Summary
Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.
Abstract
Reversibele oxidatieve modificaties op eiwitthiolen zijn onlangs naar voren gekomen als belangrijke mediatoren van cellulaire functie. Hierin beschrijven we de gedetailleerde procedure van een kwantitatieve redox proteomics-methode die gebruik maakt van resin-assisted capture (RAC) in combinatie met tandem mass tag (TMT) isobare etikettering en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) om multiplexed stochiometrische kwantificering van geoxideerde eiwitthiolen op proteoomniveau mogelijk te maken. De site-specifieke kwantitatieve informatie over geoxideerde cysteïneresiduen biedt extra inzicht in de functionele effecten van dergelijke modificaties.
De workflow is aanpasbaar voor vele soorten monsters, waaronder gekweekte cellen (bijv. Zoogdier, prokaryote) en hele weefsels (bijv. Hart, long, spier), die aanvankelijk worden gelyseerd / gehomogeniseerd en waarbij vrije thiolen worden gealkyleerd om kunstmatige oxidatie te voorkomen. De geoxideerde eiwitthiolen worden vervolgens gereduceerd en gevangen door een thiolaffiniteitshars, die de workflowstappen stroomlijnt en vereenvoudigt door de lopende verterings-, etiketterings- en wasprocedures uit te voeren zonder extra overdracht van eiwitten / peptiden. Ten slotte worden de gelabelde peptiden geëlueerd en geanalyseerd door LC-MS / MS om uitgebreide stoichiometrische veranderingen te onthullen die verband houden met thioloxidatie in het hele proteoom. Deze methode verbetert het begrip van de rol van redox-afhankelijke regulatie onder fysiologische en pathofysiologische toestanden gerelateerd aan eiwitthioloxidatie aanzienlijk.
Introduction
Onder homeostatische omstandigheden genereren cellen reactieve zuurstof-, stikstof- of zwavelsoorten die helpen om processen te vergemakkelijken, zoals metabolisme en signalering 1,2,3, die zich uitstrekken tot zowel prokaryoten als eukaryoten. Fysiologische niveaus van deze reactieve soorten zijn noodzakelijk voor een goede cellulaire functie, ook bekend als 'eustress'1,4. Daarentegen kan een toename van oxidanten die leidt tot een onbalans tussen oxidanten en antioxidanten oxidatieve stress of 'distress'1 veroorzaken, wat leidt tot cellulaire schade. Oxidanten transduceren signalen naar biologische routes door verschillende biomoleculen te modificeren, waaronder eiwitten, DNA, RNA en lipiden. In het bijzonder zijn cysteïneresiduen van eiwitten zeer reactieve plaatsen die vatbaar zijn voor oxidatie als gevolg van de thiolgroep op cysteïne, die reactief is op verschillende soorten oxidanten5. Dit geeft aanleiding tot een breed scala aan reversibele redox-gebaseerde posttranslationele modificaties (PTM's) voor cysteïne, waaronder nitrosylatie (SNO), glutathionylering (SSG), sulfenylering (SOH), persulfidatie (SSH), polysulfidatie (SSnH), acylering en disulfiden. Onomkeerbare vormen van cysteïne-oxidatie omvatten sulfinylering (SO2H) en sulfonylering (SO3H).
Omkeerbare oxidatieve modificaties van cysteïneresiduen kunnen beschermende rollen vervullen om verdere onomkeerbare oxidatie te voorkomen of dienen als signaalmoleculen voor stroomafwaartse cellulaire routes 6,7. De omkeerbaarheid van sommige thiol redox PTM's zorgt ervoor dat cysteïneplaatsen kunnen functioneren als "redoxschakelaars"8,9, waarbij veranderingen in de redoxtoestand van deze sites de eiwitfunctie veranderen om hun rol in voorbijgaande processen te reguleren. De modulerende effecten van redox PTM's10 zijn waargenomen in vele aspecten van eiwitfunctie11, waaronder katalyse12, eiwit-eiwitinteracties13, conformatieverandering14, metaalionencoördinatie15 of farmacologische inhibitorbinding16. Bovendien zijn redox PTM's betrokken bij cysteïneplaatsen van eiwitten die routes reguleren zoals transcriptie17, translatie18 of metabolisme19. Gezien de impact die redox PTM's hebben op de eiwitfunctie en biologische processen, is het belangrijk om de mate van oxidatie te kwantificeren die een cysteïneplaats ondergaat als reactie op een verstoring van de redoxtoestand.
De identificatie van cysteïneplaatsen met veranderde redoxtoestanden is gericht op de vergelijking van de oxidatietoestand op het locatiespecifieke niveau tussen normale en verstoorde omstandigheden. Vouwveranderingsmetingen worden vaak gebruikt om te bepalen welke sites aanzienlijk zijn gewijzigd, omdat dit gebruikers helpt te interpreteren welke cysteïnesites fysiologisch significant kunnen zijn voor het onderzoek. Als alternatief geven stoichiometrische metingen van omkeerbare thioloxidatie over een specifiek monstertype een algemeen beeld van de fysiologische toestand met betrekking tot cellulaire oxidatie, een belangrijke meting die vaak over het hoofd wordt gezien en onderbenut. Modificatie stoichiometrie is gebaseerd op het kwantificeren van het percentage gemodificeerde thiol als verhouding tot totaal eiwit thiol (gemodificeerd en ongewijzigd)20,21. Als gevolg hiervan bieden stoichiometrische metingen een nauwkeurigere meting dan vouwverandering, vooral bij gebruik van massaspectrometrie. De betekenis van de toename van oxidatie kan gemakkelijker worden vastgesteld door stoichiometrie te gebruiken om de PTM-bezetting van een bepaalde cysteïneplaats te bepalen. Een 3-voudige toename van thioloxidatie kan bijvoorbeeld het gevolg zijn van een overgang van slechts 1% naar 3% of zo groot als 30% tot 90%. Een 3-voudige toename van oxidatie voor een site die slechts 1% bezetting heeft, kan weinig invloed hebben op de functie van een eiwit; een 3-voudige toename voor een site met 30% bezetting in rusttoestand kan echter meer substantieel worden beïnvloed. Stoichiometrische metingen, wanneer uitgevoerd tussen totaal geoxideerde thiolen en specifieke oxidatieve modificaties, waaronder eiwitgluutathionylering (SSG) en nitrosylering (SNO), kunnen verhoudingen en kwantitatieve informatie onthullen met betrekking tot specifieke modificatietypen.
