spektral cytometri med bredere forskningsapplikasjoner12.

Den flowcytometriske analysen av apoptose gir fordeler i forhold til tradisjonelle teknikker som brukes til å vurdere cellehelse. FC kan analysere mange enkeltceller i en heterogen prøve raskt og reproduserbart for å estimere apoptose 3,5. FCs evne til å gi kvantitativ informasjon om cellefenotyper på individuell cellebasis, og unngå bulkanalyse, gir overlegen følsomhet for vestlig blotting, enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISA), fluorometri og spektrofotometriteknikker som brukes i analysen av apoptose 8,19. Videre er den relative enkle FC-analysen i motsetning til de tungvinte og dårlig reproduserbare manuelle trinnene til Western blots og ELISAs fordelaktig. Den reproduserbare, nøyaktige og høykapasitetsanalysen av FC er derfor gunstig i kreftforskning20.

FC tillater også samtidig analyse av cellesyklusparametere for friske og unormale apoptotiske cellepopulasjoner21. Siden apoptose er en dynamisk prosess, kan ulike metoder gi variable resultater og er avhengig av når cellene høstes22. Den samtidige kvantitative vurderingen av flere parametere av cellefenotype tillater deteksjon av mindre subpopulasjoner med høy nøyaktighet, for eksempel kan sjeldne celleundergrupper med en lav frekvens på 0,01% detekteres23. Multiparametrisk FC-analyse er spesielt nyttig ettersom apoptotisk død forekommer langs et spekter av tidlige og sene biokjemiske endringer med celler på forskjellige punkter langs det apoptotiske kontinuumet. For eksempel muliggjør bruk av dobbeltfarging ved bruk av vedlegg V og propidiumjodid i FC-analyse av apoptotiske celler kategorisering av tidlige apoptotiske celler, sene apoptotiske celler og døde celler24. Nøyaktig påvisning av apoptose i flere stadier unngår feilklassifisering og falske negative resultater. Dermed forbedrer multiparametrisk analyse av FC den generelle spesifisiteten ved å oppdage cellefenotyper og unngår feilklassifisering av mindre populasjoner. Videre tillater cellesortering etter FC isolering av cellepopulasjoner med høy renhet for etterfølgende analyse7.

Ulempen med FC inkluderer bruk av celler i suspensjon, noe som kan være utfordrende i vevsanalyse, da disaggregering av vev i celler kan endre cellulær funksjon19. Videre kan mangelen på standardisering av FC-instrumentoppsett, dataanalyse og analyserapporter føre til variasjon i resultater19, noe som understreker behovet for optimal opplæring av FC-operatører til å utføre, analysere og rapportere data. For eksempel krever FCs evne til å diskriminere ekte apoptotisk rusk fra apoptotiske kjerner i) riktige oppkjøpsinnstillinger, ii) bruk av kalibreringsperler for å identifisere en diploid DNA-topp, og iii) negative og positive cellekontroller som er cellespesifikke3. Videre er multiparametrisk analyse begrenset av antall detektorer, og optimal kompensasjon må utføres for å unngå uspesifikke resultater og spillover av fluorescerende utslipp ved bruk av flere fluorescerende reagenser25. Fremskritt innen instrument- og fluoroforteknologi har forbedret parameterdeteksjon til 30 parametere12.

Identifisering av apoptotisk celledød er ikkealltid enkelt7, og sensitive og spesifikke biomarkører bør vurderes. Nomenklaturkomiteen for celledød (NCCD) anbefaler at mer enn én analyse brukes til å studere og kvantifisere prosessen med apoptose26. Mikroskopianalyse for klassiske apoptotiske trekk26 anbefales også for å bekrefte apoptose og unngå falskt positive resultater7. Fire kardinale biokjemiske trekk som spenner over tidlige og sene apoptotiske hendelser er (1) tap av cellemembranasymmetri; (2) spredning mitokondriemembranpotensial (ΔΨm); (3) caspase aktivering; og (4) DNA-skade26.

Under tidlig apoptose eksternaliseres fosfatidylserin til den ytre cellemembranen 27 og kan detekteres av vedlegg V fluorescerende merket med phycoerythrin27,28,29. Videre skiller dobbeltfarging med det fluorescerende DNA-bindende fargestoffet, 7-aminoactinomycin D (7-AAD), levende, sen-apoptotiske og døde celler. Derfor flekker tidlig apoptotiske celler positivt for vedlegg V og negativt for 7-AAD, i motsetning til sen-apoptotiske celler, som flekker positivt for begge fargestoffer24.

