Bestemmelse av mitokondrie respirasjon og glykolyse i Ex Vivo retinal vevsprøver

Summary

Beskrevet her er en detaljert protokoll for å utføre mitokondrie stressanalyse og glykolytisk hastighetsanalyse i ex vivo retinal vevsprøver ved hjelp av en kommersiell bioanalyse.

Abstract

Mitokondrie respirasjon er en kritisk energigenererende vei i alle celler, spesielt retinal fotoreseptorer som har en svært aktiv metabolisme. I tillegg viser fotoreseptorer også høy aerob glykolyse som kreftceller. Presise målinger av disse metabolske aktivitetene kan gi verdifull innsikt i cellulær homeostase under fysiologiske tilstander og i sykdomstilstander. Mikroplatebaserte analyser med høy gjennomstrømning er utviklet for å måle mitokondrie-respirasjon og ulike metabolske aktiviteter i levende celler. Imidlertid er et stort flertall av disse utviklet for dyrkede celler og har ikke blitt optimalisert for intakte vevsprøver og for anvendelse ex vivo. Beskrevet her er en detaljert trinnvis protokoll, ved hjelp av mikroplatebasert fluorescensteknologi, for å måle oksygenforbrukshastigheten (OCR) direkte som en indikator på mitokondrie respirasjon, samt ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) som en indikator på glykolyse, i intakt eks vivo retinal vev. Denne metoden har blitt brukt til å vurdere metabolske aktiviteter i voksen mus netthinne og demonstrere sin anvendelse i å undersøke cellulære mekanismer for aldring og sykdom.

Introduction

Mitokondrier er essensielle organeller som regulerer cellulær metabolisme, signalering, homeostase og apoptose ved å koordinere flere viktige fysiologiske ^prosesser1. Mitokondrier fungerer som kraftstasjonen i cellen for å generere adenosintrifosfat (ATP) gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS) og gi energi som støtter nesten alle cellulære hendelser. Mesteparten av cellulær oksygen metaboliseres i mitokondrier, hvor det fungerer som den endelige elektron akseptoren i elektrontransportkjeden (ETC) under aerob åndedrett. Lave mengder ATP kan også produseres fra glykolyse i cytosolen, hvor glukose omdannes til pyruvat, som kan omdannes ytterligere til laktat eller transporteres til mitokondrier og oksideres til acetyl-CoA, et substrat i trikarboksylsyresyklusen (TCA-syklus).

Netthinnen er et av de mest metabolsk aktive vevene hos ^pattedyr2, og viser høye nivåer av mitokondrie respirasjon og ekstremt høyt ^{oksygenforbruk3}. Stangen og kjeglefotoreseptorene inneholder en høy tetthet av mitokondrier4, og OXPHOS genererer de fleste ATP i netthinnen5. I tillegg er netthinnen også avhengig av aerob glykolyse6,7 ved å konvertere glukose til laktat5. Mitokondriefeil er forbundet med ulike nevrodegenerative ^sykdommer8,9; og med sine unike høye energibehov er netthinnen spesielt sårbar for metabolske defekter, inkludert de som påvirker mitokondrie ^OXPHOS4 og glykolyse10. Mitokondrie dysfunksjon og defekter i glykolyse er involvert i ^retinal11,12 og ^macular13 degenerative sykdommer, aldersrelatert makuladegenerasjon10,14,15,16, og diabetisk retinopati17,18. Derfor kan nøyaktige målinger av mitokondrie respirasjon og glykolyse gi viktige parametere for å vurdere integriteten og helsen til netthinnen.

