Détermination de la respiration mitochondriale et de la glycolyse dans des échantillons de tissu rétinien ex vivo

Summary

Décrit ici est un protocole détaillé pour effectuer un test de stress mitochondrial et un test de taux glycolytique dans des échantillons de tissu rétinien ex vivo à l’aide d’un bioanalyseur commercial.

Abstract

La respiration mitochondriale est une voie essentielle génératrice d’énergie dans toutes les cellules, en particulier les photorécepteurs rétiniens qui possèdent un métabolisme très actif. En outre, les photorécepteurs présentent également une glycolyse aérobie élevée comme les cellules cancéreuses. Des mesures précises de ces activités métaboliques peuvent fournir des informations précieuses sur l’homéostasie cellulaire dans des conditions physiologiques et dans des états pathologiques. Des tests à base de microplaques à haut débit ont été développés pour mesurer la respiration mitochondriale et diverses activités métaboliques dans les cellules vivantes. Cependant, une grande majorité d’entre eux sont développés pour des cellules cultivées et n’ont pas été optimisés pour des échantillons de tissus intacts et pour une application ex vivo. Décrit ici est un protocole détaillé étape par étape, utilisant la technologie de fluorescence à base de microplaques, pour mesurer directement le taux de consommation d’oxygène (OCR) comme indicateur de la respiration mitochondriale, ainsi que le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) comme indicateur de glycolyse, dans le tissu rétinien ex vivo intact. Cette méthode a été utilisée pour évaluer avec succès les activités métaboliques dans la rétine de souris adulte et démontrer son application dans l’étude des mécanismes cellulaires du vieillissement et de la maladie.

Introduction

Les mitochondries sont des organites essentiels qui régulent le métabolisme cellulaire, la signalisation, l’homéostasie et l’apoptose en coordonnant plusieurs processus physiologiques ^cruciaux1. Les mitochondries servent de centrale électrique dans la cellule pour générer de l’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative (OXPHOS) et fournir de l’énergie qui soutient presque tous les événements cellulaires. La majorité de l’oxygène cellulaire est métabolisée dans les mitochondries, où il sert d’accepteur final d’électrons dans la chaîne de transport d’électrons (ETC) pendant la respiration aérobie. De faibles quantités d’ATP peuvent également être produites à partir de la glycolyse dans le cytosol, où le glucose est converti en pyruvate, qui peut être converti en lactate ou être transporté dans les mitochondries et oxydé en acétyl-CoA, un substrat du cycle de l’acide tricarboxylique (cycle TCA).

La rétine est l’un des tissus les plus métaboliquement actifs chez les ^mammifères2, présentant des niveaux élevés de respiration mitochondriale et une consommation d’oxygène extrêmement ^élevée3. Les photorécepteurs des bâtonnets et des cônes contiennent une densité élevée de mitochondries4, et OXPHOS génère la plupart de l’ATP dans la ^rétine5. De plus, la rétine repose aussi fortement sur la glycolyse ^aérobie6,7 en convertissant le glucose en ^lactate5. Les défauts mitochondriaux sont associés à diverses maladies neurodégénératives8,9; et avec ses demandes énergétiques élevées uniques, la rétine est particulièrement vulnérable aux défauts métaboliques, y compris ceux affectant ^OXPHOS4 mitochondrial et la glycolyse10. Le dysfonctionnement mitochondrial et les défauts de glycolyse sont impliqués dans les maladies dégénératives rétiniennes11,12 et ^maculaires13, la dégénérescence maculaire liée à l’âge10,14,15,16 et la rétinopathie ^{diabétique17,18}. Par conséquent, des mesures précises de la respiration mitochondriale et de la glycolyse peuvent fournir des paramètres importants pour évaluer l’intégrité et la santé de la rétine.