Intrinsiske apoptotiske signaler induserer spredning av mitokondriemembranpotensialet (ΔΨm). Den forstyrrede ΔΨm forårsaker frigjøring av tidlige pro-apoptotiske proteiner fra mitokondrielt intermembranrom inn i cytosol27,29,30. Endring i ΔΨm kan vurderes ved dobbeltfarging med det positivt ladede, lipofile fargestoffet, tetrametylrhodaminetylesteren, TMRE og 7-AAD. TMRE-fargen akkumuleres i den indre membranen til intakte mitokondrier når membranpotensialet er høyt. Depolariserte mitokondrier viser redusert fluorescens. Levende celler med polariserte mitokondrier (intakt mitokondriemembran) flekker positive for TMRE og negative for 7-AAD. Døde celler med depolariserte mitokondrier flekker negativt for TMRE og positivt for 7-AAD31.

Caspasene er en familie av intracellulære proteaser som, når de aktiveres, signaliserer og utfører apoptose26,27. Den terminale bøddelen caspases (3,6,7) effekt sen apoptose 29,32,33. Caspase-3 og -7 aktiviteter kan måles av et fluorescerende merket substrat, som, når det spaltes, binder seg til DNA og avgir et fluorescerende signal. Videre kan ethvert kompromiss med cellemembranintegriteten vurderes ved farging med 7-AAD. Apoptotiske celler flekker positivt for DNA-bindende fargestoff, men negativt for 7-AAD. Sen-apoptotiske og døde celler flekker positivt for begge fargestoffer34.

Sen apoptose er preget av DNA-skade27,29,35, som kan evalueres av fosforylert ataksiatelangiektasi mutert kinase (ATM) og histon H2A.X. Dobbeltstrengede DNA-brudd (DSB) forårsaker fosforylering av H2A.X. Fluorescerende merkede antistoffer mot ATM og H2A. X kan fastslå DNA-skade. Negativ deteksjon av både ATM og H2A. X indikerer ingen DNA-skade, mens påvisning av begge fargestoffer indikerer tilstedeværelse av dobbeltstrengbrudd i DNA36.

Actinomycin D er en potent induktor av apoptose og virker ved å binde seg til DNA for å blokkere transkripsjon og oversettelseshendelser37. Denne studien hadde som mål å vurdere biokjemisk apoptose indusert av aktinomycin D i SiHa-cellelinjen ved å analysere tidlige og sene biomarkører for apoptose. Fire biokjemiske biomarkører for apoptose vurderte sekvensielle trinn i den apoptotiske kaskaden som inkluderte tap av cellemembranasymmetri, endring i mitokondriemembranpotensial, aktivering av terminale caspaser og DNA-skade.

Protocol

MERK: Denne protokollen beskriver trinn i cellepreparering, celleopptelling, cellefarging og analyse av actinomycin D-behandlede SiHa-celler ved hjelp av flowcytometriske kommersielle analyser målt og analysert på et benchtop-flowcytometer (figur 2).

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt for påvisning av biokjemiske apoptotiske biomarkører ved flowcytometri. Cellene dyrkes og behandles som beskrevet i protokolltrinn 1.1. (1) Celler er dyrket, (2) oppregnet og (3) farget med fluorescerende reagenser, og (4) analysert av et benchtop flow cytometer. Data blir videre analysert og statistisk analysert. Forkortelser: 7-AAD = 7-aminoactinomycin D; PBS = fosfatbufret saltvann; PE = Phycoerythrin; TMRE = tetrametylrhodamin etylester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1. Fremstilling av cellekultur og behandlinger for flowcytometri

MERK: Forsikre deg om at aseptisk teknikk følges ved håndtering av cellekulturer.

  1. Dyrk cellekulturer i et fuktet CO 2 -miljø ved 37 ° C med 5% CO2. Sørg for at cellekulturen er ca. 70% konfluent i foreldrekolben før du passerer celler for eksperimenter.
  2. Fjern mediet fra kolben, vask celler med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) og tilsett 500 μL trypsin for å løsne cellene. Etter at cellene begynner å runde og løsne fra kolben, banker du kraftig bunnen av kolben på benken for å løsne cellene. Nøytraliser deretter trypsinet ved å tilsette ca. 5 ml friskt kulturmedium supplert med 10% føtalkalveserum før du teller cellene.
  3. Frøceller ved 15.000 celler / ml i 3 ml cellekulturmedium i en 6-brønns cellekulturplate. Inkuber dyrkningsplatene over natten ved 37 °C med 5 % CO2 for å tillate festing av cellene til bunnen av brønnen.
  4. Behandle eksperimentelle kulturer med 100 ng / ml actinomycin D og medium og løsningsmiddel kontroller med fersk kultur medium og dimetylsulfoksid (DMSO), henholdsvis i 24 timer. Samle det brukte mediet i et 15 ml rør og vask celler med 1x PBS. Deretter legger du til 1x PBS-vasken til røret, og tilsett deretter 500 μL trypsin til brønnen. Deretter nøytraliserer du trypsinet ved å tilsette 5 ml friskt kulturmedium.
    MERK: (1) Langvarig trypsininkubasjon eller ufullstendig nøytralisering kan fordøye cellene og kompromittere deres cellemembran, noe som kan skjeve resultatene. I tillegg kan det også endre cellemembranasymmetri og dermed tilgjengeligheten til fosfatidylserin. (2) Celler som har løsnet og fløt til overflaten, kan inkluderes i den påfølgende analysen ved å sentrifugere det fjernede mediet ved 300 × g i 5 minutter og resuspendere cellene i friskt kulturmedium.