Omdat reversibele thioloxidatie typisch een posttranslationele modificatie met een lage abundantie is, zijn er meerdere benaderingen ontwikkeld voor de verrijking van eiwitten die deze modificaties bevatten uit biologische monsters. Een vroege aanpak bedacht door Jaffrey en anderen, genaamd de biotine switch techniek (BST)22, omvat meerdere stappen waarbij ongewijzigde thiolen worden geblokkeerd door alkylering, reversibel gemodificeerde thiolen worden gereduceerd tot ontluikende vrije thiolen, ontluikende vrije thiolen worden gelabeld met biotine en de gelabelde eiwitten worden verrijkt door streptavidin affiniteit pulldown. Deze techniek is in veel studies gebruikt om SNO en SSG te profileren en kan worden aangepast om te onderzoeken op andere vormen van reversibele thioloxidatie23,24. Hoewel BST is gebruikt om te onderzoeken op verschillende vormen van omkeerbare thioloxidatie, is een zorg bij deze aanpak dat verrijking wordt beïnvloed door de niet-specifieke binding van niet-geïnbiotinyleerde eiwitten aan streptavidin. Een alternatieve aanpak die in ons laboratorium is ontwikkeld, genaamd resin-assisted capture (RAC)25,26 (figuur 1), omzeilt de kwestie van verrijking van thiolgroepen via het biotine-streptavidin-systeem.
Na de reductie van reversibel geoxideerde thiolen, worden eiwitten met ontluikende vrije thiolen verrijkt met de thiolaffiniteitshars, die covalent vrije thiolgroepen vangt, waardoor meer specifieke verrijking van cysteïnebevattende eiwitten mogelijk is dan BST. Het koppelen van RAC aan de multiplexingkracht van de recente vooruitgang in isobare etikettering en massaspectrometrie creëert een robuuste en gevoelige workflow voor de verrijking, identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen op proteoombreed niveau. Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie hebben een veel diepere profilering van het thiol redoxproteoom mogelijk gemaakt, waardoor het begrip van zowel de oorzaak als het gevolg van eiwitthioloxidatieis toegenomen 27. De informatie die wordt verkregen uit locatiespecifieke kwantitatieve gegevens maakt verdere studies mogelijk van de mechanistische effecten en downstream-effecten van omkeerbare oxidatieve modificaties28. Het gebruik van deze workflow heeft inzicht gegeven in de fysiologische effecten van omkeerbare cysteïne-oxidatie met betrekking tot normale fysiologische gebeurtenissen zoals veroudering, waarbij de niveaus van SSG verschilden met betrekking tot leeftijd. De verouderingseffecten op SSG werden gedeeltelijk omgekeerd met behulp van SS-31 (elamipretide), een nieuw peptide dat de mitochondriale functie verbetert en de SSG-niveaus bij oudere muizen verlaagt, waardoor ze een SSG-profiel hebben dat meer lijkt op jonge muizen29.
Van pathofysiologische aandoeningen die worden toegeschreven aan blootstelling aan nanodeeltjes is aangetoond dat SSG betrokken is bij een macrofaagmodel van muizen. Met behulp van RAC in combinatie met massaspectrometrie toonden de auteurs aan dat SSG-niveaus direct gecorreleerd waren met de mate van oxidatieve stress en aantasting van de macrofaagfagocytische functie. De gegevens onthulden ook pathway-specifieke verschillen in reactie op verschillende gemanipuleerde nanomaterialen die verschillende graden van oxidatieve stress induceren30. De methode heeft ook zijn nut bewezen bij prokaryote soorten, waar het werd toegepast om de effecten van dagcyclussen in fotosynthetische cyanobacteriën met betrekking tot thioloxidatie te bestuderen. Brede veranderingen in thioloxidatie in verschillende belangrijke biologische processen werden waargenomen, waaronder elektronentransport, koolstoffixatie en glycolyse. Bovendien werd door orthogonale validatie bevestigd dat verschillende belangrijke functionele locaties werden gewijzigd, wat suggereert dat deze regulerende rollen van deze oxidatieve modificaties6.
Hierin beschrijven we de details van een gestandaardiseerde workflow (figuur 1), die het nut van de RAC-benadering aantoont voor de verrijking van totale geoxideerde cysteïnethiolen van eiwitten en hun daaropvolgende etikettering en stoichiometrische kwantificering. Deze workflow is geïmplementeerd in studies naar de redoxtoestand in verschillende monstertypen, waaronder celculturen 27,30 en hele weefsels (bijv. skeletspieren, hart, longen)29,31,32,33. Hoewel het hier niet is opgenomen, is het RAC-protocol ook gemakkelijk aan te passen voor het onderzoek naar specifieke vormen van omkeerbare redoxmodificaties, waaronder SSG, SNO en S-acylering, zoals eerder vermeld 25,29,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in het protocol beschreven procedures met betrekking tot dierlijke of menselijke monsters/weefsels werden goedgekeurd door en volgden de institutionele richtlijnen van de ethische commissie voor onderzoek bij mens en dier.
1. Homogenisatie/lysis van het monster
- Ingevroren weefselmonsters
- Gehakt bevroren weefsel (~ 30 mg) op een glazen microscoop glaasje op droogijs met behulp van een vooraf gechilleerd scheermesje en een tang. Breng het gehakte weefsel over in een vooraf gegraveerde buis van 5 ml rondbodempolystyreen met 700 μL buffer A (zie tabel 1) en incubeer gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
- Verstoor het weefsel gedurende 30 s of totdat het volledig is gehomogeniseerd met een handgezogenheidshomogenisator. Leg de monsters op ijs en laat het schuim nog 10 minuten zakken.
OPMERKING: Een aluminium bakplaat geplaatst op droogijs biedt een stabiel werkoppervlak en platform voor de eerste verwerking / gehakt van het weefsel.
- U kunt ook aanhangende celculturen gebruiken in 100 mm kweekschalen als uitgangsmateriaal.