La respiration mitochondriale peut être mesurée par la détermination du taux de consommation d’oxygène (OCR). Étant donné que la conversion du glucose en pyruvate et par la suite en lactate entraîne l’extrusion de protons et l’acidification de l’environnement extracellulaire, les mesures du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) fournissent une indication du flux de glycolyse. Comme la rétine est composée de plusieurs types de cellules avec des relations intimes et une synergie active, y compris l’échange de ^substrats6, il est impératif d’analyser la fonction mitochondriale et le métabolisme dans le contexte de tissu rétinien entier avec une lamination et des circuits intacts. Au cours des dernières décennies, les électrodes _O2 de type Clark et d’autres microélectrodes d’oxygène ont été utilisées pour mesurer la consommation d’oxygène dans la rétine19,20,21. Ces électrodes d’oxygène ont des limites majeures en termes de sensibilité, l’exigence d’un grand volume d’échantillon et la nécessité d’une agitation continue de l’échantillon en suspension, ce qui entraîne généralement la perturbation du contexte cellulaire et tissulaire. Le protocole décrit ici a été développé à l’aide d’une technique de fluorescence à base de microplaques pour mesurer le métabolisme énergétique mitochondrial dans le tissu rétinien ex vivo de souris fraîchement disséqué. Il permet des mesures en temps réel à mi-débit de l’OCR et de l’ECAR simultanément à l’aide d’un petit échantillon (poinçon de 1 mm) de tissu rétinien ex vivo tout en évitant le besoin de suspension et d’agitation continue.

Démontrée ici est la procédure expérimentale pour le test de stress mitochondrial et le test de taux glycolytique sur des disques de perforation rétiniens fraîchement disséqués. Ce protocole permet de mesurer les activités métaboliques liées aux mitochondries dans un contexte tissulaire ex vivo. Contrairement aux essais effectués à l’aide de cellules cultivées, les lectures obtenues ici reflètent le métabolisme énergétique combiné au niveau tissulaire et sont influencées par les interactions entre les différents types de cellules dans le tissu. Le protocole est modifié par rapport à une version précédemment ^{publiée22,23} pour s’adapter à la nouvelle génération de l’analyseur de flux extracellulaire Agilent Seahorse 24-wells (XFe24) avec plaque Islet Capture. Le milieu d’essai, les concentrations de composés d’injection et le nombre/la durée des cycles d’essai ont également été optimisés pour le tissu rétinien. Un protocole détaillé étape par étape est donné pour la préparation des disques de poinçonnage rétiniens. Plus d’informations sur la configuration du programme et l’analyse des données peuvent être obtenues à partir du guide de l’utilisateur du fabricant24,25,26.

Protocol

Tous les protocoles de souris ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux du National Eye Institute (NEI ASP# 650). Les souris ont été logées dans des conditions claires-sombres de 12 heures et soignées en suivant les recommandations du Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire, de l’Institut des ressources des animaux de laboratoire et de la Politique du service de santé publique sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire….

Representative Results

Les données rapportées ici sont un test de stress mitochondrial représentatif montrant une trace OCR (Figure 1) et un test de taux glycolytique montrant une trace OCR et une trace ECAR (Figure 2), qui ont été effectués à l’aide de disques de perforation rétiniens de 1 mm fraîchement disséqués de souris Nrl-L-EGFP transgéniques de 4 mois36 (fond C57B / L6). Ces souris expriment la GFP spécifiquement dans les photor?…

Discussion

Vous trouverez ici des instructions détaillées pour effectuer des tests sur microplaques de la respiration mitochondriale et de l’activité de glycolyse à l’aide de disques de perforation rétiniens ex vivo fraîchement disséqués. Le protocole a été optimisé pour : 1) assurer l’utilisation d’un milieu d’essai approprié pour le tissu rétinien ex vivo; 2) utiliser la taille appropriée des disques de poinçonnage rétiniens pour obtenir des lectures OCR et ECAR qui se situent dans la p…

Materials

1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution	Sigma	D6134	Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle	BD Precision Glide	305106
Antimycin A, 10 mM stock solution	Sigma	A8674	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution	TimTec	ST056388	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	Curved tip
Dissection microscope
DMSO	Sigma	D2438
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10	Curved, Serrated tip
Microscissors	Fine Science Tools	15004-08	Curved tip
NaOH solution, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution	Sigma	R8875	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate	Agilent	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine	Agilent	103579-100
Seahorse XF DMEM medium	Agilent	103575-100	pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak	Agilent	103518-100	Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer	Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M	Sigma-Aldrich	S5761	Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush	Ted Pella	113