2. Opplisting av celler ved hjelp av levedyktighetsanalysen

  1. Pipette 450 μL propidiumjodid i et mikrosentrifugerør. Tilsett 50 μL av cellesuspensjonen til mikrosentrifugerøret. Inkuber røret ved romtemperatur i 5 minutter. List opp cellene ved hjelp av flowcytometri (se avsnitt 4).
  2. Fortynn alle prøvene til en konsentrasjon på 1 × 106 celler/ml med cellekulturmedium før du går videre til apoptoseanalysene.

3. Farging av celler for flowcytometri

MERK: Sterile betingelser er ikke påkrevd for denne delen av protokollen.

  1. Påvisning av fosfatidylserin eksternalisering ved bruk av vedlegg V
    1. Tilsett 100 μL cellesuspensjon i et mikrosentrifugerør. Tilsett 100 μL av en 1: 1 blanding av fluorescerende konjugert vedlegg V og 7-AAD-reagens. Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter, beskyttet mot lys.
  2. Analyse av mitokondriell membran depolarisering
    1. Sentrifuge 100 μL av cellesuspensjonen ved 300 × g i 5 minutter og kast supernatanten.
    2. Resuspender cellene i 1 ml 1x PBS, tilsett 100 μL TMRE-fargeoppløsning til hver prøve, og bland suspensjonen med skånsom tilbakepipettering.
    3. Inkuber cellene i 20 minutter i et fuktetCO2-miljø ved 37 °C. Pakk prøvene inn i ren aluminiumsfolie for å beskytte mot lys.
      MERK: Mitokondriemembranpotensial er en funksjonell markør som er følsom for mindre endringer i cellemiljøet. Derfor bør prøvene inkuberes og måles under identiske forhold (temperatur, pH og tid gått mellom inkubasjonsstart og fluorescerende måling) for å opprettholde reproduserbarhet). Vær også oppmerksom på at utilstrekkelig beskyttelse av prøver fra lys forårsaker fotobleking av fluoroforer, noe som resulterer i falskt lav utsendt fluorescens.
    4. Etter inkubering, tilsett 5 μL av 7-AAD-fargeløsningen til hver prøve og bland. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
  3. Påvisning av aktivert terminal caspase-3 og -7 ved bruk av caspase substrat DEVD
    MERK: Følgende løsninger er utarbeidet før denne analysen utføres.
    1. Fortynn det DEVD-bundne DNA-bindende peptidet i DMSO til et forhold på 1:8 med sterilt 1x PBS for å få kaspasedeteksjonen til å fungere. Oppbevar oppløsningen på is eller ved 2-8 °C, beskyttet mot lys.
      MERK: Hver prøve vil kreve 5 μL av denne løsningen.
    2. Legg til 2 μL av en 7-AAD stamløsning til 148 μL 1x PBS for å lage 7-AAD arbeidsløsning. Oppbevar oppløsningen på is eller ved 2-8 °C, beskyttet mot lys.
      MERK: Hver prøve vil kreve 150 μL av denne løsningen.
    3. Sentrifuge 50 μL av cellesuspensjonen i 5 minutter ved 300 × g. Kast supernatanten. Resuspender cellene i 50 μL av 1x PBS, etterfulgt av 5 μL av arbeidsløsningen med caspasedeteksjon. Bland godt.
    4. Løsne lokket på rørene og rug i 30 minutter i et fuktet CO2 -miljø ved 37 °C, beskyttet mot lys. Tilsett 150 μL av 7-AAD-arbeidsløsningen til hver prøve og bland. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
  4. Påvisning av dobbeltstrengede DNA-brudd og total DNA-skade
    1. Sentrifuge 50 μL av cellesuspensjonen i 5 minutter ved 300 × g. Kast supernatanten.
    2. Resuspender cellene i 500 μL av 1x PBS. Tilsett 500 μL av en formaldehydbasert fikseringsbuffer og bland. Inkuber prøvene på is i 10 min.
    3. Sentrifuge i 5 minutter ved 300 × g og kast supernatanten. Resuspender cellene i 90 μL av 1x PBS i et mikrosentrifugerør. Tilsett 10 μL av antistoffoppløsningen til mikrosentrifugerøret. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter i mørket.
    4. Tilsett 100 μL 1x PBS og sentrifuge i 5 minutter ved 300 × g. Kast supernatanten. Resuspender cellene i 200 μL av 1x PBS.