- Houd de cellen op ijs en gebruik een serologische pipet om de cellen tweemaal te spoelen met 10 ml ijskoude PBS met 100 mM NEM.
- Lyseer de cellen door 1 ml koude homogenisatie/ lysisbuffer toe te voegen en krachtig te schrapen met een stijve celschraper. Breng het lysaat over in een centrifugebuis van 2 ml met behulp van een micropipette.
OPMERKING: Spoelbuffer en lysisbuffer kunnen worden geschaald op basis van kweekvaten van verschillende grootte. Meestal zijn 2-5 miljoen cellen nodig; dit varieert echter afhankelijk van de lysis-efficiëntie en eiwitopbrengst voor specifieke celtypen. Homogenisatiebuffer kan zonder NEM worden bereid voor monsters die worden geanalyseerd op totale thiolen.
- Breng het resulterende homogenaat (stap 1.1.2 of 1.2.2) over in een centrifugebuis van 2 ml met behulp van een micropipette en centrifugeer op volle snelheid (≥16.000 × g) bij 4 °C gedurende 10 minuten.
- Breng het supernatant (~ 700 μL of ~ 1 ml voor celkweek) over met behulp van een micropipette naar een conische microcentrifugebuis van 5 ml en incubeer gedurende 30 minuten bij 55 °C in het donker met schudden bij 850 tpm.
- Voeg met behulp van een glazen serologische pipet 4 ml ijskoude aceton toe aan de monsters en incubeer bij -20 °C 's nachts voor precipitatie van eiwit en verwijdering van overtollig N-ethylmaleimide.
2. Harsondersteunde afvang
- Was de neergeslagen eiwitkorrels tweemaal met aceton door gedurende 10 minuten te centrifugeren op 20.500 × g bij 4 °C, de aceton te decanteren, eventuele resterende aceton te verwijderen met behulp van een micropipette en 3 ml verse, ijskoude aceton toe te voegen met behulp van een glazen serologische pipet. Keer meerdere keren om om te mengen. Laat de pellets na de tweede wasbeurt 1-2 minuten aan de lucht drogen, zorg ervoor dat u niet te veel droogt, omdat resuspensie moeilijk kan worden.
- Voeg met behulp van een micropipette 1 ml buffer B toe (zie tabel 1) en verzacht het eiwit met herhaalde ultrasoonapparaat gedurende 15-30 s per keer met behulp van een badsonicator met een vermogen van 250 W en korte vortexing. Meet de eiwitconcentratie met behulp van de bicinchonininezuur (BCA) assay volgens het protocol van de fabrikant.
- Om de eiwitconcentraties in monsters te standaardiseren voor verdere verwerking en volledige verwijdering van NEM te garanderen, brengt u 500 μg eiwit over naar een centrifugaalfilter van 0,5 ml 10 kDa met behulp van een micropipette en past u het aan een laatste volume van 500 μL aan met resuspensiebuffer.
- Centrifugeer bij 14.000 × g bij kamertemperatuur totdat het volume in het centrifugaalfilter minder dan 100 μL bedraagt. Verzamel de monsters door het filter in een opvangbuis om te keren. Centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 2 minuten en stel het in op een eindvolume van 500 μL met buffer C (zie tabel 1).
- Verminder de eiwitthiolen door 20 μL van 500 mM dithiothreitol (DTT) met behulp van een micropipette toe te voegen tot een eindconcentratie van 20 mM en de monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C te incuberen tijdens het schudden bij 850 rpm.
- Breng de monsters na reductie met behulp van een micropipette over op 0,5 ml 10 kDa centrifugaalfilters en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 14.000 × g bij kamertemperatuur of totdat het volume in het centrifugaalfilter minder dan 100 μL bedraagt. Voeg buffer D (zie tabel 1) toe om het volume in het centrifugaalfilter op 500 μL te brengen.
- Herhaal de centrifuging en toevoeging aan 500 μL in stap 2.6 drie keer en verzamel na de vierde centrifugatie de monsters door het filter in een verzamelbuis om te keren en gedurende 2 minuten te centrifugeren bij 1.000 × g .
- Meet de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-test volgens het protocol van de fabrikant.
- Bereid tijdens deze bufferuitwisseling de thiolaffiniteitshars voor door de juiste hoeveelheid hars (30 mg/monster) te wegen met behulp van een microbalans en over te brengen naar een centrifugebuis van 50 ml. Voeg vervolgens met behulp van een serologische pipet water toe voor een uiteindelijke concentratie van 30 mg / ml hars en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met agitatie voor een goede hydratatie van de hars.
OPMERKING: De hierboven genoemde thiolaffiniteitshars is door de fabrikant stopgezet. Een mogelijke vervanging voor deze thiolaffiniteitshars is in de handel verkrijgbaar. Deze vervanging heeft echter een bijna 5-voudig minder bindingscapaciteit (zie Aanvullende informatie). Als alternatief kan de thiolaffiniteitshars worden gesynthetiseerd met behulp van 2-(pyridyldithio) ethylaminehydrochloride en N-hydroxysuccinimide-geactiveerde hars (zie Aanvullende informatie).- Na hydratatie van de hars plaatst u de spinkolommen op een vacuümspruitstuk en brengt u 500 μL van de harsbrij met behulp van een micropipette over naar elke kolom. Breng vacuüm aan voor het verwijderen van water; herhaal deze stap eenmaal om in totaal 30 mg hars per kolom te verkrijgen. U kunt ook centrifugeren op 1.000 × g gedurende 2 minuten in plaats van hiervoor het vacuümspruitstuk en alle harswas- en elutiestappen te gebruiken.
OPMERKING: Het snijden van het uiteinde van een pipetpunt van 1000 μL om de boring te vergroten, helpt bij de overdracht van de hars. Het is belangrijk om te tritureren tussen pipetteren om ervoor te zorgen dat de hars gesuspendeerd blijft en homogene en gelijke hoeveelheden hars worden overgebracht naar elke kolom. - Was de hars door 500 μL ultrapuur water toe te voegen met een micropipette en vacuüm toe te passen voor het verwijderen van het water; herhaal dit 5 keer. Was de hars vervolgens 5 keer met 500 μL buffer E (zie tabel 1).