Mitokondrie respirasjon kan måles gjennom bestemmelse av oksygenforbruk (OCR). Gitt at konvertering av glukose til pyruvat og deretter å laktere resulterer i ekstrudering av protoner til og forsuring av det ekstracellulære miljøet, gir målinger av den ekstracellulære forsuringsraten (ECAR) en indikasjon på glykolysefluks. Siden netthinnen består av flere celletyper med intime relasjoner og aktiv synergi, inkludert utveksling av substrater6, er det viktig å analysere mitokondriefunksjon og metabolisme i sammenheng med hele netthinnevev med intakt laminering og kretser. De siste tiårene har Clark type _{O2-elektroder} og andre oksygenmikroelektroder blitt brukt til å måle oksygenforbruket i netthinnen19,20,21. Disse oksygenelektrodene har store begrensninger i følsomhet, krav til et stort prøvevolum og behovet for kontinuerlig omrøring av suspendert prøve, noe som vanligvis fører til forstyrrelse av cellulær og vevskontekst. Protokollen beskrevet her ble utviklet ved hjelp av en mikroplatebasert fluorescensteknikk for å måle mitokondrieenergimetabolisme i ny dissekert ex vivo mus netthinnevev. Det tillater mid-throughput sanntidsmålinger av både OCR og ECAR samtidig ved hjelp av en liten prøve (1 mm punch) av ex vivo retinal vev samtidig unngå behovet for suspensjon og kontinuerlig omrøring.

Demonstrert her er den eksperimentelle prosedyren for mitokondrie stressanalyse og glykolytisk hastighetsanalyse på ny dissekerte retinal punch disker. Denne protokollen tillater måling av mitokondrier-relaterte metabolske aktiviteter i en ex vivo vev kontekst. Forskjellig fra analysene som utføres ved hjelp av dyrkede celler, gjenspeiler målingene som er oppnådd her kombinert energimetabolisme på vevsnivå og påvirkes av interaksjoner mellom de forskjellige celletypene i vevet. Protokollen er modifisert fra en tidligere publisert ^versjon22,23 for å tilpasse seg den nye generasjonen av Agilent Seahorse ekstracellulær flux 24-brønner (XFe24) analysator med Islet Capture plate. Analysemediet, konsentrasjonene av injeksjonsforbindelser og antall/varighet av analysesykluser er også optimalisert for netthinnevev. En detaljert trinnvis protokoll er gitt for fremstilling av retinal punch-disker. Mer informasjon om programoppsett og dataanalyse kan fås fra produsentens brukerhåndbok24,25,26.

Protocol

Alle museprotokoller ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen ved National Eye Institute (NEI ASP# 650). Mus ble plassert i 12 timer lyse mørke forhold og brydde seg om ved å følge anbefalingene fra Guide for care and use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources og Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals. 1. Fuktighetsgivende sensorpatron og tilberedning av analysemediet Dagen før eksperimentet legger du til 1 ml av kali…

Representative Results

Dataene som rapporteres her er representativ mitokondriestressanalyse som viser OCR-spor (figur 1) og glykolytisk hastighetsanalyse som viser OCR-spor og ECAR-spor (figur 2), som ble utført ved hjelp av ny dissekerte 1 mm retinal punch disker fra 4 måneder gamle transgene Nrl-L-EGFP mus36 (C57B / L6 bakgrunn). Disse musene uttrykker GFP spesielt i stang fotoreseptorer uten å endre normal retinal utvikling, histologi og fysiolo…

Discussion

Her er detaljerte instruksjoner for å utføre mikroplatebaserte analyser av mitokondrie-respirasjon og glykolyseaktivitet ved hjelp av ex vivo, ny dissekerte retinal punch disker. Protokollen er optimalisert for å: 1) sikre bruk av et egnet analysemedium for ex vivo retinal vev; 2) bruke riktig størrelse på retinal punch disker for å oppnå OCR og ECAR avlesninger som faller innenfor maskinens optimale detekteringsområde; 3) belegg mesh innsatser for å forbedre klebeevnen av retinal punch for sta…

Materials

1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution	Sigma	D6134	Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle	BD Precision Glide	305106
Antimycin A, 10 mM stock solution	Sigma	A8674	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution	TimTec	ST056388	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	Curved tip
Dissection microscope
DMSO	Sigma	D2438
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10	Curved, Serrated tip
Microscissors	Fine Science Tools	15004-08	Curved tip
NaOH solution, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution	Sigma	R8875	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate	Agilent	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine	Agilent	103579-100
Seahorse XF DMEM medium	Agilent	103575-100	pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak	Agilent	103518-100	Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer	Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M	Sigma-Aldrich	S5761	Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush	Ted Pella	113