4. Kjør prøver på flowcytometeret.

  1. Verifiser den analytiske ytelsen til flowcytometeret ved å kjøre instrumentets systemkontrollsett. Ikke fortsett med å kjøre prøver før alle kontrollene er fullført og bestått.
  2. Finn ønsket analyse ved å bla gjennom katalogen over forhåndsprogrammerte analyser på instrumentet og velg Kjør analyse.
    1. Bland prøven forsiktig med tilbakepipettering før du legger prøven på flowcytometeret.
      MERK: Tilstrekkelig blanding sikrer at cellene forblir i suspensjon og forhindrer lavt celletall.
    2. Først laster du inn en negativ kontrollprøve på flowcytometeret, og velger Kjør (Juster innstillinger) slik at instrumentet begynner å aspirere prøven og gir en forhåndsvisning i sanntid av oppdagede hendelser. Se materialfortegnelsen for instrumentnavn og detaljer.
    3. Bruk live forhåndsvisning, juster tersklene for fluorescens og cellestørrelse og tegne en rektangulær port rundt cellepopulasjonen. Dra terskelmarkøren for å utelate cellulært rusk. Velg Neste (angi helseprofil) for å fortsette.
      MERK: Det er viktig å vite størrelsen på cellene. Dra glidebryterne og observer endringer i hvordan oppdagede hendelser er plottet på forhåndsvisningen i sanntid, da dette vil informere et nøyaktig utvalg av terskler. Hvis cellulært avfall ikke utelukkes på dette stadiet, kan det ikke fjernes i analyser etter innsamling.
    4. Trykk og dra kvadrantmarkørene for å skille cellepopulasjonene og slik at instrumentet plotter oppdagede hendelser i sanntid. Bruk disse plottene til å veilede sluttbrukeren om riktig plassering av kvadrantmarkørene. Velg Neste (Bekreft prøver) for å fortsette slik at instrumentet viser et sammendrag av innstillingene. Når du har gått gjennom innstillingene, velger du Neste (Bekreft innstillinger) for å bruke disse innstillingene for alle eksemplene i eksperimentet.
      MERK: Instrumentet gir en 2-minutters live forhåndsvisning av celler som brukes til å justere instrumentets innstillinger. Hvis denne fristen utløper, frigir instrumentet prøven, og trinn 4.2.2-4.2.4 må gjentas. Fjern prøven og bland godt før du laster på nytt og fortsetter.
    5. Gate en populasjon av celler ved å tegne et område rundt cellepopulasjonen. Juster terskler for fluorescens og cellestørrelse ved hjelp av glidebryterne på x- og y-aksen i direkte forhåndsvisning. Bruk disse innstillingene for alle utvalgene i eksperimentet.
    6. Bland den første prøven ved forsiktig tilbakepipettering og legg den første prøven på flowcytometeret og velg Neste. Gi eksemplet et navn, og velg Kjør slik at systemet begynner å kjøre eksemplet.
      MERK: Instrumentet kan bare kjøre én prøve om gangen.
    7. Når alle eksemplene er kjørt, lagrer du eksperimentet ved å gi det en passende tittel. Lagre innstillingene for det gjeldende eksperimentet for henting i fremtidige kjøringer (valgfritt).

5. Analyse etter anskaffelse

  1. Utfør om nødvendig finjustering av porter eller kvadrantmarkører etter anskaffelsen.
  2. Finn eksperimentet som må justeres, ved å navigere i systemets filleser og åpne eksperimentet.
  3. Trykk på miniatyrforhåndsvisningen av plottet for å forstørre det. Trykk på hjørnet øverst til venstre eller nederst til høyre i celleporten for å justere dimensjonene til porten. For å justere kvadrantmarkørene, trykk på skjæringspunktet mellom de vertikale og horisontale linjene for å flytte markørene som de er. For å justere vinkelen på en av linjene, trykk på linjen og dra håndtaket.
  4. Juster markørene (som tidligere beskrevet i trinn 4.1.3–4.1.4) etter ønske, og bruk disse innstillingene på alle eksemplene i eksperimentet ved å merke av for hakemerket , merke alle eksemplene og velge Godta.