OPMERKING: Als alternatief kan centrifugatie bij 1.000 x g gedurende 2 minuten worden gebruikt in plaats van een vacuümspruitstuk voor alle volgende wasstappen. Alle lopende wasstappen worden uitgevoerd met een volume van 500 μL. Voeg bij het toevoegen van wasbuffers aan de kolom voorzichtig toe met voldoende kracht om de hars volledig te resuspenderen terwijl spatten en verlies van hars worden vermeden; dit maakt het mogelijk om hars volledig en efficiënt te wassen.
- Na hydratatie van de hars plaatst u de spinkolommen op een vacuümspruitstuk en brengt u 500 μL van de harsbrij met behulp van een micropipette over naar elke kolom. Breng vacuüm aan voor het verwijderen van water; herhaal deze stap eenmaal om in totaal 30 mg hars per kolom te verkrijgen. U kunt ook centrifugeren op 1.000 × g gedurende 2 minuten in plaats van hiervoor het vacuümspruitstuk en alle harswas- en elutiestappen te gebruiken.
- Breng met behulp van een micropipette 150 μg eiwit van elk gereduceerd monster over naar een nieuwe buis en pas het aan tot een eindvolume van 120 μL buffer C (zie tabel 1). Breng de eiwitoplossing met behulp van een micropipette over op een verstopte spinkolom met de hars, plaats de dop op de kolom en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 850 tpm.
- Was de hars vijf keer met 25 mM HEPES, pH 7,0; 8 M ureum; gevolgd door vijf keer met 2 M NaCl; gevolgd door vijf keer met 80% acetonitril (ACN) met 0,1% trifluorazijnzuur (TFA); en ten slotte vijf keer met 25 mM HEPES, pH 7,7, zoals beschreven in stap 2.8.2 en vervang de stekker.
OPMERKING: Monsters kunnen hier worden geëlueerd voor analyse op eiwitniveau (bijv. SDS-polyacrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE), western blot) zoals beschreven in stap 4.1.
3. Tryptische vergisting op hars en TMT-etikettering
- Bereid voldoende gemodificeerde trypsineoplossing van sequencingkwaliteit voor 6-8 μg per monster door deze op te lossen in een concentratie van 0,5 μg/μL in buffer C (zie tabel 1), zodat het uiteindelijke volume ten minste 120 μL per monster toelaat. Voeg met behulp van een micropipette 120 μL van deze trypsine-oplossing toe aan de monsters en incubeer een nacht bij 37 °C met schudden bij 850 tpm.
OPMERKING: Om de verteringsefficiëntie te verhogen, kan de volgende dag een extra verteringsstap worden opgenomen door de trypsine-oplossing te verwijderen en te vervangen door een verse oplossing en de spijsvertering gedurende 2 uur voort te zetten. - Was de hars vijf keer met 25 mM HEPES, pH 7,0; gevolgd door vijf keer 2 M NaCl; gevolgd door vijf keer met 80% ACN met 0,1% TFA; gevolgd door driemaal met 25 mM HEPES, pH 7,7. Was de hars ten slotte twee keer met 50 mM triethylammoniumbicarbonaatbuffer (TEAB) en vervang de plug.
- Bereid TMT-etiketteringsreagentia voor door ze eerst te laten opwarmen tot kamertemperatuur voordat ze kort worden afgecentrifugeerd met behulp van een centrifuge van 16.000 × g. Voeg 150 μL watervrij ACN toe aan elke injectieflacon met TMT-etiketteringsreagens met behulp van een micropipette. Incubeer de injectieflacons bij kamertemperatuur op een thermomixer die gedurende 5 minuten op 850 tpm is ingesteld om het reagens volledig op te lossen. Kort vortex en spin naar beneden bij 16.000 × g om het reagens te verzamelen.
- Voeg met behulp van een micropipette 40 μL 100 mM TEAB toe aan de gewassen hars, voeg vervolgens 70 μL van het opgeloste TMT-reagens toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 850 tpm. Bewaar eventueel achtergebleven TMT-reagens bij -80 °C.
OPMERKING: Let op de afzonderlijke TMT-labels die aan elk biologisch monster zijn toegewezen (figuur 1). - Was de hars vijf keer met 80% ACN met 0,1% TFA, drie keer met 100 mM ammoniumbicarbonaatbuffer (ABC), pH 8,0 en tweemaal met water zoals eerder beschreven en vervang de plug.
4. Peptide-elutie
- Eluteer de gelabelde peptiden door 100 μL van 20 mM DTT in 100 mM ABC, pH 8,0, aan elke kolom toe te voegen met behulp van een micropipette en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een thermomixer ingesteld op 850 rpm.
OPMERKING: Na de toevoeging van DTT zal de hars klonteren. De hars kan worden verstoord met een pipetpunt om klonten te breken en de volledige elutie van de peptiden te garanderen. - Plaats na deze incubatie de kolom op een vacuümspruitstuk dat bedoeld is voor vastefase-extractie (SPE), breng vacuüm aan en elueerde de monsters in een microcentrifugebuis van 5 ml. Herhaal deze stap eenmaal.
- Voeg ten slotte 100 μL 80% ACN toe met 0,1% TFA, incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en eluut in dezelfde centrifugebuis van 5 ml. Verzamel alle fracties in dezelfde microcentrifugebuis van 5 ml.
OPMERKING: Om monsterverlies te voorkomen, moeten buizen met een lage binding worden gebruikt voor elutie en moeten volumes op of onder een volume van 4,0 ml worden gehouden voor een enkele buis van 5 ml. - Plaats de geëlueerde monsters in een vacuümconcentrator tot ze droog zijn. Bewaar de droge peptiden bij -80 °C en resuspen ze later.
OPMERKING: Monsters kunnen ook afzonderlijk worden geëlueerd en een aliquot kan worden verwijderd en geanalyseerd door SDS-PAGE voor analyse op peptideniveau voordat de monsters worden gecombineerd.
5. Peptide-alkylering en ontzilting/sanering
- Resuspendeer de gedroogde peptiden door een klein volume van 100 mM ABC-buffer, pH 8,0 (niet groter dan 500 μL), toe te voegen met behulp van een micropipette. Gebruik herhaalde ultrasoonapparaat gedurende 15-30 s per keer met behulp van een badsonicator met een vermogen van 250 W en vortex om op te lossen en over te brengen naar een buis van 2 ml.