6. Statistisk analyse

  1. Kjør tester i triplikat og kjør en variansanalyse (ANOVA) med en post-hoc Bonferroni-test for å vurdere signifikante forskjeller mellom de behandlede prøvene og kontrollene.
    MERK: Den valgte statistiske testen er avhengig av utprøveren og variablene som analyseres.

Representative Results

Celletallet og levedyktigheten (figur 3) viste at 95,2% av cellene i prøven var levende, og 4,8% var døde. Den totale cellekonsentrasjonen i den opprinnelige prøven var 6,20 x 106 celler/ml.

Anneksin V og celledødsanalysen (figur 4) viste en signifikant økning (p < 0,0001) i apoptotiske celler i SiHa-celler behandlet med 100 ng/ml aktinomycin D sammenlignet med kontrollgruppene. Fordi Annexin V-farging er økt i celler under apoptose i tidlig stadium, tyder dette funnet på at 100 ng / ml actinomycin D induserte apoptose i SiHa-celler.

Den mitokondrielle elektrokjemiske transmembranpotensialanalysen (figur 5) viste en signifikant reduksjon (p < 0,0001) i cellehelseprofiler (levende, depolarisert og levende, depolarisert og død, død) mellom aktinomycin D, middels kontroll og løsningsmiddelkontroll. Disse dataene antyder at 100 ng/ml aktinomycin D induserte mitokondriell depolarisering i SiHa-celler.

Caspase 3/7-analysen (figur 6) viste signifikant (p < 0,0001) aktivering av caspase 3 og 7 i SiHa-celler behandlet med 100 ng/ml aktinomycin D sammenlignet med kontrollgruppene. Disse funnene viser at 100 ng/ml aktinomycin D induserte apoptose i SiHa-celler.

DNA-skadeanalysen (figur 7) viste at 100 ng/ml aktinomycin D signifikant (p < 0,0001) induserte DNA-skademarkører, ATM og H2A. X, i SiHa-celler. Dette funnet antyder signifikant økning i DNA-skade i SiHa-celler behandlet med actinomycin D.

Resultatene av suboptimale eksperimenter (figur 8) viser analytiske betraktninger på tvers av alle analyser. Cellekonsentrasjon påvirker nøyaktigheten av data. I figur 8A er celletallet uakseptabelt lavt. De inngjerdede cellepopulasjonene i alle 4 kvadranter av punktplottet har lav signalintensitet. Produsenten optimaliserer analysen for 300-700 celler / μL i det endelige prøvevolumet. Dette eksemplet illustrerer viktigheten av å bruke riktig prøvekonsentrasjon foreskrevet av produsenten.

I tillegg forårsaket høye cellekonsentrasjoner også feilaktige resultater (figur 8B). Middels og eksperimentelle kulturer viste henholdsvis 99,95% og 100% levende celler. Strømningshastigheten for begge analysene oversteg produsentens optimaliserte konsentrasjon på 100-500 celler / μL og krevde fortynning med 1x analysebuffer for å unngå unøyaktig analyse.

Celleklumping bør unngås under fremstilling av eksperimentelle kulturer, da det gir falske resultater på grunn av økte cellestørrelsesindekser, som illustrert i vedlegg V-analysen. Figur 8C viser et dobbelt problem med høy cellekonsentrasjon som overskrider produsentens instruksjon og celleklumping, som det fremgår av cellestørrelsesindekser over 4 i SiHa-mediumkontrollen. Den høye cellekonsentrasjonen illustreres ved at celleplater danner et rødt celleplan i mellomkulturer, noe som demonstrerer diskordant høye apoptotiske cellepopulasjoner.

Langvarig farging av kulturer kan resultere i uspesifikk binding av proteiner og resultere i falske resultater, som demonstrert ved vedlegg V-analysen. Figur 8D viser lignende resultater for middels og eksperimentelle kulturer på grunn av langvarig farging.

Dårlig prøvehåndtering, utvidet trypsinisering av adherente celler, kraftig pipettering under vasketrinn og høyhastighets og langvarige sentrifugeringstrinn forårsaker cellelyse og høye mengder celleavfall. I figur 8E viser kulturer analysert ved caspase 3/7-analysen økt celleavfall påvist ved en liten cellestørrelsesindeks (<2.2 cellestørrelsesindeks). Det bør derfor utvises forsiktighet ved utarbeidelse av prøver for datainnsamling.

Figure 3
Figur 3: Celletall og levedyktighetsanalyse. Befolkningsprofilen skiller avfall fra levende og døde celler. Det todimensjonale punktplottet er inngjerdet og deler levende og døde cellepopulasjoner. Informasjonspanelet gir kvantitative data om celleantall, prosentandel av totalt levedyktige celler og totalt antall levedyktige celler i prøven. Disse dataene kan brukes til å standardisere celletallet i alle prøver for senere apoptoseanalyser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Vedlegg V-analyse. Alle prøver viser identiske gatingparametere, og statistisk analyse av hver delpopulasjon viser en signifikant økning i apoptose i celler behandlet med aktinomycin D. Alle analysene ble utført som tre uavhengige eksperimenter, og hvert eksperiment ble analysert i tre eksemplarer. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, og p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Mitokondriell elektrokjemisk transmembran potensialanalyse. Alle prøver viser identiske gatingparametere, og statistisk analyse av hver subpopulasjon viser signifikant forstyrrelse i mitokondriemembranpotensialet i celler behandlet med aktinomycin D. Alle analysene ble utført som tre uavhengige eksperimenter, og hvert eksperiment ble analysert i tre eksemplarer. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, og p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Caspase 3/7 deteksjonsanalyse. Alle prøver viser identiske gatingparametere, og statistisk analyse av hver underpopulasjon viser en signifikant økning i caspase 3/7-aktivitet i celler behandlet med aktinomycin D. Alle analysene ble utført som tre uavhengige eksperimenter, og hvert eksperiment ble analysert i tre eksemplarer. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, og p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: DNA-skadeanalyse. Alle prøver viser identiske gatingparametere, og statistisk analyse av hver underpopulasjon viser en signifikant økning i dobbeltstrenget DNA-skade og total DNA-skade i celler behandlet med actinomycin D. Alle analysene ble utført på tre uavhengige eksperimenter, og hvert eksperiment ble analysert i tre eksemplarer. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, og p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Suboptimale eksperimentelle forhold gir dårlige resultater. (A) Lav konsentrasjon av celler, (B) høy konsentrasjon av celler, (C) celleklumping og aggregering påvist ved høy cellestørrelsesindeks, (D) langvarig farging av celleprøver påvist ved økt positiv farging i begge prøvene, og (E) dårlig prøvehåndtering påvist ved økt cellulært rusk (cellestørrelsesindeks < 2,2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

I denne studien viste actinomycin D-behandlede SiHa-celler analysert av FC signifikante tidlige og sene biomarkører for apoptose. Suboptimale forhold for cellepreparasjon, oppregning og farging identifiserte unøyaktige resultater, og understreket behovet for nøye overholdelse av produsentens instruksjoner ved utførelse av FC.

Denne studien av apoptose ved tidlig og sen biomarkøridentifikasjon er i samsvar med NCCDs retningslinjer1 for utredning av apoptose. Actinomycin D-behandlede SiHa-kulturer viste positive biomarkører for tidlige og sene apoptotiske stadier. Annexin V/PI-analysen og mitokondriell permeabilitetsanalyse viste at aktinomycin D induserte henholdsvis et PS-flip-mønster og spredning av mitokondriemembranovergangen. Når apoptotiske celler når punktet uten retur indusert av mitokondriell forstyrrelse, aktiveres de terminale caspasene 3,7. Aktiveringen av de terminale caspasene 3 og 7 observert i denne studien indikerer apoptose i sent stadium. Videre forårsaker terminal kaspaseaktivering internukleosomal DNA-spaltning og omfattende DNA-fragmentering, som klassisk har blitt rapportert som et trinnstigemønster observert ved gelelektroforese28,38.

De kjernefysiske skadene med minibanken og H2A. X FC DNA skadeanalyse viste dobbeltstrengbrudd i DNA og total DNA-skade. Disse resultatene bekreftet klassisk nedstrøms caspase-indusert apoptotisk kjernefysisk skade (karyorrhexis og karyorrlysis) i eksperimentelle kulturer. Bruken av multiple flowcytometriske biomarkører påviste dermed sekvensielle flertrinnshendelser i apoptose og nøyaktig og reproduserbart identifiserte cellepopulasjoner i tidlige og sene apoptotiske stadier. Disse funnene stemmer overens med de kjente pro-apoptotiske egenskapene til aktinomycin D i kreftbehandling hos mennesker 37,39,40,41 og støtter videre bruken av aktinomycin D som en positiv kontroll i FC-cellekultureksperimenter som undersøker apoptose.