OPMERKING: Het volume van 100 mM ABC, pH 8,0 dat moet worden toegevoegd, is gebaseerd op het volume dat nodig is om de DTT te resuspenderen bij een molariteit van 150 mM. Gebruikers moeten de hoeveelheid DTT in hun steekproef bepalen op basis van wat oorspronkelijk in stap 4.1 is toegevoegd. - Voeg voldoende geconcentreerde stamoplossing (600 mM) jodoacetamide (IAZ) opgelost in ABC toe met behulp van een micropipette om een 1:4 molaire verhouding van DTT:IAZ te bereiken en incubeer de monsters bij RT gedurende 1 uur met schudden bij 850 tpm.
- Verzuur de monsters tot pH-< 3 door geconcentreerde TFA (10%) toe te voegen met behulp van een micropipette en monsterontzilting uit te voeren met behulp van omgekeerde fasereiniging volgens de instructies van de fabrikant.
- Plaats de schone peptiden in een vacuümconcentrator tot ze droog zijn. Bewaar de droge peptiden bij -80 °C tot verdere analyse.
6. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie
- Resuspendeer de gedroogde peptiden door herhaalde ultrasoonapparaat gedurende 15-30 s per keer met behulp van een badsonicator met een output van 250 W en vortexing in 20-40 μL water met 3% ACN. Bepaal de peptideconcentratie door een BCA-test uit te voeren volgens het protocol van de fabrikant.
- Scheid de monsters door omgekeerde fase LC en MS/MS zoals eerder beschreven6 en noteer de MS1-spectra over het m/z-bereik van 400-2000. Zorg ervoor dat hoogenergetische botsingsdissociatie (HCD) wordt gebruikt om informatie over de ionenintensiteit van reporters te verkrijgen voor de analyse van isobarisch gelabelde peptiden. Zie de methodensecties van eerdere rapporten voor meer informatie over instrumentruncondities27,30 en de analyse van MS-gegevens27,31.
OPMERKING: Verschillende LC-MS/MS-systemen of -instellingen kunnen worden gebruikt om de peptidemonsters te analyseren. De dekking en gevoeligheid van peptide-identificatie is afhankelijk van het specifieke systeem en de gebruikte instellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voltooiing van het protocol zal resulteren in zeer specifieke verrijking van voorheen geoxideerde cysteïnebevattende peptiden, vaak met >95% specificiteit 27,35,36. Verschillende belangrijke stappen van het protocol vereisen echter speciale aandacht, bijvoorbeeld de initiële blokkering van vrije thiolen voorafgaand aan monsterlysis / homogenisatie, die kunstmatige oxidatie en niet-specifieke verrijking van kunstmatig geoxideerde thiolen verbiedt25. Monsters kunnen worden geanalyseerd in verschillende stadia van het protocol en met verschillende methoden, waaronder SDS-PAGE-analyse van zowel eiwitten als peptiden. SDS-PAGE maakt kwalitatieve analyse van monsters mogelijk, waarbij totaal-thiolmonsters ratio-metrische vergelijkingen tussen monsters mogelijk maken voor het bepalen van verschillende niveaus van oxidatie als gevolg van behandelingen / stimuli (figuur 2A). Om de oxidatieniveaus van individuele eiwitten verder te onderzoeken, kunnen SDS-PAGE-gels worden onderworpen aan western blotting36 (figuur 2B). Hierdoor kan het modelsysteem in meer detail worden geanalyseerd, waardoor ondersteunende gegevens en verdere hypothesen over netwerken en biologische routes worden gegenereerd. Deze methoden/ondersteunende gegevens kunnen ook worden gebruikt als kwaliteitscontrole om de verwachte reacties te bevestigen voor verdere diepgaande analyse zoals LC-MS / MS. Reporter-ionintensiteiten van cysteïnebevattende peptiden geanalyseerd door LC-MS / MS kunnen worden gebruikt om thioloxidatiestoichiometrie op individuele Cys-siteniveaus te kwantificeren (figuur 2C, D).
Figuur 1: Voorbeeldverwerkingsworkflow. De monsterverwerkingsworkflow is aanpasbaar voor het onderzoeken van thioloxidatie in verschillende monstertypen en biologische systemen. De workflow maakt onderzoek mogelijk naar oxidatie op zowel het eiwit- als het peptideniveau (bijv. SDS-PAGE, western blot) en diepe dekking voor kwantitatieve, sitespecifieke identificatie van individuele cysteïnelocaties met behulp van HPLC in combinatie met massaspectrometrie. Monsterverwerking kan in slechts drie dagen worden voltooid, inclusief de voltooiing van verschillende kritieke stappen voor het genereren van hoogwaardige, consistente gegevens. Sample multiplexing via TMT-labeling maakt het mogelijk om meerdere monsters tegelijkertijd parallel te verwerken. Het representatieve 10-plex TMT-etiketteringsschema illustreert hoe monsters kunnen worden gerangschikt rekening houdend met de potentiële overspraak van het totale thiolkanaal. Met de isotopische onzuiverheden van de TMT-reagentia kan de signaalintensiteit van een kanaal met hoge intensiteit (zoals total-thiol) bijdragen aan een ander kanaal met een lage signaalintensiteit en de kwantificering ervan beïnvloeden37. In het schema wordt verwacht dat een gepoold totaal-thiolkanaal (een combinatie van controle- en experimentele monsters) hoge niveaus van Cys-peptiden bevat en is gelabeld met 131N, dat een signaal zal hebben in kanaal 130N. Kanaal 130N wordt dus niet gebruikt in het experiment. De hoeveelheid kanaaloverspraak die door TMT-labels wordt gecreëerd, is te vinden in de analysecertificaten van de fabrikant voor een overeenkomstige batch van het reagens. Dit cijfer is overgenomen uit Guo et al., Nature Protocols, 201425. Afkortingen: NEM = N-ethylmaleimide; DTT = dithiothreitol; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese; SPE = vaste-fase extractie; LC-MS/MS = vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie; TMT = tandem massa tag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van peptiden uit RAC-verrijking. (A) SDS-PAGE analyse van geoxideerde peptiden uit RAW 264,7 cellen behandeld met de chemische oxidant, diamide, gedurende 30 minuten bij toenemende concentraties (0,1 en 0,5 mM) en totaal peptide thiolen. Deze subfiguur en subfiguur D zijn overgenomen uit Guo et al., Nature Protocols, 2014 25. Peptiden werden gevisualiseerd door zilverkleuring. (B) RAW 264,7 cellen werden behandeld met exogene oxidanten (waterstofperoxide en diamide) in toenemende concentraties. Het resulterende SSG-verrijkte eiwitelulaat werd gescheiden door SDS-PAGE en vervolgens onderzocht door western blot voor individuele eiwitten (GAPDH, TXN, PRDX3 en ANXA1). Dit subfiguur is overgenomen uit Su et al., Free Radical Biology and Medicine, 201436. (C) Representatieve MS/MS-spectrumgegevens van een cysteïnebevattend peptide bekeken in Xcalibur-software. De inset MS/MS-afbeelding toont de overeenkomstige reporterionintensiteiten voor hetzelfde peptide in elk TMT-kanaal. In dit experiment werd het totale thiolmonster toegewezen aan het TMT-label 131N, dat de hoogste intensiteit heeft van alle kanalen die in het experiment worden gebruikt. (D) Stoichiometrie van iTRAQ-gelabelde, verrijkte, geoxideerde peptiden zoals gemeten door LC-MS/MS. Het total-thiolkanaal werd gebruikt als referentie om de stoichiometrie van oxidatie te berekenen op basis van de verhouding van de intensiteit van het reporterion van elk monster ten opzichte van die van het totale thiolkanaal. Afkortingen: RAC = harsondersteunde afvang; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese; Ctrl = controle; GAPDH = glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase; TXN = thioredoxine; PRDX3 = thioredoxine-afhankelijk peroxidereductase; ANXA1 = bijlage A1; LC-MS/MS = vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie; MS/MS = tandem massaspectrometrie; TMT = tandem massa tag; iTRAQ = isobare tag voor relatieve en absolute kwantificering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Buffernaam | Doel | Inhoud |
| Buffer A | Lysis/homogenisatie | 250 mM 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur (MES), pH 6,0; 1% natriumdodecylsulfaat (SDS); 1% Triton X-100; en 100 mM N-ethylmaleimide (NEM) |
| Buffer B | Resuspensie na eiwitprecipitatie en eerste bufferuitwisseling | 250 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES), pH 7,0; 8 M ureum; 0,1% SDS |
| Buffer C | Reductie/ Verrijking/ Vertering van cysteïnebevattende eiwitten | 25 mM HEPES, pH 7,7; 1 M ureum; 0,1% SDS |
| Buffer D | Tweede bufferwissel na verlaging | 25 mM HEPES, pH 7,0, 8 M ureum; 0,1% SDS |
| Buffer E | Wassen van de hars na hydratatie | 25 mM HEPES, pH 7,7 |
Tabel 1. Lijst van buffers
Aanvullende informatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Harsondersteunde afvang is gebruikt in een verscheidenheid aan monstertypen en biologische systemen voor het onderzoek naar oxidatieve modificaties van cysteïneresiduen 25,29,30. Deze methode maakt de evaluatie van monsters op meerdere niveaus en uitlezingen mogelijk, waaronder eiwitten en peptiden met behulp van SDS-PAGE en western blot-analyse, evenals individuele cysteïnesites met behulp van massaspectrometrie. Ongeacht het monstertype of het uiteindelijke eindpunt, de methode maakt uiteindelijk een zeer efficiënte en specifieke verrijking van cysteïnebevattende eiwitten en peptiden mogelijk38. Met behulp van RAC hebben we veranderingen in de oxidatietoestand van maximaal enkele duizenden cysteïneplaatsen in verschillende modelsystemen geïdentificeerd na een verstoring.
Bij muizen die werden blootgesteld aan vermoeiende spiercontracties, werden 2.200 S-glutathionylatieplaatsen geïdentificeerd, waarbij meer dan de helft significant veranderde niveaus van S-glutathionylering had 32. RAC is ook gebruikt om omkeerbare thioloxidatie van >2.100 plaatsen in cyanobacteriën te profileren na blootstelling aan een fotosyntheseremmer of verschillende lichtomstandigheden6. Onlangs hebben we de totale reversibele thioloxidatie en S-glutathionylering van >4.000 cysteïneplaatsen in RAW 264,7 macrofaagcellen onder rustomstandighedengeprofileerd 27. Evenzo kwantificeerden Behring et al. de oxidatie van ~ 4.200 cysteïneplaatsen in A431-cellen na epidermale groeifactorstimulatie39. Deze studies tonen de robuustheid van RAC aan om veel cysteïneplaatsen (ten minste enkele duizenden) te identificeren die omkeerbare thioloxidatie ondergaan. Bovendien kan de fractionering van monsters de dekking van peptiden die uit een experiment zijn hersteld, verbeteren.
Buiten experimentele controles, waarbij positieve of negatieve controlemonsters kunnen worden gebruikt om de biologische reacties van het modelsysteem te bevestigen, kan totale thiolverrijking parallel met oxidatie van thiolen worden uitgevoerd. Dit totaal-thiolmonster biedt zowel stoichiometrische vergelijkingen als een uitgangswaarde van waaruit experimentele of behandelde monsters kunnen worden vergeleken. Kortom, dit totaal-thiolmonster biedt een meting van het totale aantal cysteïnethiolen voor een bepaalde Cys-site in een bepaald monster. Dit concept werd ook overgenomen door de OxiTMT-methode, die monsters genereert die volledig gereduceerde thiolen bevatten die het "totale cysteïnegehalte" vertegenwoordigen voor vergelijking met geoxideerde cysteines40.