Gating av cellepopulasjoner i denne studien ble informert av negative medium- og løsningsmiddelkontroller, som separerte apoptotisk fra friske celler. Alternativt kan en blanding av populasjoner av positive og negative kontroller også brukes til å definere levende og apoptotiske cellepopulasjoner for å sette cellepopulasjonsporter 7,9. Når syke og sunne cellulære tilstander er definert og gated, kan malinnstillingene brukes på alle påfølgende eksperimentelle og kontrollkulturer.

Streng overholdelse av FC-protokollen er viktig for å unngå falske resultater. Under optimaliseringen av protokollen ble følgende problemer observert: (1) lav cellekonsentrasjon, (2) høy cellekonsentrasjon, (3) celleklumping, (4) langvarig farging og (5) dårlig prøvehåndtering. Disse problemene kan forebygges ved streng overholdelse av optimaliserte protokollkrav. Dette understreker den avgjørende naturen til preanalytiske og analytiske trinn for FC for å oppnå nøyaktige data. Under cellepreparasjon må trypsinisering, pipettering, sentrifugering og fortynning utføres med forsiktighet. Overtrypsinisering og kraftig pipettering kan resultere i henholdsvis kjemisk og mekanisk skjæring av celler. Langvarig og høyhastighets sentrifugering kan resultere i cellenedbrytning og høyt antall cellulære rusk. Optimal cellekonsentrasjon er nødvendig for å minimere feil oppkjøp av cellehendelser. Derfor bør primære cellesuspensjoner fortynnes for å oppnå optimal cellekonsentrasjon.

Videre, ved håndtering av prøver, må det tas hensyn til å forhindre celleklumping og cellefragmentering og sikre at celler forblir i suspensjon under analysen. Prøvehåndtering for å forhindre celleklumping tillater enkelt laminær cellestrøm, forhindrer mekanisk blokkering av instrumentets kapillærrør og demper falske store cellestørrelsesindekser. En annen advarsel er å beskytte kulturer mot lys for å unngå fotooksidasjon og slukking av fluoroforene i analysene for å forhindre falske negative resultater. Det må utvises forsiktighet for å sikre minimal lyseksponering ved fargetrinnet til cellene og påfølgende behandlingstrinn. Videre kan forlengede immunfargingstider resultere i falske positive resultater, da proteiner ikke er spesifikt farget. Derfor er overholdelse av produsentens foreskrevne inkubasjonsfargeperioder viktig.

Oppsummert kan FC nøyaktig oppdage apoptose og diskriminere mellom tidlige og sene apoptosebiomarkører i cellekultur. I tillegg har fremskritt innen teknologi ført til produksjon av stasjonære strømningscytometre for ikke-ekspertforskere for å studere cellehelse og komplekse intracellulære signalveier.

Disclosures

Luminex® Corporation vennligst gitt artikkelen behandling kostnader.