In tegenstelling tot OxiTMT wordt RAC niet beperkt door het plex-aantal iodoTMT en kan het dus meer totale thiolkanalen bevatten om het thiolgehalte van meerdere monstertypen die in een onderzoek worden gebruikt, beter weer te geven. Bovendien kan het voorbereiden van een globaal monster (niet onderhevig aan verrijking) parallel aan de thiol redox proteomics-workflow nodig zijn om te controleren of eiwitrijkdom in verschillende monstertypen is veranderd. Aangezien de methode kan worden aangepast aan meerdere soorten redoxwijzigingen, moeten de juiste controles voor de specifieke wijziging van belang worden overwogen. Ultraviolet licht en kwikchloride zijn bijvoorbeeld beide effectief in het splitsen van SNO uit eiwitten, waardoor een effectieve negatieve controle ontstaat voor de meting van SNO 7,25. Een effectieve controle voor het onderzoeken van SSG-gemodificeerde eiwitten is het weglaten van het glutaredoxine-enzym uit de reductiecocktail tijdens de reductiestap. Vanwege de relatief hoge specificiteit van glutaredoxine elimineert het weglaten ervan de reductie van SSG-gemodificeerde eiwitten en voorkomt het dat ze disulfide-uitwisseling ondergaan en uiteindelijk uiteindelijk worden verrijkt36.
Er zijn verschillende stappen binnen de workflow voor RAC die fundamenteel zijn voor het genereren van hoogwaardige, reproduceerbare gegevens. Een van de eerste cruciale stappen, en de belangrijkste, is de alkylering/blokkering van vrije thiolen met behulp van het membraandoorlatende alkyleringsmiddel N-ethylmaleimide (NEM), dat snel reageert over een breed pH-bereikvan 41,42. Deze stap voorkomt dat ontluikende thiolen worden geoxideerd tijdens monsterverwerking en vermindert niet-specifieke verrijking van deze kunstmatig geoxideerde thiolen tijdens disulfide-uitwisselingsverrijking. Onvoldoende alkylering zal resulteren in een verhoogde achtergrond en vals-positief signaal, zoals werd vastgesteld in een eerder rapport6.
Vanwege de hoge reactiviteit en het vermogen om vrije thiolen te blokkeren, moet echter ook voorzichtigheid worden betracht om ervoor te zorgen dat het volledig uit monsters wordt verwijderd voorafgaand aan verrijking, waarbij elke resterende NEM kan binden en interfereren met harskoppeling, wat uiteindelijk resulteert in het verlies van signaal als gevolg van een afname van de eiwitbinding. Dit wordt bereikt door acetonprecipitatie en verschillende rondes van bufferuitwisseling uit te voeren met behulp van moleculaire gewichtsafsnijdingsfilters. Het bewaken en handhaven van de juiste pH gedurende het hele protocol is ook cruciaal. Een pH van 6,0 wordt gehandhaafd om disulfide schuifelen en de vorming van gemengde disulfiden voorafgaand aan verrijking te verminderen. Andere stappen waar extra zorg aan moet worden besteed, zijn de verrijkings- en elutiestappen, waarbij pH-waarden van respectievelijk 7,7 en 8,0 nodig zijn voor een goede verrijking en elutie. Foutieve pH-waarden tijdens deze stappen zullen resulteren in een afname of verlies van signaal.
Tot op heden zijn er veel op chemie gebaseerde methoden naast RAC die veel worden gebruikt voor het bestuderen van cysteïne thiol oxidatie, waaronder de meest gebruikte methode, de biotine switch techniek 43,44. Een ding dat al deze methoden gemeen hebben, inclusief RAC, is dat ze gebaseerd zijn op indirecte methoden voor de detectie van geoxideerde cysteines. Ze vertrouwen op chemisch gemodificeerde tussenproducten van de oorspronkelijke geoxideerde thiol voor detectie. Een belangrijk kenmerk dat RAC onderscheidt van andere methoden is echter de mogelijkheid om multiplexed, kwantitatieve gegevens te verzamelen over specifieke cysteïneplaatsen van geoxideerde thiolen.
De methode wordt uitgevoerd met eiwitten/peptiden die covalent gebonden zijn aan de hars, waardoor verdere stappen (bijv. reductie, etikettering, wassen, spijsvertering) kunnen worden uitgevoerd zonder verdere behandeling. Door LC-MS/MS uit te voeren op gemultiplexte monsters, worden datasets gegenereerd die proteoombrede ontdekkingen mogelijk maken. De effecten van een specifieke behandeling of stimuli over meerdere steekproefgroepen worden op mondiaal niveau waargenomen, wat de ontdekking van nieuwe mechanismen en paden mogelijk maakt. De fundamentele workflow is in hoge mate aanpasbaar aan de specifieke behoeften en interessegebieden van de eindgebruikers. Orthogonale validatie van bevindingen waargenomen in massaspectrometriegegevens blijft een uitdaging. Site-gerichte mutagenese van een specifieke site en het gebruik van assays die de daaruit voortvloeiende effecten onderzoeken, is een veel voorkomende maar arbeidsintensieve aanpak.
Om kandidaat-sites te screenen die biologisch significant kunnen zijn, kunnen bioinformaticastudies worden gebruikt om meer te weten te komen over de kenmerken van een site met een hoge mate van oxidatie, zoals de nabijheid van een site tot een actieve site of secundaire structuur27. Moleculaire dynamicasimulaties kunnen van grote waarde blijken te zijn in toekomstige studies, omdat ze de effecten van redoxmodificaties op de eiwitstructuur kunnen modelleren en inzicht kunnen geven in hoe de functie van een eiwit kan worden beïnvloed13,45. Door deze robuuste strategie te implementeren, hopen we dat de wetenschappelijke gemeenschap zal profiteren door deze methode aan te passen aan hun eigen unieke modelsysteem en de huidige kennis van redoxbiologie uit te breiden naar veel verschillende modellen en biologische systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten, financieel of anderszins.
Acknowledgments
Delen van het werk werden ondersteund door NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 en U24 DK112349
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride | Med Chem Express | HY-101794 | Reagent for in-house resin synthesis |
| 2.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 22431048 | |
| 5.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 30108310 | |
| 5.0 mL round bottom tubes | Falcon | 352054 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Activated Thiol–Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Potential replacement for thiol-affinity resin |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Bicinchonicic acid (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Protein Assay Reagent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Homogenizer | BioSpec Products | 985370 | |
| Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reagent for in-house resin synthesis |
| QIAvac 24 Plus vacuum manifold | Qiagen | 19413 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
| Spin columns | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E reverse phase columns | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Peptide desalting |
| Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
| Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details). |
| TMT isobaric labels (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Peptide labeling reagent; available in multiple formats |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin | Promega | V5820 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | vacuum concentrator |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
- Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular signaling. Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).
- Olson, K. R. The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824 (2021).
- Sies, H. Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis. Redox Biology. 41, 101867 (2021).
- Poole, L. B. The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry. Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).
- Guo, J., et al. Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).
- Shi, X., Qiu, H. Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress. Antioxidants. 9 (11), 1051 (2020).
- Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. Cysteines as redox molecular switches and targets of disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167 (2017).
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B.
- Go, Y. M., Jones, D. P.
- Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. Cysteine reactivity across the subcellular universe. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).
- Skryhan, K., et al. The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1. PLoS One. 10 (9), 0136997 (2015).
- Su, Z., et al. Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt. Nature Communications. 10 (1), 5486 (2019).
- Liebthal, M., Schuetze, J., Dreyer, A., Mock, H. -P., Dietz, K. -J. Redox conformation-specific protein-protein interactions of the 2-cysteine peroxiredoxin in Arabidopsis. Antioxidants. 9 (6), 515 (2020).
- Pace, N. J., Weerapana, E. Zinc-binding cysteines: diverse functions and structural motifs. Biomolecules. 4 (2), 419-434 (2014).
- Schwartz, P. A., et al. Covalent EGFR inhibitor analysis reveals importance of reversible interactions to potency and mechanisms of drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 173 (2014).
- Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms. Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).
- Topf, U., et al. Quantitative proteomics identifies redox switches for global translation modulation by mitochondrially produced reactive oxygen species. Nature Communications. 9 (1), 324 (2018).
- Gao, X. -H., et al. Discovery of a redox thiol switch: implications for cellular energy metabolism. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (5), 852-870 (2020).
- Prus, G., Hoegl, A., Weinert, B. T., Choudhary, C. Analysis and interpretation of protein post-translational modification site stoichiometry. Trends in Biochemical Sciences. 44 (11), 943-960 (2019).
- Zhang, T., Gaffrey, M. J., Li, X., Qian, W. J. Characterization of cellular oxidative stress response by stoichiometric redox proteomics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (2), 182-194 (2021).
- Jaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nature Cell Biology. 3 (2), 193-197 (2001).
- Alcock, L. J., Perkins, M. V., Chalker, J. M. Chemical methods for mapping cysteine oxidation. Chemical Society Reviews. 47 (1), 231-268 (2018).
- Li, R., Kast, J. Biotin switch assays for quantitation of reversible cysteine oxidation. Methods in Enzymology. 585, 269-284 (2017).
- Guo, J., et al. Resin-assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
- Liu, T., et al. High-throughput comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology. Analytical Chemistry. 76 (18), 5345-5353 (2004).
- Duan, J., et al. Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations. Redox Biology. 36, 101649 (2020).
- Mitchell, A. R., et al. Redox regulation of pyruvate kinase M2 by cysteine oxidation and S-nitrosation. Biochemical Journal. 475 (20), 3275-3291 (2018).
- Campbell, M. D., et al. Improving mitochondrial function with SS-31 reverses age-related redox stress and improves exercise tolerance in aged mice. Free Radical Biology & Medicine. 134, 268-281 (2019).
- Duan, J., et al. Quantitative profiling of protein S-glutathionylation reveals redox-dependent regulation of macrophage function during nanoparticle-induced oxidative stress. ACS Nano. 10 (1), 524-538 (2016).
- Wang, J., et al. Protein thiol oxidation in the rat lung following e-cigarette exposure. Redox Biology. 37, 101758 (2020).
- Kramer, P. A., et al. Fatiguing contractions increase protein S-glutathionylation occupancy in mouse skeletal muscle. Redox Biology. 17, 367-376 (2018).
- Chiao, Y. A., et al. Late-life restoration of mitochondrial function reverses cardiac dysfunction in old mice. Elife. 9, 55513 (2020).
- Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
- Su, D., et al. Quantitative site-specific reactivity profiling of S-nitrosylation in mouse skeletal muscle using cysteinyl peptide enrichment coupled with mass spectrometry. Free Radical Biology & Medicine. 57, 68-78 (2013).
- Su, D., et al. Proteomic identification and quantification of S-glutathionylation in mouse macrophages using resin-assisted enrichment and isobaric labeling. Free Radical Biology & Medicine. 67, 460-470 (2014).
- Searle, B. C., Yergey, A. L. An efficient solution for resolving iTRAQ and TMT channel cross-talk. Journal of Mass Spectrometry. 55 (8), 4354 (2020).
- Duan, J., Gaffrey, M. J., Qian, W. J. Quantitative proteomic characterization of redox-dependent post-translational modifications on protein cysteines. Molecular BioSystems. 13 (5), 816-829 (2017).
- Behring, J. B., et al. Spatial and temporal alterations in protein structure by EGF regulate cryptic cysteine oxidation. Science Signaling. 13 (615), 7315 (2020).
- Shakir, S., Vinh, J., Chiappetta, G. Quantitative analysis of the cysteine redoxome by iodoacetyl tandem mass tags. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (15), 3821-3830 (2017).
- Gorin, G., Martic, P. A., Doughty, G. Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners. Archives of Biochemistry and Biophysics. 115 (3), 593-597 (1966).
- Hsu, M. -F., et al. Distinct effects of N-ethylmaleimide on formyl peptide- and cyclopiazonic acid-induced Ca2+ signals through thiol modification in neutrophils. Biochemical Pharmacology. 70 (9), 1320-1329 (2005).
- Li, R., Huang, J., Kast, J. Identification of total reversible cysteine oxidation in an atherosclerosis model using a modified biotin switch assay. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2026-2035 (2015).
- Wang, J., et al. Integrated dissection of cysteine oxidative post-translational modification proteome during cardiac hypertrophy. Journal of Proteome Research. 17 (12), 4243-4257 (2018).
- Patra, K. K., Bhattacharya, A., Bhattacharya, S. Molecular dynamics investigation of a redox switch in the anti-HIV protein SAMHD1. Proteins. 87 (9), 748-759 (2019).