Acknowledgments

Studien ble støttet økonomisk av National Research Foundation (NRF) og South African Medical Research Council (SAMRC). Vi takker National Health Laboratory Service (NHLS) for kjøp av Guava Muse Cell Analyzer. Alle figurene i denne publikasjonen ble laget med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plates Lasec P1PLA044C-000006
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
DMEM ThermoFisher 41966052
Glutamine Sigma-Aldrich P10-040500
Guava Muse Cell Analyzer Luminex 0500-3115
Microcentrifuge tubes/Eppendorf Merck EP0030122208-200EA
Muse Annexin V kit Merck MCH100105
Muse Caspase-3/7 kit Merck MCH100108
Muse Count and Viability kit Merck MCH600103
Muse DNA Damage kit Merck MCH200107
Muse MitoPotential kit Merck MCH100110
PBS Buffer ThermoFisher 70013065
Pen-strep Sigma-Aldrich P4333
SiHa cells ATCC CRL-1550
T25 culture flasks Sigma-Aldrich C6231
Trypsin Pan Biotech P10-040500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  2. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  3. Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).
  4. Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16 (6), 663-669 (2004).
  5. Arends, M. J., Morris, R. G., Wyllie, A. H. Apoptosis. The role of the endonuclease. The American journal of pathology. 136 (3), 593-608 (1990).
  6. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).
  7. Darzynkiewicz, Z., Traganos, F. Apoptosis. Al-Rubeai, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 33-73 (1998).
  8. Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. Flow cytometry-based apoptosis detection. Methods in molecular biology. 559, Clifton, N.J. 19-32 (2009).
  9. Bio-Rad Laboratories. Introduction to Flow Cytometry Basics. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html (2021).
  10. Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Detection of localized caspase activity in early apoptotic cells by laser scanning cytometry. Cytometry. 47 (2), 81-88 (2002).
  11. Castedo, M., et al. Quantitation of mitochondrial alterations associated with apoptosis. J Immunol Methods. 265 (1-2), 39-47 (2002).
  12. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current protocols in immunology. 120, 1-11 (2018).
  13. Macey, M. G. Flow cytometry: principles and clinical applications. Med Lab Sci. 45 (2), 165-173 (1988).
  14. Darzynkiewicz, Z., et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).
  15. Darzynkiewicz, Z., et al. Cytometry in cell necrobiology: Analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis). Cytometry. 27 (1), 1-20 (1997).
  16. Ormerod, M. G. The study of apoptotic cells by flow cytometry. Leukemia. 12 (7), 1013-1025 (1998).
  17. van Engeland, M., Nieland, L. J., Ramaekers, F. C., Schutte, B., Reutelingsperger, C. P. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry. 31 (1), 1-9 (1998).
  18. Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. Journal of Immunological Methods. 243 (1), 167-190 (2000).
  19. Jahan-Tigh, R. R., Ryan, C., Obermoser, G., Schwarzenberger, K. Flow cytometry. J Invest Dermatol. 132 (10), 1-6 (2012).
  20. Lövborg, H., Gullbo, J., Larsson, R. Screening for apoptosis-classical and emerging techniques. Anti-cancer drugs. 16 (6), 593-599 (2005).
  21. Vorobjev, I. A., Barteneva, N. S. Multi-parametric imaging of cell heterogeneity in apoptosis analysis. Methods. 112, 105-123 (2017).
  22. Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods in molecular biology. 263, Clifton, N.J. 141-160 (2004).
  23. Kagami, S., Rizzo, H. L., Lee, J. J., Koguchi, Y., Blauvelt, A. Circulating Th17, Th22, and Th1 cells are increased in psoriasis. J Invest Dermatol. 130 (5), 1373-1383 (2010).
  24. Luminex Corporation. Muse® Annexin V & Dead Cell Kit. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-annexin-v-dead-cell-kit/ (2019).
  25. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  26. Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 1463-1467 (2005).
  27. Apoptosis assays and markers guide. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/kits/apoptosis-assays (2021).
  28. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  29. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  30. Saelens, X., et al. Toxic proteins released from mitochondria in cell death. Oncogene. 23 (16), 2861-2874 (2004).
  31. Muse™ MitoPotential Kit User's Guide. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-mitopotential-kit (2013).
  32. McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (4), 008656 (2013).
  33. Wigdal, S. S., Kirkland, R. A., Franklin, J. L., Haak-Frendscho, M. Cytochrome c release precedes mitochondrial membrane potential loss in cerebellar granule neuron apoptosis: lack of mitochondrial swelling. Journal of Neurochemistry. 82 (5), 1029-1038 (2002).
  34. Muse® Caspase-3/7 Kit. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-caspase-3-7-kit/#overview (2019).
  35. Häcker, G. The morphology of apoptosis. Cell and Tissue Research. 301 (1), 5-17 (2000).
  36. Muse® Multi-Color DNA Damage Kit User's Guide. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-multi-color-dna-damage-kit/#overview (2020).
  37. Kleeff, J., Kornmann, M., Sawhney, H., Korc, M. Actinomycin D induces apoptosis and inhibits growth of pancreatic cancer cells. International journal of cancer. 86 (3), 399-407 (2000).
  38. Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances. Experimental oncology. 34 (3), 255-262 (2012).
  39. Szeberenyi, J. The effect of actinomycin D on RNA metabolism in human cells. Biochem Mol Biol Educ. 34 (1), 50-51 (2006).
  40. Ginell, S., Lessinger, L., Berman, H. M. The crystal and molecular structure of the anticancer drug actinomycin D--some explanations for its unusual properties. Biopolymers. 27 (5), 843-864 (1988).
  41. Hou, M. H., Robinson, H., Gao, Y. G., Wang, A. H. Crystal structure of actinomycin D bound to the CTG triplet repeat sequences linked to neurological diseases. Nucleic Acids Res. 30 (22), 4910-4917 (2002).

Tags

Retraksjon utgave 174 Apoptose flowcytometri SiHa actinomycin D
Flowcytometrisk analyse av apoptotiske biomarkører i Actinomycin D-behandlede SiHa livmorhalskreftceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Punchoo, R., Zhou, E., Bhoora, S.… More

Punchoo, R., Zhou, E., Bhoora, S. Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells. J. Vis. Exp. (174), e62663, doi:10.3791/62663 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter